崔 佳 溫 炟 陳廣信 吳長新

Syndecans(SDCs)是細(xì)胞表面的一類硫酸乙酰肝素跨膜糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)，該家族蛋白有4個(gè)結(jié)構(gòu)相似成員(Syndecan-1-4)[1]，廣泛參與骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、原發(fā)性肝癌等人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。SDC4作為SDCs家族中的重要蛋白，主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域構(gòu)成[3]。不同于SDC1-3在上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等特異性的細(xì)胞表達(dá)[4-5]，SDC4在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和遷移的過程[6-7]。此外，SDC4參與多種病毒和細(xì)菌病原體的感染過程，被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控炎癥相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用并且與許多炎癥性疾病發(fā)生有關(guān)[8-10]。但這些僅僅局限于哺乳動(dòng)物的研究中，對(duì)于非哺乳動(dòng)物如斑馬魚中SDC4介導(dǎo)的生物學(xué)功能則鮮有研究。HOFMEISTER等[11]揭示了SDC1-4四種家族蛋白在斑馬魚胚胎期腦部發(fā)育的表達(dá)模式相異，推測(cè)SDC1-4可能在斑馬魚體內(nèi)有不同的生物學(xué)功能。LUO等[12]通過原位雜交研究發(fā)現(xiàn)SDC4在斑馬魚胚胎期廣泛表達(dá)，并且影響斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)生過程中神經(jīng)細(xì)胞的增殖。本文對(duì)斑馬魚SDC4 基因進(jìn)行克隆并測(cè)序驗(yàn)證，分析其在斑馬魚胚胎發(fā)育前10 d的表達(dá)量差異，并且對(duì)斑馬魚SDC4、人SDC4和鼠SDC4的染色體基因連鎖性與氨基酸同源性做出分析，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，為后續(xù)斑馬魚中SDC4基因功能分析奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

pCS2+質(zhì)粒(山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院保藏)。

1.2 動(dòng)物

野生型斑馬魚AB、TU品系購自于國家斑馬魚資源中心(CZRC)。

1.3 主要試劑與儀器

NEBuilder HiFi Assembly Mix購自于New England Biolabs(北京)有限公司，Prime STAR Max、PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于TaKaRa大連寶生物公司，2хRealtime PCR super SYBRgreen mix 購自于北京聚合美生物科技有限公司。

1.4 AB、TU野生型斑馬魚品系基因組全長cDNA的制備

選取發(fā)育良好的斑馬魚卵或胚體各約50個(gè)，分別置于1.5 mL的離心管(RNase free)中, 先用RNase free ddH2O 清洗3遍，再加入Trizol 溶液后組織破碎混勻，然后用三氯甲烷、異丙醇提取RNA，最后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后待用。

1.5 斑馬魚SDC4 基因的克隆

根據(jù)ensemble斑馬魚SDC4 CDS信息設(shè)計(jì)引物，上游引物為：5′-ttt gca gga tcc agc cac cAT GTT GAA AGT TTA CCT CAT G-3′，下游引物為：tgc tca cag atc cac ctc cac cTG CGT AGA TTT CTG TGG TTG GAG-3′(引物中小寫字母為載體同源臂序列，大寫字母為SDC4 CDS 序列)，之后以受精后3 d 的TU斑馬魚基因組全長cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并回收。利用Gibson酶(NEBuilder HiFi Assembly Mix)將克隆的斑馬魚SDC4 CDS區(qū)與pCS2+質(zhì)粒進(jìn)行組裝，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，得到的菌落陽性克隆子送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 斑馬魚SDC4基因在AB、TU野生型品系中的mRNA表達(dá)量分析

