王微微 劉 宇 張彩云 王 丹 孫環(huán)環(huán) 霍小蕾

食管癌(Esophageal cancer，EC)是位居我國(guó)癌癥發(fā)病率第4位的一種惡性腫瘤，具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法，許多患者初次診斷即為晚期，并常伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。在臨床治療中，首選治療手段是手術(shù)切除和輔助化療；對(duì)于不可手術(shù)切除的患者，全身化療是一種關(guān)鍵的治療方法[3]。鉑類(lèi)化療藥物單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合使用，已被批準(zhǔn)用于臨床治療[4]。奧沙利鉑是治療食管癌常用的鉑類(lèi)化療藥物，并可引發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡[5-6]，但化療會(huì)引起嚴(yán)重的副作用和腫瘤耐藥，最終可能導(dǎo)致化療失敗[7]。因此，尋找新型的可用于聯(lián)合化療的藥物，是提高食管癌化療療效的關(guān)鍵。

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的發(fā)展，從植物中提取的天然產(chǎn)物聯(lián)合臨床藥物已經(jīng)越來(lái)越多的用于治療多種癌癥并發(fā)揮了重要作用，如喜樹(shù)堿[8]、香菇多糖、長(zhǎng)春花堿[9]等。香菇多糖(Lentinan，LNT)作為一類(lèi)從香菇中分離的重要天然產(chǎn)物，是香菇中最主要和有效的生物活性成分，有研究稱(chēng)，香菇多糖具有抗腫瘤[10]、抗病毒[11]、抗氧化、降血糖血脂和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性且毒性較低[12]，并已在臨床治療中作為免疫增強(qiáng)劑初步使用。香菇多糖與奧沙利鉑(Oxaliplatin，OXA)的聯(lián)合應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)香菇多糖聯(lián)合奧沙利鉑作用于食管癌EC109細(xì)胞，探索其能否發(fā)揮協(xié)同增效作用，為增加香菇多糖的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)植物多糖抗腫瘤藥物提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：人食管癌細(xì)胞EC109(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞庫(kù))。藥品與試劑：香菇多糖(Adooq Bioscience)，奧沙利鉑(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，10%胎牛血清(浙江天航生物科技股份有限公司)，100×青鏈霉素混合液(上海生工生物工程有限公司)，MTT粉末(北京索萊寶科技有限公司)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(康為世紀(jì))。儀器：流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)，研究級(jí)倒置式熒光顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌EC109細(xì)胞培養(yǎng)于含100 U·mL-1青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁，每孔中加入對(duì)應(yīng)濃度的藥物共培養(yǎng)24 h和48 h，后在每孔中加入10 μL的0.5 mg·mL-1MTT溶液于37 ℃孵育4 h，棄上清加150 μL的DMSO，最后用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值(OD)。

1.2.3聯(lián)合給藥作用分析方法 采用Chou-Talalay聯(lián)合用藥指數(shù)法，用compusyn軟件分析兩藥聯(lián)用的最佳作用濃度。若CI<1，兩藥具協(xié)同作用，值越小協(xié)同作用越強(qiáng)；若CI=1，具累加效應(yīng)；若CI>1，具拮抗作用，值越大拮抗作用越強(qiáng)。

1.2.4顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪板加藥，NC組、OXA組(20 μg·mL-1)、LNT組(1 200 μg·mL-1)、LNT+OXA組(1 200 μg·mL-1+20 μg·mL-1)，培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5細(xì)胞周期檢測(cè) 選用細(xì)胞周期試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期。取細(xì)胞鋪板，處理同1.2.4，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.6細(xì)胞凋亡檢測(cè) 利用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取細(xì)胞鋪板，處理同1.2.4，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,使用Flowjo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LNT和OXA對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的LNT和OXA對(duì)EC109細(xì)胞的增殖均具抑制效應(yīng)，呈劑量依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

注：*P <0.05, ** P<0.01圖1 香菇多糖和奧沙利鉑對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig.1 Effect of lentinan and oxaliplatin on proliferation EC109 cells(n=3)

2.2 LNT與OXA聯(lián)合用藥濃度的確定

采用Chou-Talalay聯(lián)合用藥指數(shù)法，分別用濃度為0、400、800、1 200 μg·mL-1的LNT和濃度為0、5、10、20、40 μg·mL-1的OXA聯(lián)合處理EC109細(xì)胞，經(jīng)Compusyn分析(見(jiàn)圖2、表1)，LNT+OXA組多數(shù)呈現(xiàn)CI<1的協(xié)同抑增殖作用；部分呈現(xiàn)CI>1的拮抗作用。因此選擇CI值最小的時(shí)間濃度組合：24 h的LNT(1 200 μg·mL-1)和OXA(20 μg·mL-1)聯(lián)用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(CI<1，協(xié)同作用；CI=1，累加效應(yīng)；CI>1，拮抗作用)圖2 Compusyn分析LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞的影響(L代表LNT，O代表OXA)Fig.2 Compusyn analyzed the effect of LNT combined with OXA on EC109 cells

