郭松波，謝三款，張嬌嬌，薛新新，龍代洲，陳禹锜，沈世明，韓興林，陳葉福

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.貴州釣魚臺國賓酒業(yè)有限公司，貴州 遵義 564501；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；4.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

醬香型白酒獨(dú)特的感官特征和風(fēng)味物質(zhì)組成，必然與其獨(dú)特的釀造工藝密切相關(guān)，即生產(chǎn)實(shí)踐的不斷優(yōu)化和總結(jié)得出的“12987”工藝和“四高兩長、一大一多”的工藝特征[1-3]?！耙荒晟a(chǎn)周期、兩次投料、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次流酒”最終呈現(xiàn)七個輪次的醬香型白酒原酒[4]。輪次酒作為醬香型白酒的基礎(chǔ)酒，是醬香型白酒工藝中重要的環(huán)節(jié)，其品質(zhì)的高低直接決定了醬香型白酒品質(zhì)的優(yōu)劣。已有研究報(bào)道，在醬香型白酒七個輪次酒中，第一、二輪次酒醬香味不突出，乙酸乙酯含量偏高，整體風(fēng)格偏向于清香型白酒[5]，而第三、四、五輪次酒具有醬香突出、香氣純正、酒體醇厚等特點(diǎn)，人們將第三、四、五輪次這種品質(zhì)優(yōu)的酒統(tǒng)稱為大回酒[6-7]。

在醬香型白酒輪次發(fā)酵和多輪次取酒過程中，由于季節(jié)變化、原輔料差異、工藝操作等[8-9]方面的不同，會導(dǎo)致酒醅的理化性質(zhì)和微生物演替發(fā)生變化[10-11]。微生物代謝作為白酒風(fēng)味物質(zhì)的重要來源，微生物的變化直接影響白酒風(fēng)味物質(zhì)形成[12-13]。因此，不同輪次酒在感官風(fēng)格上具有明顯不同[14]。實(shí)際生產(chǎn)中，監(jiān)測理化指標(biāo)的規(guī)律性變化是控制輪次酒風(fēng)味品質(zhì)的重要途徑[15-16]。已有研究表明醬香型大曲酒發(fā)酵過程中微生物數(shù)量、酒醅理化指標(biāo)以及白酒品質(zhì)之間有著密不可分的關(guān)系[17]。然而，關(guān)于輪次酒的研究多集中在感官差異方面，關(guān)于以風(fēng)味經(jīng)驗(yàn)控制為主的醬香型白酒輪次酒發(fā)酵機(jī)理缺乏研究。

本研究以醬香型白酒大回酒為研究對象，采用風(fēng)味組學(xué)和高通量測序等技術(shù)分析大回酒風(fēng)味物質(zhì)和大回酒酒醅中微生物組成，以及大回酒酒醅的理化、大回酒的風(fēng)味物質(zhì)和大回酒酒醅中微生物三者之間的關(guān)聯(lián)性，以揭示茅臺地區(qū)醬香大回酒潛在的輪次發(fā)酵機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒第三、四、五輪次酒醅和原酒：取自貴州省仁懷市某酒廠；乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、乙醛、乙縮醛等標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus600氣相色譜儀（gas chromatography，GC）（配火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））：美國Perkin Elmer公司；安捷倫1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析儀：美國Agilent公司；ICS-300離子色譜分析儀（配EG40淋洗液自動發(fā)生器、電導(dǎo)檢測器和Chromeleon6.80色譜工作站）：美國DIONEX公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)檢測

酒醅中水分、酸度、淀粉、還原糖等指標(biāo)的測定依據(jù)中國酒業(yè)協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》分析。

1.3.2 氣相色譜分析

醇類、醛類、酯類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)參考韓興林等[18]采用氣相色譜法進(jìn)行測定。毛細(xì)管柱選用CP-Wax 57 CB（50 m×0.25 mm×0.2 μm）。載氣為N2、H2和空氣，流速分別為1 mL/min、45 mL/min和450 mL/min，以10∶1分流比設(shè)定。進(jìn)樣量為1 μL。進(jìn)樣器溫度設(shè)置為240 ℃，升溫程序設(shè)置為：35 ℃保持6 min；以4 ℃/min升至60 ℃，繼續(xù)以6 ℃/min升至110 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升至205 ℃，保持13 min。同一酒樣進(jìn)行三次平行測定。

1.3.3 離子色譜分析

樣品中有機(jī)酸的檢測參考唐坤甜等[19]的方法，采用離子色譜法進(jìn)行檢測。色譜柱采用IonPac AS11-HC型分離柱（250mm×4mm），IonPacAG11-HC型保護(hù)柱（50mm×4mm），色譜條件：流動相為480mmol/LNaOH溶液等度淋洗60min，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量為25 μL，溫度為30 ℃。