設(shè)計(jì)用于qPCR的斑馬魚SDC4基因引物，上游引物為：5′-GCT CTG ATT GTG GGT GGC A-3′，下游引物為：5′-TTG GTG GGG GCT TTC TTG T-3′。內(nèi)參基因選用β-actin，上游引物為：5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′；下游引物為：5′-CAC CGA TCC AGA CGG AGT AT-3′。根據(jù)Realtime PCR super SYBRgreen mix試劑盒說明書配制反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件，數(shù)據(jù)處理采用與內(nèi)參基因歸化后用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.7 斑馬魚SDC4基因的生物信息學(xué)分析

在ensemble和NCBI網(wǎng)站得到各物種SDC4 的染色體連鎖基因信息和蛋白氨基酸序列，利用MegAlign軟件中Clustal W方法進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)，并且用MEGAX軟件中N-J鄰接計(jì)算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Graphpad Prism 7.0軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行Student’s unpairedt-test 檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，“NS”為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚SDC4基因克隆測(cè)序結(jié)果分析

通過PCR克隆技術(shù)獲得斑馬魚SDC4基因的全長cDNA序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果顯示，斑馬魚SDC4 CDS區(qū)已經(jīng)成功重組入 pCS2+ 載體(見圖1)。圖1是載體與目的基因的5′ 與3′ 端接合位點(diǎn)部分測(cè)序峰圖，加下劃線堿基表示 pCS2+ 載體序列，未加下劃線堿基表示SDC4基因序列。為了確保插入的SDC4基因能夠準(zhǔn)確表達(dá)，Kozak序列(gccacc)被選擇插入目的基因起始密碼子前(見圖1)，同時(shí)鑒于pCS2+載體中存在綠色熒光蛋白(GFP)基因，SDC4基因終止密碼子在插入載體時(shí)被剔除(見圖2)。

圖1 pCS2+-SDC4重組載體中SDC4 CDS區(qū)5’端部分測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing peaks figure of the 5' end of the SDC4 CDS region in the pCS2+- SDC4 recombinant vector

圖2 pCS2+-SDC4重組載體中SDC4 CDS區(qū)3′端部分測(cè)序峰圖Fig.2 Sequencing peaks figure of the 3' end of the SDC4 CDS region in the pCS2+- SDC4 recombinant vector

2.2 SDC4基因在AB、TU野生型斑馬魚中的表達(dá)

檢測(cè)受精后1 d(1 day post-fertilization, 1 dpf)即體節(jié)發(fā)育完成期與受精后3 d(3 dpf)即幼體形成期的野生型AB、TU斑馬魚中SDC4mRNA表達(dá)情況，qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：SDC4基因在野生型斑馬魚受精后前3 d無明顯的差異表達(dá)[n=3,P(1 dpf)=0.808,P(3 dpf)=0.550,見圖3]。

注：NS表示與AB組比較P>0.05圖3 斑馬魚SDC4基因在AB與TU品系中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression of zebrafish SDC4 gene in AB and TU strains

2.3 SDC4基因在TU野生型斑馬魚中的時(shí)間表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測(cè)斑馬魚胚胎發(fā)育的前10 d內(nèi)SDC4 mRNA隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，SDC4 mRNA 在1 dpf 較2 dpf、3 dpf、4 dpf有相對(duì)高的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[n=3,P(2 dpf)=0.015,P(3 dpf)=0.001,P(4 dpf)=0.012]。見圖4。推測(cè)斑馬魚SDC4表達(dá)可能存在一定程度的母系遺傳控制，但是隨后SDC4 mRNA的表達(dá)量在5 dpf、6 dpf、8 dpf、10 dpf較1 dpf差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[n=3,P(5 dpf)=0.139,P(6 dpf)=0.998,P(8 dpf)=0.117,P(10 dpf)=0.929]。

注：*表示與1 dpf組比較P<0.05,NS表示與1 dpf組比較P>0.05圖4 SDC4基因在斑馬魚胚胎發(fā)育前10 d的mRNA表達(dá)量Fig.4 Temporal expression pattern of zebrafish SDC4 gene during the first ten days embryonic development

