陳美佳 呂福通 黃 霈 趙 綺

(廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院檢驗科優(yōu)生遺傳實驗室，南寧市 530021，電子郵箱：48174994@qq.com)

人類染色體檢測中，經常可見到個別染色體上的微小變異，表現為同源染色體大小、形態(tài)或著色等方面的變異，這些變異區(qū)域一般位于遺傳上不活躍的含高度重復DNA序列的異染色質區(qū)。9號染色體異染色質區(qū)的改變包括9號染色體臂間倒位和次縊痕的增加或減少，其中9號染色體臂間倒位的發(fā)生率約為1%[1]。9號染色體異態(tài)性攜帶者的外貌、智力與生長發(fā)育基本正常，但目前9號染色體異態(tài)性與生育結局的相關性爭議較多。有學者認為9號染色體異態(tài)性屬于正常變異，不會影響生育[1-2]；也有研究表明9號染色體異態(tài)性會產生不良的遺傳效應[3-4]。本文探討不孕不育或不良妊娠結局患者的9號染色體異態(tài)性類型及其與生育結局的關系，旨在為生育指導和遺傳咨詢、改善生育結局提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2020年12月在我院進行遺傳咨詢并行外周血染色體檢測的8 030例不孕不育或不良妊娠結局的患者作為研究對象。其中男性6 860例，平均年齡36.5歲，女性1 170例，平均年齡31.0歲。不孕不育的診斷標準：已婚夫婦未采用避孕措施達1年以上仍未生育者。不良妊娠結局的定義：不明原因的自然流產、胚胎停止發(fā)育、死胎、死產、難產、胎兒畸形或胎兒發(fā)育不良等非正常妊娠結局。均由專科醫(yī)生排除男女雙方存在生殖器官的器質性病變，以及內分泌疾病、免疫和感染等因素。本研究經廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(KY-LW-2020-1號)。向研究對象詳細介紹本研究的具體內容、可能的受益和風險后，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 外周血淋巴細胞培養(yǎng)基、秋水仙素(廣東達輝生物技術有限公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)。Olympus CX21型顯微鏡(日本Olympus公司)、上海北昂醫(yī)療技術有限公司的醫(yī)學圖像分析識別系統(版本號：BEION V 4.20)。

1.3 研究方法 (1)采血與接種：常規(guī)消毒研究對象肘部的皮膚，抽取2 mL肘靜脈血至肝素鈉抗凝管中，將0.5 mL抗凝血接種至外周血淋巴細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。(2)外周血淋巴細胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)69～72 h。(3)細胞收集：培養(yǎng)完成前30 min加入2滴100 μg/mL的秋水仙素進行阻斷分裂以收集中期細胞。將培養(yǎng)液放入離心管內，1 500 r/min離心10 min，棄上清液；加入5 mL 0.075 mol/L的氯化鉀固定液，在37 ℃水浴中低滲30 min；使用2 mL甲醇：冰醋酸(3 ∶1)配置的固定液預固定5 min；1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入8 mL固定液后1 500 r/min離心10 min，棄上清液，再重復上述固定操作2次。(4)滴片：1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加1～2 mL固定液，混勻制成細胞懸液，將2～3滴細胞懸液分散滴在洗凈的冰凍玻片上，自然晾干。(5)烤片：將玻片置于70 ℃～80 ℃烤箱內烤片2.5 h。(6)G顯帶消化與染色：烤片后第2天，在37 ℃水浴箱中用0.5%的胰蛋白酶消化，放入吉姆薩染液內染色，染色完成后取出玻片，自然晾干后即可鏡檢。(7)染色體核型分析：用染色體分析軟件(上海北昂公司，版本：V4.20)進行染色體核型分析。每份標本在油鏡下計數30個分裂相，分析10個染色體核型，對異常者加倍計數和核型分析，并按照《人類細胞基因組學國際命名體系》(ISCN2016)[5]的規(guī)定對結果進行描述，有高度重復DNA序列的區(qū)域為異染色質區(qū)，染色體異常檢測結果均由2名遺傳學專家進行分析與復核。

