李會(huì)婷，吳 妍，張哲弢，史天陸

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院藥劑科，合肥 230001)

萬古霉素為糖肽類抗菌藥物，用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、腸球菌及耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌等革蘭陽性菌感染。美國感染病學(xué)會(huì)發(fā)布的有關(guān)MRSA感染治療指南[1]和《萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識(2011版)》[2]指出，萬古霉素治療金黃色葡萄球菌感染成敗與其血藥谷濃度高低有關(guān)，同時(shí)不良反應(yīng)(尤其是腎毒性)的發(fā)生與其血藥濃度過高有關(guān)。2020年美國萬古霉素治療嚴(yán)重MRSA感染的治療藥物監(jiān)測指南[3]和《中國萬古霉素治療藥物監(jiān)測指南(2020更新版)》[4]推薦，對于重癥監(jiān)護(hù)病房患者、肥胖患者、燒傷患者、應(yīng)用腎損害藥物患者及腎功能不全患者、新生兒/兒童患者、接受腎臟替代治療等患者，應(yīng)進(jìn)行萬古霉素監(jiān)測。目前，萬古霉素的治療藥物監(jiān)測方法包括熒光偏振免疫分析法、微生物法等[5]。但高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)仍是使用最普遍的方法[6-7]。其較為經(jīng)濟(jì)，但步驟繁瑣，結(jié)果影響因素較多，而國內(nèi)沒有配備定值質(zhì)控品，對于萬古霉素室內(nèi)質(zhì)控研究較少且不夠完整。因此，本研究在已有實(shí)驗(yàn)室條件下，對 HPLC法測定萬古霉素血藥濃度的室內(nèi)質(zhì)量控制評價(jià)體系進(jìn)行了相關(guān)探索。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010A型高效液相色譜儀(紫外檢測器，LabSolutions Version 5.51 色譜工作站，日本島津公司)；MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；SB-5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TGL-16B型高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑

萬古霉素對照品(批號：130360-201302)，去甲萬古霉素(批號：130338-201704，含量87.7%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(HPLC級，西隴科學(xué)股份有限公司)；水為超純水；健康人空白血清由我院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸二氫鉀-甲醇(V∶V=87∶ 13)；檢測波長：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 萬古霉素工作液的配制

精密稱取萬古霉素適量至5 mL容量瓶中，以超純水稀釋至刻度得到1 mg/mL萬古霉素儲備液。取適量注射用水，依次將儲備液稀釋為25、50、100、250和500 μg/mL系列濃度的萬古霉素工作液，于4 ℃冰箱備用。

2.3 去甲萬古霉素工作液的配制

精密稱取去甲萬古霉素5 mg至25 mL容量瓶中，以注射用水稀釋至刻度，溶解后得到200 μg/mL去甲萬古霉素內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 自制血漿質(zhì)控品的制備

參考文獻(xiàn)[8]，取健康人血清90 μL，分別加入25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL和1 mg/mL萬古霉素工作液10 μL，得到新鮮配制的自制質(zhì)控品，質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、25、50和100 μg/mL。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性考察：按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，去甲萬古霉素、萬古霉素保留時(shí)間分別12.793 、17.707 min，與血清內(nèi)其他成分分離良好，空白血清無干擾，見圖1。

A.空白血清樣品；B.血清+內(nèi)標(biāo)+萬古霉素；1.去甲萬古霉素內(nèi)標(biāo)；2.萬古霉素A.blank serum; B.serum+internal standard+vancomycin; 1.norvancomycin; 2.vancomycin

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限的建立：取“2.4”項(xiàng)下各質(zhì)量濃度的自制血漿質(zhì)控品，分別加入去甲萬古霉素20 μL，混勻30 s后加入10%高氯酸溶液100 μL，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min(離心半徑6 cm)，取上清液80 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并測定。以萬古霉素濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，以萬古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，Y=0.059 4X-0.082 4，r=0.999 8，結(jié)果表明，萬古霉素血清質(zhì)量濃度在2.5～100 μg/mL線性良好，血清中最低定量限為0.5 μg/mL。