2.4 斑馬魚SDC4、人SDC4、小鼠SDC4基因染色體連鎖性分析

通過ensemble和NCBI網(wǎng)站可知：斑馬魚SDC4、人SDC4和小鼠SDC4基因分別位于3號(hào)、20號(hào)和2號(hào)染色體，染色體連鎖基因座位示意圖分析顯示：人SDC4和小鼠SDC4基因位置附近的連鎖基因保持了較高的相似性，但斑馬魚SDC4基因較人SDC4和小鼠SDC4的連鎖基因僅MATN4與RBPJL相似(見圖5)。

圖5 人SDC4、小鼠SDC4和斑馬魚SDC4基因的染色體連鎖基因座位圖Fig.5 The chromosomally syntenic analysis diagram of human SDC4, murine SDC4 and zebrafish SDC4 genes

2.5 斑馬魚、人、小鼠SDC4氨基酸序列比對(duì)

將斑馬魚SDC4、人SDC4、小鼠SDC4氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(見圖6)，結(jié)果顯示：斑馬魚SDC4 與人SDC4、小鼠SDC4的同源性分別為38.3%、44.2%，而人SDC4與小鼠SDC4 的同源性高達(dá)82.4%。圖6顯示各物種中的SDC4 蛋白在C末端即胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(Cytoplasmic domain，CD)有高的同源性：人與小鼠SDC4蛋白CD區(qū)(residues 171-198)完全一致，與斑馬魚SDC4 蛋白CD區(qū)(residues 200-207)同源性為85.70%。

圖6 斑馬魚SDC4 與人、小鼠SDC4的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Multiple sequence alignment of zebrafish SDC4 with human and murine SDC4

2.6 SDC4蛋白的進(jìn)化樹分析

為了詮釋SDC4蛋白在物種中的進(jìn)化地位，選取了15種典型生物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，其中包括5種魚類動(dòng)物(Astyanaxmexicanus、Astatotilapiacalliptera、Amphiprionocellaris、Amphiprionpercula、Daniorerio)、1種爬行類動(dòng)物(Aquilachrysaetoschrysaetos)與9種哺乳類動(dòng)物(Bosgrunniens、Bostaurus、Canislupusfamiliarisgreatdane、Balaenopteramusculus、Canislupusfamiliarisgreatdane、Aotusnancymaae、Homosapiens、Musmusculus、Aquilachrysaetoschrysaetos)。圖7所示的系統(tǒng)發(fā)生樹基本上能夠反映出物種的進(jìn)化關(guān)系，相較于哺乳動(dòng)物和爬行動(dòng)物，斑馬魚SDC4與其他4種魚類動(dòng)物被分在了同一簇。此外，通過系統(tǒng)發(fā)生樹揭示的物種親緣關(guān)系可知，斑馬魚SDC4 蛋白在進(jìn)化中是保守的，且是人類和其他物種SDC4的直系同源基因(見圖7)。

注 部分物種SDC4 UniPro蛋白數(shù)據(jù)庫：Bos taurus (E1BKS1)、Camelus dromedarius(A0A4U5S0B1)、Midas cichlid (A0A3Q0S4P1)、Astyanax mexicanus(A0A3B1K6Y0)、Canis lupus familiarisgreatdane(J9NZ79)、Aotus nancymaae (A4K2X3)、Homo sapiens (P31431-1)、Mus musculus (Q35988)、Anolis carolinensis (A0A3Q1APH0)、Astatotilapia calliptera (A0A3P8PRI7)、Amphiprion percula (A0A3P8UAL5)圖7 SDC4蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 A phylogenetic tree of SDC4 was constructed based on 15 organisms

