栗云鵬，施玉峰，巫彬芳，周 華，施震渺，李松浩，徐海濤，蘭玉彬，龍擁兵

(華南農(nóng)業(yè)大學 電子工程學院/國家精準農(nóng)業(yè)航空施藥技術國際聯(lián)合研究中心, 廣東 廣州 510642)

近年來，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術發(fā)展日新月異，智慧農(nóng)業(yè)概念也應運而生。智慧農(nóng)業(yè)是現(xiàn)代信息技術與農(nóng)業(yè)的深度融合，其關鍵是基于農(nóng)業(yè)傳感器的農(nóng)業(yè)信息的高效獲取[1-2]。目前，高端農(nóng)業(yè)傳感器主要依賴進口，農(nóng)業(yè)專用傳感器的種類和功能還不夠完善，大多數(shù)農(nóng)業(yè)傳感器用于農(nóng)情監(jiān)測[3]，適用于檢測農(nóng)作物本身生理狀況的農(nóng)業(yè)傳感器還比較少。維生素 C(Vitamin C，VC)又稱抗壞血酸 (Ascorbic acid，AA)，是植物自身合成的抗氧化劑，在清除自由基、提高植物抗脅迫能力方面起著重要作用[4]。維生素C還是重要的農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)指標之一[5]，有研究指出外施抗壞血酸可以提升大豆產(chǎn)量[6]。因此，發(fā)展農(nóng)用維生素C傳感器，確立快速測定農(nóng)產(chǎn)品中維生素C含量的有效手段，對支撐農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的高效準確鑒定具有重要意義。維生素C含量的測定主要采用液相色譜法[7]、比色法[8]、熒光法[9]、碘滴定法[10]、分光光度法[11]和滴定法[12]。上述測定方法大都需要送樣至專業(yè)實驗室進行檢驗，所需檢測設備昂貴，樣品前處理工序復雜、需時較長。電化學傳感分析技術具有許多優(yōu)點，如傳感器檢測針對性強、功能可定制、設備成本低、樣品前處理簡單、可通過便攜式設備實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測等[13-15]。當前，維生素C電化學傳感器的報道更多是針對藥物[16]、飲料[17]以及動物[18]方面，關于植物中維生素C的電化學傳感器研究較少。因此，基于電化學傳感法開發(fā)一種適用于植物內(nèi)環(huán)境的維生素C傳感器具有巨大的應用價值。電化學傳感器的開發(fā)關鍵在于選擇合適的電極基底和構建高效敏感膜結構實施增敏。相比于常用的玻碳電極和碳糊電極，鉛筆芯電極(Pencil graphite electrode，PGE)具有高化學和機械穩(wěn)定性、寬工作電壓和低背景電流等優(yōu)點，可作為傳感器基底的優(yōu)選方案之一[19-22]。另外，電極敏感層品質(zhì)的好壞將極大地影響傳感器性能。金納米顆粒具有良好的導電性、催化性和生物相容性，用于修飾電化學傳感電極表現(xiàn)出很強的維生素C氧化能力[18,23-24]，但其容易和有機物相結合，導致敏感層污染失效[18]。多壁碳納米管 (Multi walled carbon nanotubes，MWCNTs)具有中空的多層管狀結構，該特殊結構令其具有大比表面積、良導電性和強吸附性，可促使電子快速轉(zhuǎn)移以分解眾多有機物而具備優(yōu)秀的抗污染能力[25-26]。采用多種納米材料協(xié)同構建敏感膜增效，是優(yōu)化電化學傳感器性能的有效手段。因此，本研究將采用低成本、高穩(wěn)定的鉛筆芯作為傳感器電極基底，以金納米顆粒和多壁碳納米管協(xié)同構建敏感膜，制備MWCNTs/Au/PGE電極，并將其應用于果蔬中，實現(xiàn)維生素C含量的快速檢測。本研究結果將為農(nóng)業(yè)傳感器的專用開發(fā)和植物本體信息的快速測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

二甲基甲酰胺(DMF)、L-抗壞血酸、L-蘋果酸(C4H6O5)、檸檬酸、氯化鉀 (KCl)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、亞鐵氰化鉀 (K4Fe(CN)6·3H2O)均購自廣州化學試劑廠。氯金酸(AuCl4H)購自思域化工，多壁碳納米管購自先豐納米公司，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自飛凈生物公司，HB鉛筆芯(0.5 mm)購自得力公司，熱縮管(0.6 mm)購自于伊萊科公司。試驗所用水溶液均采用超純蒸餾水配置。

