朱珊珊 汪 洋 張 奇 秦路平 張巧艷

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病，發(fā)病率0.3%～1.5%。RA 的臨床表現(xiàn)為手腕、足踝等關(guān)節(jié)部位的對(duì)稱性疼痛、腫脹和畸形，后期進(jìn)展為血管炎、神經(jīng)病變甚至是多器官功能障礙[1-2]。臨床上常用抗炎、抗風(fēng)濕藥物及生物制劑，如非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤和腫瘤壞死因子α 抑制劑、B 細(xì)胞抑制劑等治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但長期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生肝腎功能損傷等不良反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致病情反復(fù)和加重疾病發(fā)展，存在一定的局限性[3]。畬族人聚居于福建及浙江麗水等地，氣候潮濕，RA 的患病率較高，而畬醫(yī)藥對(duì)RA 也有其獨(dú)特的治療方法。畬藥黃荊條是馬鞭草科植物牡荊Vitex negundo L.var.cannabifolia（Sieb.et Zucc.）Hand.-Mazz 的根或葉。在畬醫(yī)藥理論體系中黃荊條屬于陽藥，味微苦，辛、溫。黃荊條含有木脂素類、黃酮類和萜類等成分，研究表明，黃荊條的主要黃酮類成分牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有緩解作用，具有確切的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用[4]；黃荊條的黃酮類成分紫花牡荊素可劑量依賴性地抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠后足爪的腫脹度，顯著降低致炎性細(xì)胞因子的水平，提高抗炎性細(xì)胞因子的水平[5]。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子生物學(xué)驗(yàn)證探索畬藥黃荊條中的黃酮類成分抗RA 的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試 劑 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（luteolin，LUT，批號(hào)C19N10Q104574，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)9048-46-8），美國Gibico 公司；DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibico 公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號(hào)12190801），美國SIGMA 公司；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)011020201014），上海碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)070721211202），上海碧云天生物科技有限公司；CCK8溶液，上海碧云天生物科技有限公司；MMP9 抗體（批號(hào)ZP2808BP08①），上海博士德生物工程有限公司；GAPDH Rabbit 抗體（批號(hào)2118S），COX-2 Rabbit（批號(hào)12282S），AKT1 Rabbit（75692S），HRP Rabbit（批號(hào)7074S），均購于Cell Signaling Techno-logy。黃荊條醇提物（HJT-E）2 g/mL 及水提物（HJT-W）2 g/mL（以生藥量計(jì)）由麗水市人民醫(yī)院中藥實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀 器 1510 型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）科技有限公司；ST 16R 高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾（上海）科技有限公司ECLIPSE TS-100F 型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海百基生物科技有限公司；GD50202 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，莫納生物科技有限公司；DHG-9123A 型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 黃荊條黃酮類成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“黃荊條”或“牡荊”為關(guān)鍵詞在中國知網(wǎng)、萬方、維普及TCMSP 中檢索篩選黃荊條的黃酮類成分，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索各化合物對(duì)應(yīng)的SMILES 號(hào)，分別導(dǎo)入Swiss ADME 平臺(tái)進(jìn)行藥物相似性預(yù)測(cè)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，設(shè)置物種為Homo sapiens，以Probability*＞0 為條件篩選化學(xué)成分的靶基因，獲得黃荊條黃酮類活性成分合集及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)合集。

1.4 RA 治療靶點(diǎn)的獲取與篩選 以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞在Genecards（http://www.genecards/）和CTD（http://ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)靶點(diǎn)。以Relevance score≥10 為條件對(duì)Gene cards中獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選作為RA 治療靶點(diǎn)；對(duì)CTD中獲得的靶點(diǎn)以Inference Score 從大到小排序，選取排名前200 位作為RA 治療靶點(diǎn)[6]。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫所得到的靶基因進(jìn)行歸納整理，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，獲得RA 治療靶點(diǎn)合集。運(yùn)用Funrich 軟件將黃荊條黃酮類活性成分靶點(diǎn)合集與RA 治療靶點(diǎn)合集進(jìn)行映射，獲得活性成分-RA 共同靶點(diǎn)，并繪制Venn 圖。

1.5 活性成分-RA 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將黃荊條黃酮類活性成分合集和活性成分-RA 共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行歸納整理，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建黃荊條的活性成分-RA 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 靶點(diǎn)蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將黃荊條的活性成分-RA 靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型，設(shè)置物種為Homo sapiens，最低相互作用閾值（medium confidence）為0.4，獲得蛋白相互作用關(guān)系。將結(jié)果進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape 3.7.3 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，并?gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用R 軟件中的clusterProfiler、enrichplot、ggplot2 等包及自編的R 語言對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中參與相互作用的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 功能和KEGG 信號(hào)通路富集分析。GO 富集分析包括了基因的生物學(xué)過程，細(xì)胞組分和分子功能。KEGG 富集分析研究靶點(diǎn)參與的主要信號(hào)通路，物種均設(shè)為“Homo sapiens（人類）”，分別選取前20 條條目繪制氣泡圖（不足20 條的全部選?。?。整理獲得的靶點(diǎn)和信號(hào)通路，運(yùn)用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)模型。

