董金葉，孫 月，秦 紅，朱 琳，鞠 葉#

(1.青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院耳鼻喉科，山東 青島 266000； 2.中國人民解放軍海軍第九七一醫(yī)院耳鼻咽喉科，山東 青島 266071)

變應(yīng)性鼻炎(anaphylactic rhinitis，AR)為全世界常見的鼻腔疾病，指發(fā)生在鼻黏膜的由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，以鼻癢、打噴嚏及鼻黏膜腫脹為主要表現(xiàn)，為臨床常見病和多發(fā)病[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，隨著生活環(huán)境破壞、污染加重等，AR的發(fā)病率呈逐年升高趨勢[2]。AR會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，導(dǎo)致情緒障礙及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等，但目前關(guān)于AR的治療只能緩解其癥狀，因此，積極探索更有效的治療方案和藥物是首要任務(wù)。槲皮苷屬于天然黃酮苷化合物，目前研究結(jié)果顯示其具有廣泛的治療效果，不僅在抗心腦血管疾病[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]及調(diào)節(jié)血脂[6]等方面具有良好的藥理活性，而且具有抗過敏[7]、抗氧化[8]和抗腫瘤[9]等重要作用。但目前尚無明確研究顯示槲皮苷在AR中的確切效果。本研究通過AR模型小鼠，探討槲皮苷對(duì)AR的治療效果及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡Balb/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(京)2017-0015，小鼠體質(zhì)量為26～32 g，均為雌性，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)1周，自由攝食進(jìn)水，相關(guān)操作均符合動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 儀器

Centrifuge 5420型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；DM2700M型顯微鏡(美國Leica公司)；LSM-900型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 藥品與試劑

槲皮苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)為5280459)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為H052-1)；Diff-Quik染色試劑盒(西安齊岳生物科技有限公司，批號(hào)為148983)；1∶ 400 抗嗅覺標(biāo)記蛋白(OMP)抗體(上海拜力生物科技有限公司，批號(hào)為548985)；4%卵蛋白溶液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為AH06C17756)；Al(OH)3(美國Sigma公司，批號(hào)為V900163)；乙二胺四乙酸溶液(美國Sigma公司，批號(hào)為464534)；PBS緩沖液(美國賽默飛公司，批號(hào)為627813)；山羊血清(美國賽默飛公司，批號(hào)為c545489)；0.03% Triton X-100封閉液(美國賽默飛公司，批號(hào)為5487558)；FITC結(jié)合的山羊抗兔二級(jí)抗體(美國賽默飛公司，批號(hào)為4724869)HE染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)為164135a)；PAS染色試劑盒(美國Sigma公司，批號(hào)為1649881)。

2 方法

2.1 卵蛋白誘導(dǎo)的AR小鼠模型和槲皮苷治療

6周齡雌性Balb/c小鼠在無特定病原體環(huán)境中隨意獲得無菌食物和水。所有動(dòng)物均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方案處理。將小鼠隨機(jī)分為三組(n=10)，即對(duì)照組、模型組(卵蛋白)和治療組(卵蛋白+槲皮苷)。AR小鼠模型建立(模型組)：采用目前國內(nèi)常用的“卵蛋白注射及其鼻黏膜刺激法”，卵蛋白0.3 mg、Al(OH)330 mg 及0.9%氯化鈉溶液1 mL混合后于小鼠腹腔注射初次免疫，第2—14日小鼠正常飼養(yǎng)，第15—21日每側(cè)鼻孔給予4%卵蛋白溶液(20 μL/只)刺激小鼠鼻孔。對(duì)照組：腹腔注射Al(OH)3，然后在第15—21日用0.9%氯化鈉溶液刺激小鼠鼻孔。治療組：在模型組基礎(chǔ)上，第15—21日每側(cè)鼻孔給予4%卵蛋白溶液(20 μL/只) 刺激小鼠鼻孔，同時(shí)在第15—21日每日加用槲皮苷(純度≥98%)50 mg/kg灌胃。