1.2 試驗儀器和測試方法

試驗儀器主要有掃描電子顯微鏡(SEM，ZEISS公司)、能量色散譜儀(EDS，ZEISS公司)、X 射線光電子能譜 (XPS，Thermo Scientific公司)、拉曼光譜儀(Raman，英國牛津儀器)、電化學工作站(上海辰華公司)。

所有電化學試驗均采用三電極體系，試驗方法包括循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法和時間電流法。其中工作電極為PGE以及修飾的PGE，參比電極為飽和Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑絲電極。以 0.1 mol/L 的 PBS 作為支撐電解質(zhì)，在+0.2 V 的外加電壓下，研究MWCNTs/Au/PGE對維生素C的安培響應。

1.3 MWCNTs/Au/PGE傳感器的制備

截取4 cm熱縮管套于6 cm鉛筆芯上，兩端各露出1 cm，以其中一端作為傳感電極。將熱風槍調(diào)至200 ℃，采用熱風吹掃固定熱縮管，即制得裸鉛筆芯電極 (PGE)。將 PGE 置于 0.1 mol/L 的 KCl和5 mmol/L 的 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]混合溶液中，采用循環(huán)伏安法篩選PGE電極。循環(huán)伏安法掃描電壓為-0.2～+0.8 V，掃描速率為 50 mV/s，掃描20圈。挑選掃描后峰值電流相同的PGE電極，以純水清洗后保存?zhèn)溆谩?/p>

將PGE電極置于0.2 mmol/L氯金酸溶液中，采用時間電流法，通過施加負電壓還原氯金酸制備金納米顆粒，所用沉積電壓為-0.2 V，沉積時間為8 s，制得金納米顆粒鉛筆芯電極(Au/PGE)。采用物理吸附法沉積多壁碳納米管，首先將200 mg多壁碳納米管分散于40 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，制得5 mg/mL的MWCNTs/DMF溶液，超聲震蕩 15 min。然后將 Au/PGE前端 1 cm 浸沒于MWCNTs/DMF溶液10 min，取出自然風干，重復2次，即可制得多壁碳納米管和金納米顆粒修飾的鉛筆芯電極(MWCNTs/Au/PGE)。最后用純水清洗電極表面，晾干保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與分析

2.1 MWCNTs/Au/PGE的表征

2.1.1 電極表面形貌表征 采用掃描電鏡分別觀察Au/PGE和MWCNTs/Au/PGE電極表面，結果如圖1a和1b所示。由圖1a可見，Au/PGE電極表面沉積了大量分散狀的金納米顆粒；進一步修飾多壁碳納米管后，在圖2b中可見彎曲的多壁碳納米管和金納米顆粒相互吸附，沉積于電極表面。采用EDS分析MWCNTs/Au/PGE的元素組成，在圖1c中以紅框標出采集區(qū)，圖1d結果表明，修飾電極表面僅存在金和碳元素。

圖1 電極表面納米結構形貌和成分表征Fig.1 Nanostructure morphology and composition characterization of electrode surface

2.1.2 電極表面納米結構成分表征 圖1e 展示了MWCNTs/Au/PGE電極3個修飾階段的拉曼光譜，可見歸屬于碳的3個特征峰，分別為D峰(1 338～1 352 cm-1)、G 峰 (1 568～1 583 cm-1)和 2D 峰 (2 689～2 701 cm-1)。其中D峰強度與碳的邊緣缺陷和無序程度相關，G峰反映了樣品中碳的石墨化程度。結果表明，PGE電極的主要成分是石墨粉末；沉積金納米顆粒后，拉曼峰強度均增加，表明金納米顆粒增強了電極的拉曼響應；修飾多壁碳納米管后，3個拉曼峰的半峰寬均變小，而代表有序堆疊結構的2D峰峰強顯著提升，結合文獻[27]可得，有序結構的多壁碳納米管確實已附著在修飾電極表面。