2 結 果

8 030例不孕不育或不良妊娠結局患者中，共檢出9號染色體異態(tài)性攜帶者118例，占1.47%。其中9號染色體臂間倒位共97例，占全部患者的1.21%，占9號染色體異態(tài)性攜帶者的82.20%，核型均為inv(9)(p12;q13)；9號染色體次縊痕增加(核型為9qh+)20例，占9號染色體異態(tài)性攜帶者的16.95%；9號染色體次縊痕減少(核型為9qh-)1例，占9號染色體異態(tài)性攜帶者的0.85%。見表1。

表1 不同生育結局患者的9號染色體異態(tài)性類型

3 討 論

染色體倒位是指一條染色體內同時發(fā)生兩處斷裂而形成的3個片段，翻轉180°后重新連接形成一條重排染色體，倒位發(fā)生在長臂和短臂之間稱為臂間倒位。臂間倒位以9號染色體最為常見[6]，9號染色體臂間倒位在國外人群中的發(fā)生率為0.95 %～1.02 %，在國內人群中的發(fā)生率約為1%[7-8]。本研究在8 030例不孕不育或不良妊娠結局的受檢者中，檢出9號染色體異態(tài)性攜帶者共118例，檢出率為1.47%，其中9號染色體臂間倒位的檢出率最高，為1.21%，較一般人群[7-8]略高。目前有關9號染色體臂間倒位區(qū)帶的研究較多，Starke等[9]報告9號染色體臂間倒位斷裂熱點區(qū)域位于9p12或9q13-21.1，本研究檢出的9號染色體臂間倒位斷裂位點均發(fā)生在9p12與9q13之間，說明9號染色體的這段區(qū)域易發(fā)生斷裂。有文獻報告9號染色體pter到q12片段上存在松弛素基因，而松弛素可影響女性卵泡的成熟過程，也影響男性的精子運動和穿卵能力；9號染色體臂間倒位產生的位置效應可能會影響松弛素基因的表達，從而導致生殖障礙[7]，當臂間倒位發(fā)生在9q12遠端時對生育的影響尤其明顯[10]。本研究中有41例不孕不育患者、56例不良妊娠結局患者檢出9號染色體臂間倒位，倒位均發(fā)生在9q12的遠端區(qū)域，但未檢測9號染色體臂間倒位攜帶者是否有松弛素基因表達異常，今后仍需進一步研究。

9號染色體臂間倒位與不孕不育、不良妊娠結局的關系一直有爭議。有文獻顯示，9號染色體臂間倒位與生育結局異常沒有直接關系，屬于遺傳學多態(tài)性[1-2]。但也有學者報告，9號染色體臂間倒位在不孕不育或不良妊娠結局人群中的檢出率較高[3-4]，9號染色體臂間倒位可干擾減數分裂時同源染色體的配對或造成其他染色體的配對異常，從而引起臨床效應[11]。9號染色體的倒位重排還可能導致部分基因的順序發(fā)生改變，影響基因的正常表達，表現為胚胎發(fā)育異常或不孕不育[7]。然而，9號染色體的臂間倒位是否對生育結局有影響，筆者認為應該從發(fā)生臂間倒位的區(qū)帶判斷：若9號染色體臂間倒位發(fā)生在異染色質區(qū)內，如9q12的次縊痕區(qū)，由于該區(qū)域為高度重復的DNA序列，不編碼主要遺傳信息，因此該區(qū)域發(fā)生的臂間倒位不屬于結構異常，理論上對患者的表型、智力、生長發(fā)育不會造成嚴重的影響。但如果9號染色體臂間倒位發(fā)生在異染色質區(qū)外，由于這種異常屬于染色體的結構異常，這類倒位染色體在減數分裂時形成倒位環(huán)，正常的染色體和倒位的染色體之間發(fā)生交叉互換，導致配子染色體上某一片段缺失或重復，此時其遺傳效應主要取決于重復或缺失片段的長短及其所含基因的致死效應，倒位片段越短，則重復或缺失片段就越長，其配子和合子正常發(fā)育的可能越小，臨床表現為不孕不育、流產、死胎等癥狀[12]。