1.8 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 單核巨噬細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）接種于含10% FBS、100 U/mL青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，然后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，給藥前用含10 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基刺激4 h。

1.8.2 HJT 及LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響 取1.8.1 項(xiàng)下培養(yǎng)的細(xì)胞，加入終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL 的HJT-W 和HJT-E，及2.5、5、10、20、40、80 μM 的LUT。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，450 nm 下測(cè)定吸光度（OD）值。

1.8.3 HJT-E 及LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NO 生成的影響 取1.8.1 項(xiàng)的細(xì)胞加入終濃度分別為12.5、25、50 μg/mL 的HJT-E，及2.5、5、10 μM的LUT，孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)NO 檢測(cè)試劑盒操作步驟測(cè)定各組細(xì)胞NO 的生成。

1.8.4 HJT-E 及LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 取1.8.3 項(xiàng)下經(jīng)HJT-E 及LUT 干預(yù)后培養(yǎng)24h 的細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取蛋白，并用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后，-40℃保存用于Western blot 實(shí)驗(yàn)。蛋白表達(dá)量用各目的蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 26.0 進(jìn)行分析，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析處理比較完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)；兩組間相互比較：滿足方差齊性時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)，不滿足方差齊性時(shí)采用T2檢驗(yàn)；采用雙側(cè)檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃荊條黃酮類成分篩選及靶點(diǎn)篩選 通過檢索各文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫并通過Swiss ADME 平臺(tái)預(yù)測(cè)共獲得潛在黃荊條黃酮類活性成分31 個(gè)，通過Swiss Target Prediction 對(duì)各成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共獲得存在靶點(diǎn)的活性成分30 個(gè)，按Mol-1 至Mol-30 進(jìn)行命名（表1）；共獲得活性成分靶點(diǎn)2103 個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后最終獲得309 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 黃荊條黃酮類活性成分

2.2 黃荊條黃酮類活性成分治療RA 靶點(diǎn)的獲取通過Genecards 和CTD 檢索RA 治療靶點(diǎn)，篩選整理后共獲得RA 治療相關(guān)基因455 個(gè)。應(yīng)用Funrich 對(duì)活性成分靶點(diǎn)合集與RA 治療靶點(diǎn)合集進(jìn)行映射取交集后，共獲得50 個(gè)交集基因（見圖1），即黃荊條黃酮類活性成分治療RA 的潛在作用靶點(diǎn)，并獲得可作用于該50 個(gè)基因的25 個(gè)潛在作用成分。

圖1 黃荊條黃酮類成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)Venn 圖

2.3 黃荊條黃酮類活性成分-抗RA 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)2.2 項(xiàng)下分析得到的潛在作用靶點(diǎn)及靶點(diǎn)與活性成分之間的關(guān)系，應(yīng)用cytoscape 軟件構(gòu)建活性成分-抗RA 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。如圖2 所示，網(wǎng)絡(luò)中包含75 個(gè)節(jié)點(diǎn)及395 條邊，其中25 個(gè)紅色方形節(jié)點(diǎn)表示黃荊條黃酮類活性成分，50 個(gè)綠色圓圈節(jié)點(diǎn)表示RA 靶點(diǎn)，395 條邊代表了活性成分與RA 靶點(diǎn)間的相互作用。各活性成分按度值大小進(jìn)行排序，選取排名靠前8 個(gè)活性成分并篩選相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)構(gòu)建黃荊條黃酮類活性成分-抗RA 靶點(diǎn)的核心網(wǎng)絡(luò)。如圖3所示，網(wǎng)絡(luò)中包含43 個(gè)節(jié)點(diǎn)和173 條邊，其中活性成分節(jié)點(diǎn)8 個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)35 個(gè)。所涉及的活性成分為Mol-7、Mol-10、Mol-14、Mol-1、Mol-16、Mol-19、Mol-28、Mol-30，這些成分可能是黃荊條治療RA 的關(guān)鍵性活性成分。