MWCNTs/Au/PGE電極的表面化學成分采用XPS進行測定，掃描全譜圖1f顯示其主要的元素組成為C、Au、O和N。圖1g為Au 4f的精細圖譜，在結合能83.8和87.5 eV處存在1對雙峰，對應于 Au 4f7/2和 Au 4f5/2的能級，綜合文獻 [28]結果，證實了氯金酸還原后是以單質(zhì)金的形式形成金納米顆粒。圖1h為C 1s的精細圖譜，確認了C—C和C＝C鍵的存在，其主要來自于多壁碳納米管和鉛筆芯中的石墨。

2.2 MWCNTs/Au/PGE維生素C傳感器的電催化性能

循環(huán)伏安法對比了修飾有不同納米材料的電極催化性能。在含0.1 mol/L的KCl和5.0 mmol/L的 Fe(CN)63-/4-的溶液中依次測試 PGE、MWCNTs/PGE、Au/PGE和MWCNTs/Au/PGE電極，結果如圖2a所示。在PGE的循環(huán)伏安譜上可觀察到1對氧化還原峰；分別修飾金納米顆粒和多壁碳納米管之后，峰電流增強，說明修飾納米材料可促使更多的Fe(CN)63-/4-到達電極表面；峰電位差減小，說明修飾納米材料還可以增強溶液和電極表面的電子轉(zhuǎn)移[29]。同時修飾2種納米材料，峰電流的增強最為顯著，這說明共同修飾兩種納米材料可協(xié)同增強電極催化電流。

圖2 MWCNTs/Au/PGE的電化學性能Fig.2 Electrochemical performance of MWCNTs/Au/PGE

根據(jù)Randles-Sevcik方程，電極有效表面積(A)按照公式(1)計算。

式中，Ip是峰值電流，n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)，v是掃描速率，C0是反應物濃度，即Fe(CN)63-/4-的濃度，D0是Fe(CN)63-/4-的擴散系數(shù) (0.65×10-5cm2·s-1)[30]。通過計算可得，PGE的有效面積為0.128 cm2，MWCNTs/Au/PGE的有效面積為0.204 cm2，比PEG增加了59.3%，金納米顆粒和多壁碳納米管所組成的混合納米結構協(xié)同提升了電極的有效反應面積，從而增強了催化電流。

在50 μg/g的維生素C標準液中，采用差分脈沖伏安法探究MWCNTs/Au/PGE對維生素C響應的提升效果，結果如圖2b所示，MWCNTs/Au/PGE性能最優(yōu)，其峰電位減小了80 mV，峰電流提升2.01倍，結合文獻[31]結果充分說明，MWCNTs/Au/PGE對維生素C具有優(yōu)異的電催化活性，因此共同修飾多種納米材料是提升傳感器性能的有效策略。

采用循環(huán)伏安法研究了維生素C在電極表面的反應機理，結果如圖2c和2d所示。在50 μg/g的維生素C標準液中進行掃描，隨著掃描速率的增加，峰電流逐漸增加，氧化峰電位向正向偏移。循環(huán)伏安譜中沒有還原峰，說明MWCNTs/Au/PGE表面的氧化反應是不可逆的。峰值電流與掃描速率平方根呈線性增加，結合文獻[31]，說明電極表面維生素C的氧化反應主要由擴散控制。

2.3 pH對MWCNTs/Au/PGE維生素C傳感器性能的影響

與人和動物相比較，植物體內(nèi)的pH范圍更廣。在植物生長過程中由于有機酸的積累，器官中的pH變化顯著。為了滿足快速檢測的要求，需要考慮寬pH范圍內(nèi)的傳感器性能變化，因此，本研究還通過差分脈沖伏安法分別測試了pH=4～8范圍內(nèi)MWCNTs/Au/PGE對不同質(zhì)量分數(shù)維生素C(20～500 μg/g)的響應，結果如圖3所示。在pH=4～8范圍內(nèi)，MWCNTs/Au/PGE的差分脈沖伏安峰電流與維生素C質(zhì)量分數(shù)均表現(xiàn)出良好的線性關系(圖3a～3e)。由圖3f可見，隨著pH的增大，峰電位逐漸向負電位移動，這是由于維生素C進行氧化反應時涉及去質(zhì)子化過程，高pH環(huán)境更容易促進此過程。以pH和峰電位建立線性關系，所得斜率為31 mV/pH，結合文獻[32]，說明氧化過程是2個電子和1個質(zhì)子的轉(zhuǎn)移過程。當pH=4時，溶液中的大量質(zhì)子與維生素C氧化產(chǎn)生的電子相結合，因而阻礙了電子向電極的流動[33]。當pH=5時，溶液質(zhì)子數(shù)量變少，維生素C氧化所產(chǎn)生的2個電子能更容易地轉(zhuǎn)移到電極上，從而產(chǎn)生更強的電化學信號。當pH繼續(xù)增大，可能是由于納米結構與維生素 C產(chǎn)生靜電排斥，在 pH＞6時，維生素C(pKa=4.1)發(fā)生去質(zhì)子化過程，因而在pH＞6時峰電位驟降，并在pH=8時略微上升[32]。綜上所述，MWCNTs/Au/PGE可在寬pH范圍內(nèi)工作，適用于植物內(nèi)環(huán)境下監(jiān)測維生素C含量。由于pH=5時電極對維生素C響應最好，因此選擇在該條件下進行時間電流法測定標準曲線。