2.2 過敏癥狀評(píng)估和鼻腔灌洗液樣品制備

在第21日最后一次卵蛋白鼻腔刺激后20 min內(nèi)，對(duì)所有小鼠的早期反應(yīng)(包括鼻摩擦次數(shù)和噴嚏次數(shù))進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以盲法記錄，共10 min。在最后一次鼻腔刺激2 h后，采集小鼠血液和鼻腔灌洗液樣本，以1 600 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)。將血漿和鼻腔灌洗液上清液儲(chǔ)存于-80 ℃以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，將小鼠顱骨矢狀打開，獲取鼻中隔及其黏膜，并儲(chǔ)存于-80 ℃以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 組織病理學(xué)檢查

鼻中隔的標(biāo)本在10%甲醛中固定24 h；用去離子水清洗后浸泡在乙二胺四乙酸溶液中脫鈣3～4周；然后石蠟包埋；組織切片(厚度為3 μm)用蘇木精-伊紅(HE)染色(用于組織病理學(xué)變化的定性評(píng)價(jià))、高碘酸-希夫(PAS)染色(用于黏液染色)，在光學(xué)顯微鏡下以400倍放大倍數(shù)觀察并采集圖像。

2.4 檢測小鼠鼻腔灌洗液中炎癥因子水平

對(duì)小鼠鼻腔灌洗液進(jìn)行炎癥因子檢測，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，對(duì)三組小鼠鼻腔灌洗液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)4、IL-10和IL-17水平進(jìn)行測定，重復(fù)3次。

2.5 鼻腔灌洗液中細(xì)胞分析

將鼻腔灌洗液150 μL以1 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)后涂片，利用Diff-Quik染色試劑盒進(jìn)行染色，包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下以400倍放大倍數(shù)觀察并采集圖像。

2.6 免疫熒光染色

將鼻中隔切片置于4 ℃、0.01 mo/L PBS緩沖液中，復(fù)溫15 min后滴加10%山羊血清+0.03% Triton X-100封閉液室溫(25 ℃)封閉2 h，組織切片中加入1∶ 400 OMP抗體，置于4 ℃孵育箱中過夜，再用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗。37 ℃下用異硫氰酸熒光素結(jié)合的山羊抗兔二級(jí)抗體孵育30 min，再次洗滌切片，滴加抗熒光衰減封片劑封片后置于4 ℃條件下保存，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 槲皮苷可改善AR小鼠的鼻過敏癥狀

治療組小鼠用槲皮苷灌胃，持續(xù)1周，記錄最后1次卵蛋白激發(fā)后的鼻摩擦次數(shù)和噴嚏次數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠平均鼻摩擦次數(shù)顯著增加(F=11.76，P<0.001)，而治療組小鼠平均鼻摩擦次數(shù)明顯少于模型組(F=9.89，P<0.01)；與對(duì)照組相比，模型組小鼠平均噴嚏次數(shù)顯著增加(F=13.21，P<0.001)，而治療組小鼠平均噴嚏次數(shù)明顯少于模型組(F=9.45，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明槲皮苷可減輕AR小鼠的鼻過敏癥狀，見圖1。

A.各組小鼠平均鼻摩擦次數(shù)；B.各組小鼠平均噴嚏次數(shù)；與對(duì)照組相比，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01A. average number of nasal rubbing of mice in each group; B. average number of sneezing of mice in each group; vs. the control group, ***P<0.001; vs. the model group, ##P<0.01

3.2 槲皮苷可改善AR小鼠鼻中隔組織病理學(xué)形態(tài)

與對(duì)照組相比，模型組小鼠鼻中隔組織中有明顯的杯狀細(xì)胞增生，且黏液分泌活躍；與模型組相比，治療組小鼠鼻中隔組織中杯狀細(xì)胞增生減輕，黏液分泌減少，表明槲皮苷可改善AR小鼠鼻中隔組織病理學(xué)形態(tài)，見圖2。