圖2 黃荊條黃酮類成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 黃荊條黃酮類成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的核心網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?黃荊條黃酮類活性成分治療RA 的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)中初步構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出互作數(shù)據(jù)，整理后應(yīng)用Cytoscape 軟件繪制成一個(gè)包含501 個(gè)節(jié)點(diǎn)和407 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖A。應(yīng)用CytoNCA（Version 2.1.6）插件，以Degree 值（DC）＞17 進(jìn)行第一次篩選，得到一個(gè)包含18 個(gè)節(jié)點(diǎn)和138 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，再以Betweenness（BC）值＞1.67 進(jìn)行2 次篩選，得到一個(gè)10 個(gè)節(jié)點(diǎn)和45 條邊的PPI 核心網(wǎng)絡(luò)圖B，其過程見圖4。第二次篩選后得到PPI 核心網(wǎng)絡(luò)圖C 中包含10個(gè)蛋白基因，包括CASP3、MMP9、PTGS2、AKT1、TP53 等，這些靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切，可能在治療RA 的過程中占據(jù)重要地位。

圖4 黃荊條黃酮類成分防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰣D

2.5 GO 分類與KEGG 富集分析結(jié)果 應(yīng)用R 軟件對(duì)經(jīng)2 次篩選后得到的PPI 核心網(wǎng)絡(luò)圖C 中的10個(gè)蛋白基因進(jìn)行GO 分類富集分析，結(jié)果見圖5，共獲得GO 條目1297 條（P＜0.05），其中BP 條目1223條，CC 條目7 條，MF 條目67 條，以P 值排序，選取排名前20（不足20 條的全部顯示）的路徑（見圖5），繪制氣泡圖。結(jié)果顯示，生物學(xué)過程主要涉及活性氧類代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織等；細(xì)胞成分主要涉及分泌顆粒內(nèi)腔、胞質(zhì)囊腔、囊腔等；分子功能主要涉及金屬內(nèi)肽酶活性、金屬蛋白酶活性、內(nèi)肽酶活性等。這些結(jié)果表明黃荊條黃酮類成分通過調(diào)控多種生物學(xué)過程發(fā)揮治療RA 的作用。

圖5 黃荊條黃酮類活性成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)GO 分類富集結(jié)果

KEGG 通路分析共獲得KEGG 通路（P＜0.05）118條，結(jié)果見圖6，關(guān)鍵基因涉及的通路主要有AGERAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等，涉及了細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、遷移等功能，表明黃荊條黃酮類活性成分通過作用于多條信號(hào)通路發(fā)揮治療RA 的作用。

圖6 黃荊條黃酮類活性成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)KEGG 富集結(jié)果

2.6 靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)模型 將排名前20 的KEGG 信號(hào)通路及相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)。如圖7 所示，網(wǎng)絡(luò)中共包含53 個(gè)節(jié)點(diǎn)和171 條邊，其中20 個(gè)黃色菱形為信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)，33 個(gè)綠色圓形為靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，結(jié)果表明黃荊條黃酮類活性成分是通過多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路共同起到治療RA 的作用。該網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)為AKT1、CASP3、MAPK14、BCL2、TP53 等，分別調(diào)控了多條信號(hào)通路，表明該5 個(gè)靶點(diǎn)在黃荊條黃酮類活性成分治療RA 的過程中起到了重要的作用。

圖7 黃荊條黃酮類活性成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)模型

2.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 以黃荊條提取物以及網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分木犀草素為關(guān)鍵成分代表，并選擇相關(guān)通路中相對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.7.1 HJT 及LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 增殖的影響 如圖8 所示，HJT-W 對(duì)LPS 刺激的RAW 264.7 細(xì)胞的增殖無顯著影響（P＞0.05）。HJT-E 的濃度為12.5、25 和50 μg/mL 時(shí)能顯著抑制LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；LUT 以劑量依賴性顯著抑制RAW264.7 細(xì)胞的增殖（P＜0.05），因此，選擇2.5、5 和10 μM 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖8 HJT 和LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞活力的影響（n=6，）

2.7.2 HJT-E 及LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NO 生成的影響 如圖9 所示，與空白組比較，LPS 刺激的模型組細(xì)胞產(chǎn)生NO 的含量顯著增加，LUT 和HJT-E 均以劑量依賴性方式抑制LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO，但只有高劑量有顯著性差異（P＜0.05）。

圖9 HJT-E 和LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NO 生成的影響（n=6，）

2.7.3 HJT-E 及LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 如圖10 所示，HJT-E 和LUT 給藥治療后，均能顯著抑制因LPS 刺激而表達(dá)增加的MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白，以高劑量結(jié)果最顯著（P＜0.05）。