2.4 MWCNTs/Au/PGE維生素C傳感器的檢測性能

時間電流法可在1～2 min內(nèi)獲得穩(wěn)定的電流響應輸出，因此，時間電流法更適合實施現(xiàn)場快檢。為探究MWCNTs/Au/PGE對維生素C的檢測性能，選擇在pH=5條件下，采用時間電流法對電極進行定標，試驗所用基質(zhì)為pH=5的PBS，維生素C質(zhì)量分數(shù)調(diào)節(jié)范圍為1～500 μg/g，時間電流法檢測前先等待維生素C擴散完全再開始測量，結果如圖4所示，MWCNTs/Au/PGE對維生素C表現(xiàn)出穩(wěn)定的檢測性能，維生素C質(zhì)量分數(shù)與響應電流呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為y= 0.049 7x+0.054 7，R2 = 0.998。定標結果表明，MWCNTs/Au/PGE 的靈敏度高 [0.244 μA·(μg/g)-1·cm-2]，線性檢測范圍達1～500 μg/g，適用于檢測大部分果蔬的維生素C含量。

圖4 MWCNTs/Au/PGE時間電流曲線和線性關系Fig.4 Time current curve and linear relationship of MWCNTs/Au/PGE

2.5 MWCNTs/Au/PGE維生素C傳感器的抗干擾性

考慮到果蔬體液中存在大量檸檬酸、蘋果酸和葡萄糖等有機物，這些有機物可能會影響傳感器的維生素C檢測響應，因此進行了抗干擾性測定，向PBS溶液中依次加入10 μg/g的維生素C、葡萄糖、檸檬酸、蘋果酸、維生素C，測定氧化電流，結果如圖5所示，在添加3種干擾物后，氧化電流并未發(fā)生明顯變化，電流變化均小于1.77%，并采用公式(2)計算干擾率：

圖5 MWCNTs/Au/PGE抗干擾測試Fig.5 Anti-interference test of MWCNTs/Au/PGE

式中，I前、I后分別為添加干擾物前、后的電流均值。

在依次添加葡萄糖、檸檬酸和蘋果酸后，經(jīng)計算，其干擾率分別是1.22%、1.77%和0.64%，這說明傳感器對果蔬體液中存在的常見有機物具有較強的抗干擾性。

2.6 MWCNTs/Au/PGE維生素C傳感器的重復性和穩(wěn)定性

由于在電化學檢測中，電極的使用次數(shù)和保存時間增加會導致檢測峰電流衰減，因此為確認準確性，對MWCNTs/Au/PGE電極的重復性進行試驗。在180 μg/g的維生素C溶液中，同一根電極連續(xù)平行測試4次，相對標準偏差(RSD)為2.7%，說明傳感器經(jīng)多次使用后衰減很小，可在現(xiàn)場檢測中重復使用以節(jié)約成本。穩(wěn)定性試驗是在180 μg/g的維生素C溶液中進行的，先取制備好的傳感器進行測定并保存，傳感器清洗后在常溫常壓條件下放置4周，在相同條件下測定的電流為原始值的85.3%，說明經(jīng)長時間保存后傳感器仍具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 MWCNTs/Au/PGE維生素C傳感器的實樣檢測分析

為驗證MWCNTs/Au/PGE在實際應用中的效果，對番茄果實中的維生素C含量進行檢測，如圖6所示。將成熟番茄果實鮮榨后過濾獲得果汁濾液，經(jīng)測定，鮮榨果汁的pH=4.9。選擇pH=5的PBS為稀釋液，采用實樣加標法[28]，以10倍果汁稀釋液為基底，加入維生素C標準液3次(5、10和20 μg/g)，根據(jù)標準曲線(圖4)計算每次加標后稀釋液的維生素C含量，用線性反推法求得10倍果汁稀釋液的維生素C含量。加標回收率采用公式(3)計算：