表1 Compusyn分析LNT聯(lián)合OXA的CI值

2.3 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細(xì)胞24 h后，NC組細(xì)胞數(shù)量多且形態(tài)完整，細(xì)胞大小均一且密集鋪展生長(zhǎng)；OXA組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，體積變大，且部分呈圓珠狀；LNT組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，部分細(xì)胞貼壁能力降低；LNT+OXA組細(xì)胞數(shù)量顯著更少，體積相對(duì)較大。見(jiàn)圖3。

圖3 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of LNT combined with OXA on morphology of EC109 cells

2.4 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細(xì)胞24 h后，與OXA組和LNT組相比，LNT+OXA組抑增殖作用明顯增強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

圖4 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig.4 Effects of LNT combined with OXA on EC109 cell proliferation(n=3)

2.5 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞周期的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細(xì)胞24 h后，與NC組比較，OXA組S期細(xì)胞顯著增多；LNT組G1期細(xì)胞顯著增多；LNT+OXA組G2期細(xì)胞增多。見(jiàn)表2、圖5。

表2 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effects of LNT combined with OXA on EC109 cell

圖5 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of LNT combined with OXA on EC109 cell cycle

2.6 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響

NC組、OXA組、LNT組、LNT+OXA組處理EC109細(xì)胞24 h后，與NC組、OXA組、LNT組相比，LNT+OXA聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率升高，主要表現(xiàn)在晚期凋亡，即Q3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3、圖6。

表3 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響

圖6 LNT聯(lián)合OXA對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of LNT combined with OXA on apoptosis of EC109 cells

3 討論

香菇多糖是從食用香菇中分離出的高分子多糖，隨著中醫(yī)中藥越來(lái)越受到關(guān)注，中藥制劑常被用來(lái)輔助治療多種疾病。有報(bào)道稱(chēng)，香菇多糖對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44[13]、人肝癌細(xì)胞HepG2[14]、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7[15]等均有不同程度的抑增殖作用，并可作為輔助劑與化療藥物聯(lián)合使用[16]，發(fā)揮抗腫瘤作用。奧沙利鉑是常用的鉑類(lèi)化療藥物，并與其他藥物聯(lián)合使用，但化療耐藥極大的制約了食管癌患者整體生存率。在本研究中，探討了LNT聯(lián)合OXA對(duì)人食管癌細(xì)胞EC109的協(xié)同作用。

本研究結(jié)果顯示，LNT和OXA對(duì)EC109細(xì)胞的抑增殖作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性；與LNT或OXA組相比，LNT+OXA組抑制細(xì)胞增殖作用更顯著；Compusyn分析發(fā)現(xiàn)，LNT與OXA聯(lián)用在多數(shù)濃度組合具有協(xié)同抑增殖作用。同時(shí)通過(guò)顯微鏡觀察，兩藥聯(lián)用使EC109細(xì)胞數(shù)量明顯減少，體積變大。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LNT阻滯EC109細(xì)胞于G1期，OXA阻滯EC109細(xì)胞于S期，LNT+OXA組阻滯在G2期，表明兩藥聯(lián)合可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡表明，LNT+OXA組引起EC109細(xì)胞凋亡的能力更強(qiáng)。

綜上所述，LNT與OXA聯(lián)合用藥具有協(xié)同抑增殖促凋亡作用，與細(xì)胞周期G2期阻滯有關(guān)。同時(shí)，近年研究報(bào)道，香菇多糖可引起人結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞SW837[17]、人肺腺癌細(xì)胞A549[18]的免疫原性細(xì)胞死亡相關(guān)分子的表達(dá)升高。也有研究表明，奧沙利鉑可增強(qiáng)人和小鼠肝癌細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡相關(guān)生物標(biāo)記物的表達(dá)[19]，也可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增加和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)趨于成熟[5]。因此，香菇多糖和奧沙利鉑聯(lián)用對(duì)免疫原性細(xì)胞死亡的影響值得更深入的探索，生物活性多糖和奧沙利鉑的聯(lián)合應(yīng)用在食管癌的臨床應(yīng)用研究中占有重要作用，在未來(lái)識(shí)別具有誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡的抗腫瘤藥物也具有重要的研究?jī)r(jià)值。