圖10 HJT-E 和LUT 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞中MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討黃荊條黃酮類成分治療RA 的作用機(jī)制。通過黃荊條黃酮類活性成分抗RA 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，得到黃荊條中木犀草素、槲皮素、芹菜素、金合歡素等8 個(gè)化合物為抗RA 的活性成分。木犀草素可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠RANLRP3 炎性小體的表達(dá)，降低足跖內(nèi)Caspase-1、RANKL、VEGF 和HIF-1α 蛋白表達(dá)，增強(qiáng)骨組織內(nèi)骨保護(hù)素OPG 蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮骨關(guān)節(jié)保護(hù)作用[7]。槲皮素可通過抑制炎性細(xì)胞因子、抗氧化、清除氧自由基、免疫調(diào)節(jié)、抑制MMPs 和滑膜細(xì)胞增生等功能對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎發(fā)揮治療作用[8]。芹菜素可抑制CIA 小鼠Th1 型細(xì)胞功能亢進(jìn)及Th1/Th2 平衡，減緩RA 發(fā)生和進(jìn)展[9]。盡管本研究預(yù)測(cè)到金合歡素、艾黃素、5，4'-二羥基-6，7，8，3'-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黃酮及5，7，2'，5'-四羥基黃酮也為抗RA 的有效成分，但尚未發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確證。

基于黃荊條黃酮類活性成分、PPI 網(wǎng)絡(luò)及KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果，提示黃荊條黃酮類成分治療RA的核心靶點(diǎn)包括ALB、CASP3、MAPK14、PTGS2、AKT1、TNF 及MMP9 等。RA 主要病理特點(diǎn)為炎性細(xì)胞浸潤及關(guān)節(jié)炎癥損傷[10]。機(jī)體炎癥反應(yīng)引起干細(xì)胞損傷可造成白蛋白（ALB）合成減少，同時(shí)RA 患者腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平增加也使得機(jī)體蛋白分解增加[11]，導(dǎo)致RA 患者ALB 水平明顯降低[12]。ALB水平降低常導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，抗感染能力減弱[13]，加劇了RA 的發(fā)生和發(fā)展。CASP3 是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要基因，其表達(dá)下降導(dǎo)致細(xì)胞增生與凋亡失衡，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞的過度增生[14]。絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase14，MAPK14）是MAPK 通路的重要組成部分，阻斷MAPK 通路的激活，能夠抑制RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移與侵襲，減輕RA 的癥狀[15]。PTGS2 又稱COX-2，RA 患者滑膜組織COX-2 的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致PGE2 和炎癥因子產(chǎn)生，引起炎性細(xì)胞浸潤、滑膜組織異常增生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、退變。COX-2 抑制劑可減少PGE2 的合成，減輕RA 炎癥損傷，改善病情[16-19]。基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的功能為降解骨基質(zhì)和軟骨，其在關(guān)節(jié)成纖維滑膜細(xì)胞上高表達(dá)，使其侵襲力增強(qiáng)，導(dǎo)致骨基質(zhì)和軟骨的破壞[20]。高表達(dá)的MMP9 可與VEGF 協(xié)同刺激內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管再生和血管翳的形成，加劇了對(duì)軟骨的侵蝕破壞[21]。本研究結(jié)果顯示，黃荊條黃酮類成分可通過多靶點(diǎn)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡和抑制基質(zhì)降解酶活性等作用減輕RA 癥狀，減緩其發(fā)生發(fā)展。

GO 分類富集和KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，黃荊條黃酮類成分主要通過調(diào)控活性氧類代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、膠原分解代謝過程、活性氧代謝過程的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，通過AGERAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖等功能發(fā)揮治療RA 的作用。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，HJT-W 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞無增殖作用，而黃酮類成分主要存在于醇提物中，這與本文選擇黃酮類成分為研究對(duì)象相符。此外，HJT-E 及LUT 均能抑制MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白的表達(dá)來抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥的發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)了LUT 作為黃荊條黃酮類成分發(fā)揮抗RA 的關(guān)鍵成分，可作用于信號(hào)通路中多個(gè)炎癥因子發(fā)揮抗炎作用，與預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)的分子對(duì)接結(jié)果相互佐證，驗(yàn)證了本研究中系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果和預(yù)測(cè)分子機(jī)制的可靠性和準(zhǔn)確性。

總之，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)畬藥黃荊條中黃酮類成分木犀草素、槲皮素、芹菜素、金合歡素、艾黃素、5，4'-二羥基-6，7，8，3'-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黃酮及5，7，2'，5'-四羥基黃酮可能通過ALB、CASP3、MAPK14、PTGS2、AKT1、TNF 及MMP9等靶點(diǎn)，調(diào)控AGE-RAGE、IL-17、TNF、p53 和PI3KAkt 信號(hào)通路，抑制RA 滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，緩解炎癥反應(yīng)，最終發(fā)揮治療RA 的作用。