圖6 10倍稀釋的鮮榨番茄汁中維生素C含量的測定過程Fig.6 Determination of vitamin C content in 10-fold diluted fresh tomato juice

計算結果如表1所示，10倍稀釋液的維生素C質(zhì)量分數(shù)為6.14 μg/g，3次加標回收率均在109%～113%之間。將電化學法與采用鉬藍比色法的測定結果相對比，2種方法所測定的維生素C含量相近，具體結果如表2所示。以上結果表明，MWCNTs/Au/PGE可以準確地檢測出番茄果實中的維生素C含量，具有良好的實用性。

表1 加標回收率法電化學檢測番茄汁維生素C含量Table 1 Electrochemical determination of vitamin C content in tomato juice by standard addition recovery method n=3

表2 不同方法檢測番茄汁中維生素C含量Table 2 Vitamin C content in tomato juice detected by different methods n=3

3 討論與結論

由于常溫下維生素C極易被氧化，快速精確地測定維生素C含量受到挑戰(zhàn)。基于鉬藍比色法[11]和液相色譜法[7]的實驗室送檢方案存在操作繁瑣、成本高昂和前處理時間長等弊端，可快速響應的電化學傳感法成為實現(xiàn)現(xiàn)場快檢的優(yōu)選方式。為發(fā)展適用于農(nóng)業(yè)的維生素C傳感器，本研究以金納米顆粒和多壁碳納米管協(xié)同修飾鉛筆芯，構建了高響應的MWCNTs/Au/PGE電極。本研究采用掃描電鏡、XPS光電子能譜、拉曼光譜等手段對MWCNTs/Au/PGE進行形貌和成分表征，結果表明，采用分步修飾法在鉛筆芯表面成功沉積混合納米結構。Dokur等[34]曾用金和碳納米管修飾鉛筆芯電極測定核黃素，所修飾電極活性面積較本研究小，本研究的MWCNTs/Au/PGE電極的活性面積達0.204 cm2，比PGE增加了59.3%。表明本研究所采用的分步修飾法容易構建交聯(lián)的混合納米結構，增加電極活性面積提升催化效果。為保證所制備電極能在果蔬體液pH范圍內(nèi)應用，試驗采用差分脈沖伏安法分別測定了pH=4～8條件下的含量-電流響應曲線。所擬合線性關系良好且差異極小，在pH=5時，電極具有最大的靈敏度。試驗結果與龔德狀等[33]采用金磁微粒模擬酶修飾的傳感器的最優(yōu)pH條件相同。進一步研究測定成熟番茄汁液的pH=4.9，所以最終選擇在pH=5環(huán)境下，采用時間電流法實施快檢。該法測得維生素C的線性檢測限為1～500 μg/g，靈敏度達 0.244 μA·(μg/g)-1·cm-2。以 10 倍稀釋的鮮榨番茄汁為對象進行實測，結果與鉬藍比色法所測得的維生素C含量相近。張巧云等[17]采用納米多孔金電化學傳感器快速檢測飲料中的維生素C含量，線性檢測限為 6.6～160.0 μg/g，顯然本研究所制備的傳感器性能更優(yōu)，寬檢測限更適合大多數(shù)農(nóng)產(chǎn)品的現(xiàn)場快檢。Li等[35]采用一次性不銹鋼電極檢測大豆幼苗中的生長素含量，不銹鋼質(zhì)地堅硬易于刺入根莖，便于活體檢測和讀取實時數(shù)據(jù)，為實現(xiàn)田間植物在線持續(xù)檢測提供了后續(xù)研究方向。

本研究采用分步修飾法在鉛筆芯電極上沉積了金納米顆粒和多壁碳納米管的混合納米結構，成功制備了一種低成本、高響應的維生素C傳感器。試驗結果表明，MWCNTs/Au/PGE具有寬的pH檢測范圍，對維生素C具有高選擇性，且冷藏保存穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。對番茄果實進行檢測，回收率在109%～113%之間，RSD均小于2.26%。本研究有望為快速檢測果蔬維生素C含量提供新思路。