龐連慧，羅雙雙，石林林，陳天圣，劉紅，王煥嶺

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361021

魚(yú)類(lèi)性腺成熟是生殖細(xì)胞不斷增殖、分化成成熟配子的過(guò)程，而配子的成熟需要經(jīng)過(guò)2次減數(shù)分裂，其中涉及了同源染色體的配對(duì)、聯(lián)會(huì)、重組和分離等，其中任何環(huán)節(jié)的異常都會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂過(guò)程無(wú)法正常進(jìn)行，進(jìn)而導(dǎo)致配子發(fā)育的異常[1]，因此，這個(gè)過(guò)程需要精確而復(fù)雜的分子調(diào)控。細(xì)胞分裂周期蛋白20（cell division cycle 20 homolog，CDC20）是細(xì)胞周期、有絲分裂和減數(shù)分裂的重要調(diào)節(jié)因子[2]。據(jù)報(bào)道，不同物種CDC20蛋白的結(jié)構(gòu)域十分保守，一般含有7個(gè)WD40基序形成穩(wěn)定的7葉螺旋槳狀結(jié)構(gòu)，作為支架介導(dǎo)泛素結(jié)合酶與底物之間相互結(jié)合[3]。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中，CDC20蛋白是同源染色體分離的關(guān)鍵因子，通過(guò)影響減數(shù)分裂的重要調(diào)控蛋白——后期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase promoting complex/cyclosome，APC/C）的活性促進(jìn)Ⅱ期姐妹染色體分離。研究發(fā)現(xiàn)CDC20蛋白表達(dá)量降低會(huì)導(dǎo)致小鼠受精卵幾乎不能正常發(fā)育[4]，而其蛋白失活會(huì)引起胚胎死亡[5]。在人類(lèi)中，CDC20基因的突變導(dǎo)致女性不育[6]和男性的生殖能力降低[7]。這些研究表明CDC20在動(dòng)物生殖、胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。目前，CDC20的功能研究在魚(yú)類(lèi)中尚未涉及。因此，為了解魚(yú)類(lèi)cdc20基因的功能，本研究以團(tuán)頭魴為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其cdc20基因的序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化和時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行初步研究，旨在為后續(xù)的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 團(tuán)頭魴總RNA的提取與cDNA合成

使用TRIzol（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）提取團(tuán)頭魴成魚(yú)不同組織的總RNA，包括腦、眼睛、鰓、心臟、肝臟、脾臟、腸、腎臟、卵巢、精巢和肌肉。采集不同發(fā)育時(shí)期（受精卵、2-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)期、體節(jié)期、心跳期和孵化期）的胚胎并提取總RNA。將提取的總RNA用Prime-Script?RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKa-Ra）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2 團(tuán)頭魴cdc20基因的克隆和進(jìn)化分析

將斑馬魚(yú)的cdc20cDNA序列（Accession：NM_213080）與筆者所在實(shí)驗(yàn)室的團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，獲得團(tuán)頭魴cdc20基因的編碼區(qū)序列。并根據(jù)此序列使用Oligo 7和Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)PCR引物以擴(kuò)增團(tuán)頭魴cdc20基因的編碼區(qū)序列。根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸序列利用ClutsalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)以及使用SWISS在線(xiàn)網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；基于MEGA 6.0軟件的Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3 sqRT-PCR

采用sqRT-PCR方法檢測(cè)cdc20基因在團(tuán)頭魴成魚(yú)各組織中的表達(dá)模式，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。PCR條件如下：95℃5 min；95℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物，使用1%的瓊脂糖凝膠，140 V電壓下電泳15 min，檢測(cè)該基因在各組織中的表達(dá)量。

表1 本研究所用引物Table 1 All primers used in this study

1.4 qRT-PCR

使用SYBR?Green qPCR Mix試劑盒，在CFX96 Real-Time PCR Dectection System中進(jìn)行qRT-PCR。每個(gè)樣品3次重復(fù)，以β-actin作為內(nèi)參基因。以團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期胚胎的cDNA為模板，參照下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：模板cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL；SYBR?Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，39個(gè)循環(huán)；72℃5 min。結(jié)果通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算cdc20的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（n=3）表示，用GraphPad Prism 8軟件作圖。采用單因素方差分析方法（ANOVA）和Duncan’s檢測(cè)mRNA表達(dá)水平的差異，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。

1.5 性腺組織切片H.E染色及觀察

團(tuán)頭魴的性腺組織用4%PFA（DEPC水處理）固定后送武漢賽維爾公司做切片，依次將切片進(jìn)行如下操作：二甲苯洗2次，每次20 min；無(wú)水乙醇洗2次，每次10 min；95%乙醇5 min；90%乙醇5 min；80%乙醇5 min；70%乙醇5 min；蒸餾水沖洗后，蘇木素染色3～8 min，自來(lái)水洗；1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗；0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗；伊紅染液中染色1～3 min；將切片放入95%乙醇洗2次，每次5 min；無(wú)水乙醇洗2次，每次5 min；二甲苯洗2次，每次5 min，切片拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。以上操作完成后于顯微鏡（Leica，DFC550）下觀察。