2.5.3 精密度及回收率測定：取新鮮配制的高、中、低濃度質(zhì)控品(質(zhì)量濃度分別為50、25、10 μg/mL)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度平行操作6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間精密度。同時(shí)，取新鮮配制的高、中、低濃度質(zhì)控品，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，萬古霉素色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積比值代入相對應(yīng)的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中，每個(gè)濃度平行操作6次，計(jì)算日內(nèi)回收率；連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間回收率。結(jié)果均滿足《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)[9]中生物樣品檢測的要求，見表1。

表1 萬古霉素血藥濃度監(jiān)測室內(nèi)質(zhì)控精密度和回收率結(jié)果(n=6)

2.5.5 繪制Z-分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖：由于選擇了3個(gè)質(zhì)控濃度，為了多水平、更直觀準(zhǔn)確地進(jìn)行質(zhì)量控制，在Levey-Jennings質(zhì)控圖基礎(chǔ)上，將低、中、高濃度質(zhì)控樣品轉(zhuǎn)換成Z-分?jǐn)?shù)形式，繪制在單張質(zhì)控圖進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)換公式為，Z=(x-xmat)/s，x為質(zhì)控品測定值，xmat為同一水平質(zhì)控品測定值的平均值，s為該質(zhì)控品的標(biāo)準(zhǔn)差[10]。運(yùn)用Excel軟件繪制Z分?jǐn)?shù)圖(見圖2)，結(jié)合Westgard 12 s/13 s/22 s/R4 s/41 s/10x多規(guī)則質(zhì)控原則，當(dāng)出現(xiàn)1次2<|Z|<3時(shí)，違反12 s規(guī)則，提出警告1次，當(dāng)出現(xiàn)1次|Z|>3時(shí)，違反13 s規(guī)則，提出失控1次；當(dāng)連續(xù)2次出現(xiàn)2<|Z|<3時(shí)，違反22 s規(guī)則，或連續(xù)2次Z之間差值>4，違反R4 s規(guī)則，提示失控；連續(xù)4次|Z|>1，違反41 s規(guī)則，或連續(xù)10次|Z|>0，違反10x規(guī)則，均提示失控。結(jié)果顯示，高濃度質(zhì)控品第22次、第23次2次Z差值為4.08，違反R4 s規(guī)則，提示失控1次，經(jīng)分析考慮為隨機(jī)誤差所致。查找原因發(fā)現(xiàn)為操作人員不同所致，后調(diào)整操作人員重新操作測定后未有誤差出現(xiàn)。

A.高濃度質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖；B.中濃度質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖；C.低濃度質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖；D.高、中、低濃度質(zhì)控品Z-分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖A. Levey-Jennings chart of high concentration quality control samples; B. Levey-Jennings chart of medium concentration quality control samples; C. Levey-Jennings chart of low concentration quality control samples; D. Z-score charts of high, medium and low concentration quality control samples

2.6 萬古霉素血藥濃度監(jiān)測數(shù)據(jù)

2020年6—8月測定萬古霉素39例次，共29例患者，其中6例患者測定2次，1例患者測定5次。首次總體監(jiān)測結(jié)果顯示，僅41.38%的萬古霉素血藥谷濃度在正常范圍內(nèi)，低于正常范圍的有9例，高于正常范圍的有8例；萬古霉素血藥谷濃度監(jiān)測≥2次的7例患者中，4例經(jīng)劑量調(diào)整后，萬古霉素血藥谷濃度恢復(fù)至正常范圍；萬古霉素治療期間，共2例患者發(fā)生腎損傷，其萬古霉素質(zhì)量濃度均>20 μg/mL，見表2。

表2 萬古霉素血藥谷濃度總體監(jiān)測和首次監(jiān)測濃度分布及腎損傷發(fā)生情況

3 討論

萬古霉素是治療MRSA感染的主要藥物之一，但其治療指數(shù)窄，個(gè)體差異較大[11-12]。若血藥濃度過低，達(dá)不到治療效果，易產(chǎn)生耐藥；血藥濃度過高，則易引起不良反應(yīng)(如腎毒性、耳毒性等)，因此，根據(jù)萬古霉素血藥濃度監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化用藥方案的調(diào)整，保證患者達(dá)到安全、有效的治療效果尤為重要[13-14]。而治療藥物監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性是臨床制定和調(diào)整個(gè)體化給藥方案的重要影響因素之一，質(zhì)控方法的建立在一定程度上可以保證樣品測定的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，因此，建立一套完整的質(zhì)控體系以保證監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性是非常重要的。