目前，在傳統的細胞遺傳學層面上，一般采用G顯帶技術結合C顯帶技術對9號染色體異態(tài)性進行分析，但該方法受細胞遺傳水平的核型分辨率及操作者人為主觀因素的影響，定位并不完全準確，難以明確區(qū)分9號染色體臂間倒位是否涉及異染色質區(qū)外。Starke等[9]發(fā)現9號染色體臂間倒位主要發(fā)生在9q13-21.1，國內也有學者報告9號染色體臂間倒位片段多定位于p11及q12遠端[10]，這都表明了9號染色體臂間倒位發(fā)生在異染色質區(qū)外的情況不容忽視。采用G顯帶技術進行分析時，對于5M以下的變異難以用肉眼判別，因此也不能完全排除9號染色體發(fā)生臂間倒位的同時斷裂位點周圍是否存在基因突變或微小缺失和重復等情況，需要通過基因測序等分子檢測技術進一步鑒定，以明確9號染色體不同位點的斷裂及其與臨床表現的相關性，從而更好地進行生育指導和遺傳咨詢。由此推斷，目前眾多文獻報告的9號染色體臂間倒位所涉及的斷裂點可能在異染色質區(qū)外，應考慮為結構異常或基因變異，這或可為9號染色體臂間倒位攜帶者表現出不同臨床癥狀的結論提供合理的解釋。

9號染色體次縊痕區(qū)為染色體長臂上凹陷縮窄的異染色質區(qū)，該區(qū)域為高度重復的非編碼DNA序列，次縊痕部位的DNA松散，容易自發(fā)和誘發(fā)斷裂，其增加或減少可導致次縊痕的增加或減少，從而干擾染色體的運動和分離，造成減數分裂過程中同源染色體配對困難或分離異常，進而影響配子的形成，導致不孕不育或自然流產等不良生育結局[12]。此外，有研究報告次縊痕區(qū)大量重復的DNA可能會導致在胚胎早期調控細胞分化的基因發(fā)生異?；騽┝啃?，從而造成有絲分裂錯誤，最終導致不孕不育、胚胎停育或自然流產等臨床結局[13]。Minocherhomji等[14]研究發(fā)現，原發(fā)性不孕不育患者的9號染色體次縊痕增加檢出率升高，提示9號染色體次縊痕增加與不孕不育有關；王桂玲等[15]報告復發(fā)性流產者9號染色體次縊痕增加的檢出率明顯升高，提示9號染色體異態(tài)性與復發(fā)性流產可能存在相關性。但也有學者認為9號染色體次縊痕的增加或減少屬于正常的染色體變異，不會導致不孕不育或不良妊娠結局[16]?？梢?，對于9號染色體次縊痕增加或減少與生育結局的相關性，目前尚無統一定論，本研究中共檢出9號染色體次縊痕增加20例，其中17例出現不良妊娠結局、3例臨床表現為不孕不育；檢出9號染色體次縊痕減少1例，為有不良妊娠結局的患者。但由于本研究缺乏對正常生育人群9號染色體次縊痕增加或減少發(fā)生率的研究，加之9號染色體次縊痕減少的患者樣本量少，因此僅能得出次縊痕變化可能存在潛在臨床效應的結論，今后仍需擴大樣本進一步研究。

綜上所述，不孕不育、不良妊娠結局患者中9號染色體異態(tài)性中臂間倒位的發(fā)生率較高，其對生育結局的影響取決于發(fā)生倒位的區(qū)帶，不能一概而論歸為正常的多態(tài)性變異。由于染色體核型分析技術的局限性，以及各實驗室人員對斷裂位點的判斷不統一，9號染色體臂間倒位是否會引起不良的遺傳效應，如造成不孕不育、自然流產、胚胎停育等，仍需要更多的實驗數據驗證，并結合細胞與分子技術手段進一步研究。9號染色體次縊痕增加或減少可能存在潛在的臨床效應，也需進一步研究證實。若能進一步研究正常生育人群與9號染色體異態(tài)性攜帶者生殖細胞減數分裂和胚胎形成過程中染色體的變化情況，可為探討9號染色體異態(tài)性對生育結局的影響提供更多的參考。