鮑斐斐 華 深 陳勇華

文獻(xiàn)報(bào)道，全球約有3.5 億抑郁癥患者，且預(yù)計(jì)到2030 年，抑郁癥患者在全球范圍內(nèi)已成為人類死亡的第二大疾患，且逐年呈遞增趨勢[1]。該病以悲觀失望、睡眠困難、自卑、記憶減退等為主要臨床癥狀，具有易發(fā)病、易致殘、易反復(fù)等特點(diǎn)。目前，臨床常采用西藥治療抑郁癥，但西藥具有不良反應(yīng)，且停藥后，易復(fù)發(fā)。槲皮素是一種天然的黃酮類物質(zhì)，具有抗血栓、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2]。貫葉金絲桃含有金絲桃苷、偽金絲桃素、金絲桃素等，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[3]。本研究探討槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物對脂多糖誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 7 周齡雄性清潔級C57BL/6 小鼠90只，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量（200±20）g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0003，動物使用許可證號：SCXK（渝）2018-0021，動物質(zhì)量合格證號：2020134617，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，設(shè)置溫度為23～25 ℃，濕度為50%～60%，自由進(jìn)食及飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，在浙江省立同德醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由鮑斐斐、華深、李曉一、陳勇華等共同參與實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中需嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要藥物 脂多糖（美國sigma 公司，批號L2880）；鹽酸氟西汀分散片（禮來蘇州制藥有限公司，批號7339A，分包裝批號7339AA）；貫葉金絲桃提取物（由我院實(shí)驗(yàn)室自制，每克含貫葉金絲桃素不低于1.61 mg，給藥制劑含貫葉金絲桃提取物不低于55%，批號0180518）。

1.3 儀器及試劑 自主活動實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號ZHZFT）；自動酶標(biāo)儀（華衛(wèi)德朗儀器有限公司，型號DR-200Bs）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf AG 公司，型號5427R）；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（新芝生物科技股份有限公司，型號scientz-IID）；槲皮素（美國sigma 公司，批號337951）；白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（北京方程生物科技有限公司，試劑批號MM-0670R22）；去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（NA）試劑盒（北京誠林生物技術(shù)有限公司，批號20170201、20170106）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥 90 只雄性C57BL/6 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組和槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組，各15 只。除對照組外，其余各組小鼠均單次注射1 mg/kg 脂多糖，制備抑郁模型[4]。采用曠場實(shí)驗(yàn)（OFT）[5]觀察是否制備成功。OFT：小鼠注射藥物12 h 后，放入測試箱正中格內(nèi)，適應(yīng)3 min，采用Anaze Y 軟件記錄小鼠5 min 內(nèi)穿格次數(shù)和運(yùn)動路程。

槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃，貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃，槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃，鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)給予21 d。給藥劑量參考文獻(xiàn)[6]。

2.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 對小鼠進(jìn)行禁食禁水20 h。在每個鼠籠里面放置清水和蔗糖水各100 mL，1 h 后取出，再次稱重，記錄剩余重量。糖水偏好值=糖水消耗量/（糖水消化量+清水消化量）×100%。

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 采用圓形水池（直徑120 cm），將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ個象限，將平臺放入水中，使平臺低于水面1 cm，目標(biāo)象限為第Ⅲ象限（平臺所在象限），水溫設(shè)置為21 ℃左右，用墨汁將水染成黑色。上述糖水偏好實(shí)驗(yàn)后，將小鼠根據(jù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ個象限的順序面朝池壁放入水中，對小鼠找到平臺所需時間（潛伏期）和所占目標(biāo)象限百分比進(jìn)行記錄。

2.4 小鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠斷頸取腦，將小腦去除后稱重腦組織，根據(jù)腦組織重量與預(yù)冷酸性正丁醇溶液按照1∶10 的比例放入電動玻璃勻漿機(jī)勻漿?；靹蚝箅x心取上漿液，IL-6、IL-10 水平采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，NE、NA 采用熒光分光光度計(jì)按熒光光度測定法測定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠糖水偏好比較 對照組及槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組小鼠糖水?dāng)z入量明顯高于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05）；槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組、槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組糖水?dāng)z入量均高于模型組（P 均＜0.05）；貫葉金絲桃提取物組糖水?dāng)z入量明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠糖水偏好比較（）