A.HE染色；B.PAS染色A. HE staining; B. PAS staining

3.3 槲皮苷可降低AR小鼠鼻腔灌洗液中炎癥因子水平

與對(duì)照組相比，模型組小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α(F=12.57)、IL-4(F=14.75)、IL-10(F=13.64)和IL-17(F=11.41)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與模型組相比，治療組小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α(F=10.43)、IL-4(F=9.87)、IL-10(F=9.70)和IL-17(F=8.43)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明槲皮苷可抑制AR小鼠的炎癥反應(yīng)，見圖3。

A.TNF-α；B.IL-4；C.IL-10；D.IL-17； 與對(duì)照組相比，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01A.TNF-α；B.IL-4；C.IL-10；D.IL-17； vs. the control group, ***P<0.001; vs. the model group, ##P<0.01

3.4 槲皮苷可減少小鼠鼻腔灌洗液中細(xì)胞數(shù)量

與對(duì)照組相比，模型組小鼠鼻腔灌洗液中總細(xì)胞數(shù)和分化細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)顯著增加；與模型組相比，治療組小鼠鼻腔灌洗液中細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，見圖4。

3.5 槲皮苷可提高小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中OMP表達(dá)水平

對(duì)照組小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中的OMP表達(dá)正常，呈現(xiàn)濃綠色；模型組小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中的OMP表達(dá)明顯減少；而治療組小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中的OMP表達(dá)減少得到一定程度的扭轉(zhuǎn)，OMP表達(dá)增加，見圖5。

圖5 各組小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中OMP免疫熒光染色代表性圖像

4 討論

AR為常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致脫顆粒和釋放預(yù)先形成的介質(zhì)，如組胺、白三烯和前列腺素D2，導(dǎo)致血管通透性增加，氣道平滑肌收緊，黏液分泌增加；另外，上述介質(zhì)還可刺激感覺神經(jīng)，在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)鼻癢、充血和打噴嚏的感覺，主要病理過程涉及免疫炎癥反應(yīng)的過度激活等[10-11]。中重度AR患者需常年服用抗過敏藥以緩解癥狀，但長期服用抗過敏藥可能帶來諸多不良反應(yīng)[12]。中醫(yī)藥是我國治療過敏性疾病的常用療法。研究結(jié)果表明，中醫(yī)藥治療AR具有一定的有效性[13]。但其中的作用機(jī)制尚無明確報(bào)道。

槲皮苷現(xiàn)已被證明具有多種治療作用，包括抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化及抗腫瘤等[14]。另有研究結(jié)果顯示，槲皮苷具有抗過敏作用，其可減輕特應(yīng)性皮炎，可能機(jī)制為其具有抗炎和抗氧化活性[15]。本研究探討了槲皮苷在小鼠AR模型中的作用及相關(guān)機(jī)制，結(jié)果顯示,槲皮苷可有效減輕AR小鼠的過敏癥狀及黏液的產(chǎn)生。黏液分泌增多為變態(tài)反應(yīng)的主要癥狀，IL-4可增強(qiáng)組胺誘導(dǎo)AR的黏液過度分泌[16-17]。IL-4是由肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，在過敏性哮喘和AR的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[18-19]。本研究結(jié)果說明槲皮苷可明顯減輕AR小鼠局部炎癥因子的產(chǎn)生，減輕局部炎癥細(xì)胞浸潤，由此表明槲皮苷可通過減少AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-4等炎癥因子的表達(dá)進(jìn)而減輕AR癥狀。

研究結(jié)果顯示，鼻黏膜上皮細(xì)胞中OMP表達(dá)的恢復(fù)與AR癥狀減輕密切相關(guān)，OMP是反映嗅覺損傷程度較為可靠的指標(biāo)[20]。因此，本研究對(duì)各組小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中OMP表達(dá)的變化進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)，槲皮苷治療后AR小鼠嗅覺上皮細(xì)胞中OMP的表達(dá)得到恢復(fù)，進(jìn)一步說明槲皮苷對(duì)AR小鼠具有較好的治療作用。

綜上所述，槲皮苷對(duì)AR小鼠具有較好的治療效果，其可通過減輕炎癥反應(yīng)、增加鼻黏膜上皮細(xì)胞OMP表達(dá)來發(fā)揮作用。本研究結(jié)果可為AR的臨床治療提供新的診療思路及研究基礎(chǔ)。