3 討論

SDC4是SDCs家族中重要的跨膜糖蛋白，哺乳動(dòng)物SDC4蛋白研究較多地集中于細(xì)胞骨架與細(xì)胞增殖等方面，并且與某些腫瘤的形成發(fā)生相關(guān)，但是關(guān)于斑馬魚SDC4 研究則較少。目前，斑馬魚作為一種新興的模式動(dòng)物，在動(dòng)物發(fā)育、疾病發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)與藥物篩選等研究方向得到了廣泛的應(yīng)用，加之近年來CRISPR基因編輯等反式遺傳學(xué)手段的興起，使越來越多的人類基因功能在斑馬魚中得到了驗(yàn)證[13-15]。本研究首先從TU野生型斑馬魚基因組cDNA中擴(kuò)增了SDC4基因，測(cè)序結(jié)果顯示與ensemble 網(wǎng)站中公布的TU斑馬魚SDC4基因序列(ENSDART00 000 083 830.5)完全一致(部分序列見圖1)，這為后續(xù)從反式遺傳學(xué)角度在斑馬魚體內(nèi)開展SDC4基因過表達(dá)、敲除或回補(bǔ)等實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)的分子生物學(xué)信息與材料。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果顯示，SDC4基因在1 dpf、3 dpf兩個(gè)時(shí)間的斑馬魚AB和TU之間mRNA表達(dá)量基本一致，提示SDC4在實(shí)驗(yàn)室常用AB、TU野生型斑馬魚品系的早期胚胎發(fā)育關(guān)鍵階段有相似的表達(dá)量，為后續(xù)在此兩種品系中開展斑馬魚SDC4功能研究提供了基本分子生物學(xué)信息。分析斑馬魚胚胎發(fā)育期前10 d的SDC4 mRNA表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，SDC4的表達(dá)量受到一定程度的母系遺傳控制，但是關(guān)于SDC4在成魚中的表達(dá)模式及其功能需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步挖掘解釋?；蛉旧w連鎖性分析發(fā)現(xiàn)，人SDC4和小鼠SDC4基因有高度保守的染色體連鎖性，但是斑馬魚SDC4的連鎖基因已經(jīng)表現(xiàn)出與人和小鼠的差異性。SDC4蛋白氨基酸序列比對(duì)顯示：SDC4蛋白在不同物種之間有一定的保守性，但是相較于人和小鼠SDC4之間的高同源性，斑馬魚SDC4與人、小鼠SDC4的同源性則較低。因此，通過基因染色體連鎖性和蛋白氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚SDC4與哺乳動(dòng)物SDC4雖然存在分子進(jìn)化保守性，但也表現(xiàn)出一定程度的分子遺傳差異性，進(jìn)而思考斑馬魚SDC4與哺乳動(dòng)物SDC4蛋白功能之間是否存在異同點(diǎn)。其次，根據(jù)蛋白序列中CD區(qū)的保守性，是否可以推測(cè)斑馬魚SDC4在胞內(nèi)接頭蛋白與信號(hào)通路激活等方面與哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)相似，這些假設(shè)我們將在后期研究中展開調(diào)查。此外，本研究得到的SDC4 系統(tǒng)發(fā)生樹有一定合理性，為推演斑馬魚SDC4的功能和進(jìn)化機(jī)制提供了信息基礎(chǔ)，但由于系統(tǒng)發(fā)生樹中氨基酸序列數(shù)目不多、代表物種數(shù)量較少，因此得到的SDC4系統(tǒng)發(fā)生樹只能在大體上反應(yīng)近緣物種遺傳物質(zhì)的相似性，更多深層次的遺傳進(jìn)化關(guān)系需要我們進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究克隆了斑馬魚SDC4基因，并對(duì)其mRNA在不同野生型斑馬魚中的差異表達(dá)量和在胚胎發(fā)育早期隨時(shí)間表達(dá)量進(jìn)行了分析，之后對(duì)斑馬魚SDC4進(jìn)行了基因連鎖性、蛋白同源性和進(jìn)化樹分析，本研究為后續(xù)研究斑馬魚SDC4功能提供了基礎(chǔ)生物材料并奠定了分子遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。