1.6 切片原位雜交

以團(tuán)頭魴cdc20cDNA序列作為模板，設(shè)計(jì)探針引物（表1），在反向引物的5′端加上T7啟動(dòng)子序列，并參照下列反應(yīng)體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄：DNA模板1 μg，10×transcription buffer 2 μL，T7/SP6 RNA 聚合酶2 μL，DIG-NTP Mix 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RNase-free水加至20 μL；體系混勻后，37℃水浴4 h后完成體外轉(zhuǎn)錄，合成的探針大小為342 bp。利用石蠟切片進(jìn)行原位雜交，具體如下：二甲苯洗5次，每次5 min；二甲苯∶無(wú)水乙醇（體積比）=1∶1洗2次，每次3 min；無(wú)水乙醇洗2次，每次3 min；依次用95%、90%、85%、75%、50%乙醇各洗1次，每次3 min；85℃DEPC水洗3 min；滴加65℃預(yù)熱的預(yù)雜交液，預(yù)雜交1～2 h；然后將5 ng/μL探針滴加到組織塊上，放入濕盒，65℃雜交過(guò)夜；用2×SSCT 65℃清洗切片2次，每次30 min；0.2×SSCT 65℃清洗切片15 min，50%甲酰胺/2×SSCT 65℃清洗切片2次，每次30 min；用5%的羊血清封閉1～2 h；二抗（Anti-Digoxigenin-AP）室溫孵育 1.5 h；滴加 BCIP/NBT（1 mL平衡液加4.5 μL NBT和3.5 μL BCIP）染色；顯色完成后置于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 團(tuán)頭魴cdc20基因的分子特征和進(jìn)化分析

通過(guò)PCR測(cè)序及生物信息學(xué)分析證實(shí)團(tuán)頭魴cdc20編碼區(qū)的基因組長(zhǎng)3 960 bp，包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，cDNA長(zhǎng)1 482 bp，編碼493 aa；預(yù)測(cè)蛋白的理論分子質(zhì)量為5.44 ku，等電點(diǎn)為7.68。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示（圖1），團(tuán)頭魴C(jī)dc20與鯉和斑馬魚(yú)的相似度分別高達(dá)95.74%和90.12%，與大鼠、人類(lèi)和非洲爪蟾的相似度分別為59.96%、59.36%和63.58%。結(jié)構(gòu)域分析顯示Cdc20有7個(gè)WD40重復(fù)基序，且該基序在不同物種中都相對(duì)保守，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)每個(gè)WD40基序形成4股反向平行β折疊，7個(gè)WD40基序構(gòu)成穩(wěn)定的7葉螺旋槳狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1 團(tuán)頭魴C(jī)dc20蛋白的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of Cdc20 proteins of Megalobrama amblycephala

圖2 團(tuán)頭魴C(jī)dc20蛋白預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Predicted structure model of M.amblycephala Cdc20 protein

基于多個(gè)物種Cdc20氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，團(tuán)頭魴與鯉的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最近，其次是斑馬魚(yú)。而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)形成一個(gè)獨(dú)立分支（圖3）。

圖3 脊椎動(dòng)物CDC20蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis of the protein sequences of CDC20 in vertebrates

2.2 團(tuán)頭魴cdc20在成魚(yú)各組織和胚胎發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)

通過(guò)sqRT-PCR檢測(cè)cdc20基因在團(tuán)頭魴成魚(yú)不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示，cdc20mRNA在腦、鰓、心臟、脾臟、腸道、腎臟和肌肉中有微弱的表達(dá)，而在卵巢和精巢中表達(dá)量最高，說(shuō)明cdc20可能與團(tuán)頭魴性腺發(fā)育有關(guān)。

圖4 團(tuán)頭魴cdc20基因在成魚(yú)各組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of cdc20 gene in different tissues of M.amblycephala

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)cdc20在團(tuán)頭魴各發(fā)育階段胚胎中的表達(dá)情況，包括受精卵、2-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)期、體節(jié)期、心跳期和孵化期。結(jié)果（圖5）顯示該基因在受精卵中的表達(dá)水平最高，隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，推測(cè)團(tuán)頭魴cdc20可能是1個(gè)母源基因，對(duì)維持胚胎的早期發(fā)育具有重要作用。

圖5 團(tuán)頭魴cdc20基因在胚胎發(fā)育各時(shí)期中的表達(dá)Fig.5 Expression of cdc20 gene at different embryonic development stages of M.amblycephala