自制萬古霉素質(zhì)控血清制備方法簡單、成本低廉，其可行性已有文獻(xiàn)報(bào)道[8]。繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖是實(shí)驗(yàn)室常用于判斷質(zhì)控樣本合格與否的方法，其通過上下警戒線、失控線來對質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行簡單判定，但只對隨機(jī)誤差敏感，且只能顯示單個(gè)濃度測定的精密度。而Z-分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖可用于多水平的質(zhì)控物，全面反映多個(gè)濃度的質(zhì)控結(jié)果[15]。Westgard多規(guī)則質(zhì)控規(guī)則中的13 s規(guī)則和R4 s規(guī)則可及時(shí)發(fā)現(xiàn)隨機(jī)誤差，22 s規(guī)則、41 s規(guī)則和10x規(guī)則可及時(shí)發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差，Westgard多規(guī)則質(zhì)控規(guī)則與Levey-Jennings質(zhì)控圖和Z分?jǐn)?shù)質(zhì)控圖聯(lián)合，不僅可以更為準(zhǔn)確地判定測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以在發(fā)生失控時(shí)，確定失控類型，為失控原因的確定提供幫助[16-18]。

通過本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)性質(zhì)控評價(jià)發(fā)現(xiàn)，本批次自制萬古霉素質(zhì)控血清共發(fā)生警告4次，失控1次，失控發(fā)生于高濃度質(zhì)控品，第22次、第23次2次Z差值為4.08，違反R4 s規(guī)則。當(dāng)發(fā)生失控時(shí)，及時(shí)查明原因，排除誤差，分析可能存在的影響因素并及時(shí)糾正，以保證血藥濃度檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性是十分必要的。因此，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)詳細(xì)記錄試劑批號、操作人員、定標(biāo)日期、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、冰箱溫度、測定中的異?，F(xiàn)象、儀器的校正及故障等信息，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)造成誤差的原因。根據(jù)我院實(shí)驗(yàn)室情況，分析產(chǎn)生隨機(jī)誤差的原因主要為環(huán)境溫度改變、操作人員不同等；產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的原因主要為試劑的“瓶底效應(yīng)”、移液槍的校正等[19-20]。

目前，國內(nèi)外指南推薦成人萬古霉素有效谷濃度為10～20 μg/mL，新生兒/兒童患者萬古霉素谷濃度維持在5～15 mg/L[21]。指導(dǎo)劑量調(diào)整最關(guān)鍵和實(shí)用的為萬古霉素血藥谷濃度[22]。按照常規(guī)劑量(15 mg/L，每12 h給藥1次)給藥時(shí)，其導(dǎo)致腎功能損害的發(fā)生率為1%～5%[2,23]。本研究初步統(tǒng)計(jì)了2020年6—8月29例患者萬古霉素血藥濃度測定結(jié)果，結(jié)果顯示，僅有41.38%的患者萬古霉素血藥濃度在正常范圍內(nèi)，與文獻(xiàn)中的達(dá)標(biāo)率基本一致[24]。多次進(jìn)行萬古霉素血藥谷濃度監(jiān)測的7例患者中，4例通過調(diào)整用藥方案再次監(jiān)測血藥濃度恢復(fù)至正常范圍，腎損傷發(fā)生率為6.90%，略高于文獻(xiàn)報(bào)道[2，23]。分析原因，首先，本研究分析例數(shù)偏少；其次，我院萬古霉素監(jiān)測人群均為老年人及危重癥患者，該人群臟器功能差，聯(lián)合用藥較多，發(fā)生腎損傷患者的萬古霉素血藥濃度均>20 μg/mL，可知腎毒性的發(fā)生與血藥濃度過高有著密切聯(lián)系[25-26]。

本研究較為全面地建立了HPLC法測定萬古霉素血藥濃度的質(zhì)控評價(jià)方法，應(yīng)用Levey-Jennings質(zhì)控圖聯(lián)合Westgard多規(guī)則理論進(jìn)行質(zhì)控評估，能夠提高誤差的檢測靈敏度并提示誤差的性質(zhì)，以便發(fā)現(xiàn)各種測定誤差并及時(shí)糾正，保證血藥濃度測定的準(zhǔn)確性，為臨床制定合理的個(gè)體化給藥方案提供準(zhǔn)確參考。