表1 各組小鼠糖水偏好比較（）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

3.2 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 對照組及槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組潛伏期明顯低于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P均＜0.05），所占目標(biāo)象限時間百分比明顯高于模型組、槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05）；槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組潛伏期明顯低于模型組（P 均＜0.05），所占目標(biāo)象限時間百分比明顯高于模型組（P 均＜0.05）；貫葉金絲桃提取物組潛伏期明顯低于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），所占目標(biāo)象限時間百分比明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（）

表2 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

3.3 各組小鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子水平比較 對照組與槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組腦組織IL-6水平明顯低于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05），IL-10 水平明顯高于模型組、槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05）；槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組IL-6 水平明顯低于模型組（P 均＜0.05），IL-10 水平明顯高于模型組（P 均＜0.05）；貫葉金絲桃提取物組IL-6 水平明顯低于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），IL-10 水平明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子水平比較（pg/g，）

表3 各組小鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子水平比較（pg/g，）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃；IL-6 為白介素-6；IL-10 為白介素-10；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

3.4 各組小鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平比較 對照組及槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組小鼠腦組織DA、NA 水平明顯高于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05），槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組小鼠腦組織DA、NA 水平均高于模型組（P 均＜0.05），貫葉金絲桃提取物組小鼠腦組織DA、NA 水平明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（ng/g，）

表4 各組小鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（ng/g，）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃；NE 為去甲腎上腺素；NA 為多巴胺；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

4 討論

槲皮素又稱櫟精，具有較強(qiáng)的自由基清除能力及抗氧化性，能夠捕獲自由基預(yù)防脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對腫瘤具有抑制作用，還具有較強(qiáng)的抗過敏、抗炎、抗菌等生物活性[7]。貫葉金絲桃是藤黃科植物貫葉金絲桃L.的干燥地上部分，其功效為消腫、清熱利濕、疏肝解郁。臨床常用于治療心胸郁悶、情志不暢及肝氣郁結(jié)等。藥理研究證實(shí)，貫葉金絲桃提取物具有顯著的抗抑郁成分，且抗炎鎮(zhèn)痛作用明顯[6]。胡甜等[8]研究結(jié)果顯示，槲皮素可有效縮短糖尿病小鼠逃避潛伏期，降低空腹血糖水平。本研究結(jié)果提示，槲皮素、貫葉金絲桃提取物及槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物均能夠促使抑郁小鼠糖水偏愛分?jǐn)?shù)明顯升高，縮短尋找平臺潛伏期的時間，增加所占目標(biāo)象限百分比，其中槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物效果更佳。表明槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物具有更明顯的抗抑郁作用。

IL-6、IL-10 等細(xì)胞炎癥因子在抑郁癥中發(fā)揮重要的作用。IL-6 可促使星形細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子生成，其在抑郁癥患者中呈高表達(dá)[9]。IL-10 對促炎性細(xì)胞因子具有抑制作用，可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其水平降低會促使抑郁癥的發(fā)生，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子水平上升，致使嚴(yán)重抑郁癥的發(fā)生[10]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素、貫葉金絲桃提取物及槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物能夠降低抑郁小鼠炎癥因子水平，其中槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物降低抑郁小鼠炎癥因子水平更明顯。

既研究證實(shí)，抑郁癥大鼠會導(dǎo)致海馬組織DA、NA 水平降低，提示抑郁癥與中樞NA 功能下降相關(guān)；另外，DA 通絡(luò)與情緒反應(yīng)密切相關(guān)，其水平降低與抑郁癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其水平越低，則抑郁癥狀越明顯[11]。貫葉金絲桃提取物對DA 在攝取具有抑制作用，神經(jīng)遞質(zhì)減少對突觸前膜的重吸收，致使神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放增加，從而能夠增加其在突觸間隙的濃度[7]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素、貫葉金絲桃提取物及槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物能夠升高抑郁小鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，具有抗抑郁的作用，其中槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物抗抑郁水平更明顯。

總之，槲皮素聯(lián)合貫葉金絲桃提取物能夠促使抑郁小鼠糖水偏愛分?jǐn)?shù)明顯升高，縮短尋找平臺潛伏期的時間，增加所占目標(biāo)象限百分比，減低炎癥細(xì)胞因子水平，增加單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)揮抗抑郁作用。