2.3 團(tuán)頭魴cdc20在生殖細(xì)胞中的表達(dá)模式

根據(jù)團(tuán)頭魴性腺切片原位雜交的結(jié)果（圖6），cdc20基因在Ⅰ期卵母細(xì)胞信號(hào)最弱。卵母細(xì)胞進(jìn)入Ⅱ期后，其表達(dá)量開(kāi)始升高，且在卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，而在皮質(zhì)泡和細(xì)胞核中幾乎沒(méi)有表達(dá)。而在Ⅲ期卵母細(xì)胞的卵黃顆粒中檢測(cè)到了強(qiáng)烈的探針信號(hào)，但細(xì)胞核中信號(hào)較弱。Ⅳ期卵母細(xì)胞中充滿(mǎn)了卵黃顆粒，觀察不到細(xì)胞核和皮質(zhì)泡，cdc20基因在Ⅳ期卵母細(xì)胞的卵黃顆粒中表達(dá)，而在放射帶幾乎不表達(dá)。與H.E染色（圖7A）對(duì)比，基于精巢切片原位雜交的結(jié)果顯示，在精原細(xì)胞以及生精小管的生殖上皮中該基因的表達(dá)量最高，而在成熟精子中的表達(dá)量低（圖7B）。

圖6 cdc20基因在團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期卵母細(xì)胞中的表達(dá)Fig.6 Expression of cdc20 gene at different development stages of M.amblycephala oocytes

圖7 團(tuán)頭魴cdc20基因在精巢中的表達(dá)Fig.7 Expression of cdc20 gene in testis of M.amblycephala

3 討論

CDC20蛋白通過(guò)C端的WD40結(jié)構(gòu)域（即WD40基序）識(shí)別、激活和結(jié)合APC/C調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂中姐妹染色體的分離[8]，被認(rèn)為是生殖細(xì)胞成熟的重要調(diào)節(jié)因子[9]，在生物體生長(zhǎng)和生殖中發(fā)揮重要作用。WD40蛋白最早在牛的G蛋白β亞基中發(fā)現(xiàn)[10]，該蛋白的7個(gè)WD40基序形成穩(wěn)定的螺旋槳狀結(jié)構(gòu)[11]，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色質(zhì)組裝、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程[12]。本研究發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴C(jī)dc20包含的7個(gè)WD40基序可形成7葉螺旋槳狀結(jié)構(gòu)，這種特殊的結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的支架，為蛋白質(zhì)的識(shí)別和組裝提供位點(diǎn)，并增強(qiáng)蛋白之間的互作[12]。氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域的保守性說(shuō)明團(tuán)頭魴cdc20基因可能與在小鼠、人類(lèi)中的功能相類(lèi)似，參與了細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂和減數(shù)分裂的過(guò)程。

本研究還發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴cdc20主要在性腺中表達(dá)。類(lèi)似地，有研究發(fā)現(xiàn)cdc20基因在斑馬魚(yú)性腺中高表達(dá)，且對(duì)斑馬魚(yú)卵子和精子發(fā)生過(guò)程具有重要作用[13]。在其他物種中，該基因同樣與生殖相關(guān)。小鼠CDC20蛋白表達(dá)量的降低導(dǎo)致雌性失去生殖能力[5]，人類(lèi)CDC20基因發(fā)生突變導(dǎo)致女性不孕[6]和男性無(wú)精子癥[7]。因此，我們推測(cè)團(tuán)頭魴cdc20基因可能參與生殖和性腺發(fā)育。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢成熟過(guò)程中，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，該基因的表達(dá)量逐漸升高，這與在豬卵母細(xì)胞中的表達(dá)一致[14]。而精巢切片的原位雜交結(jié)果與卵巢相反，cdc20在精原細(xì)胞中的表達(dá)量最高，而在發(fā)育成熟的精子中表達(dá)量最低。這些研究結(jié)果說(shuō)明，cdc20基因可能在團(tuán)頭魴卵巢和精巢中發(fā)揮的功能不同，在卵巢中可能參與卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程，而在精巢中對(duì)精原細(xì)胞早期的形成具有重要作用。

此外，團(tuán)頭魴cdc20在胚胎發(fā)育早期大量表達(dá)，然后逐漸下降，因此推測(cè)該基因是一個(gè)母源基因，對(duì)早期胚胎發(fā)育具有重要意義，包括激活卵子、促進(jìn)早期的卵裂、促進(jìn)合子基因的表達(dá)等[15]。在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中的研究發(fā)現(xiàn)，CDC20蛋白與APC/C復(fù)合物結(jié)合后參與母源因子卵母細(xì)胞成熟蛋白（oocyte maturation proteins，OMA）介導(dǎo)的卵母細(xì)胞到早期胚胎發(fā)育的過(guò)程[16]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道APC/C復(fù)合物是一個(gè)母源因子[17]，而APC/C復(fù)合物的激活需要CDC20蛋白，由此推測(cè)CDC20蛋白存在于胚胎發(fā)育的早期。這些結(jié)果說(shuō)明團(tuán)頭魴cdc20可能是1個(gè)母源基因。

綜上，本研究克隆并分析了團(tuán)頭魴cdc20基因的序列特征及其時(shí)空表達(dá)模式，結(jié)果可為后續(xù)深入研究該基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。