1.3.4 基因組提取及高通量測序

酒醅中微生物基因組的提取依照說明書，采用試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）的方法進(jìn)行提取[20-21]。

天津諾和致源生物信息科技有限公司采用高通量測序（Illumina Miseq PE250）平臺對樣品進(jìn)行測序，細(xì)菌使用SILVA138數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，真菌使用Unit（v8.2）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，以上均使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序，測序策略PE250。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

每個樣品至少3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性差異以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）采用Canoco 4.5軟件。采用SPSS24.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，GraphPad Prism5.0軟件做柱形圖，Gephi0.9.1軟件做網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型白酒大回酒酒醅理化特征

對醬香型白酒三、四、五輪次酒醅的理化指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 大回酒酒醅理化指標(biāo)的測定結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of Dahui-jiu Jiupei

由表1可知，醬香型白酒第三、四、五輪次酒醅的理化特征：水分含量范圍為45.84%～47.75%，酸度范圍為3.05～3.33 mmol/10 g，淀粉含量范圍為26.85%～30.14%，還原糖含量為2.75%～3.03%。第四、五輪次酒醅在水分、酸度、淀粉和還原糖含量等理化指標(biāo)上與第三輪次酒醅均有顯著或極顯著性差異（P＜0.05）。第三、四、五輪次酒醅相比，水分含量和酸度隨輪次逐漸提高，淀粉含量隨輪次逐漸降低，還原糖含量隨輪次呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。

2.2 醬香型白酒大回酒風(fēng)味物質(zhì)特征

對醬香型白酒大回酒酒醅蒸餾得到的輪次酒進(jìn)行風(fēng)味分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，共檢測到43種主要風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類22種，醇類14種，醛類7種和酮類2種。酯類物質(zhì)含量較高的主要包括乳酸乙酯、乙酸乙酯，其中乳酸乙酯含量最高。隨著輪次的增加，乳酸乙酯的含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，在第四輪次達(dá)到最大值，為（5 366.69±35.77）mg/L，乙酸乙酯的含量隨輪次增加呈現(xiàn)先降低后略微升高的變化趨勢，其在第四輪次與第五輪次樣品中的含量相差不大。醇類物質(zhì)含量較高的主要包括正丙醇、異戊醇和甲醇，其中含量最高的醇類物質(zhì)是正丙醇。正丙醇含量隨輪次的增加呈現(xiàn)先降低后略微增加的變化趨勢，第四輪次與第五輪次樣品中正丙醇的含量相差不大。異戊醇的含量隨輪次增加呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢。甲醇的含量隨輪次的增加呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢。醛類物質(zhì)主要包括乙醛、糠醛和乙縮醛，其中乙醛和糠醛的含量隨輪次的增加呈現(xiàn)逐漸上升的變化趨勢，乙縮醛的含量隨輪次的增加呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢。酮類物質(zhì)包括丙酮和3-羥基-2-丁酮，其中3-羥基-2-丁酮的含量相對較高，隨著輪次的增加，3-羥基-2-丁酮的含量呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢，在第五輪次樣品中達(dá)到最大值，為（138.09±10.15）mg/L。

表2 大回酒風(fēng)味物質(zhì)含量的測定結(jié)果Table 2 Determination results of flavor compounds content in Dahui-jiu mg/L

續(xù)表

2.3 醬香型白酒大回酒酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 細(xì)菌群落多樣性

對醬香型白酒大回酒酒醅細(xì)菌菌群的多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 大回酒酒醅細(xì)菌菌群多樣性分析結(jié)果Table 3 Analysis results bacterial flora diversity of Dahui-jiu Jiupei

由表3可知，細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析顯示，醬香型白酒第三、四、五輪次酒醅樣品測序的Coverage指數(shù)均在99%以上，樣品的測序覆蓋率高，測序結(jié)果能夠真實(shí)反映樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示，第三、四、五輪次酒醅的群落多樣性可分為兩個等級，其中，相對于第四、五輪次酒醅，第三輪次酒醅中細(xì)菌的這兩種指數(shù)的數(shù)值較小，且第四、五輪次酒醅中細(xì)菌的這兩種指數(shù)的數(shù)值相差不明顯。因此，第四、五輪次酒醅中細(xì)菌群落多樣性較高，第三輪次酒醅中細(xì)菌群落多樣性較低。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯示，第三、四、五輪次酒醅中細(xì)菌群落豐富度按照這兩種指數(shù)的數(shù)值大小進(jìn)行排序，結(jié)果顯示兩指數(shù)的大小順序一致，因此，第三、四、五輪次酒醅群落豐富度大小依次為：第四輪次＞第五輪次＞第三輪次，三者的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)數(shù)值相差較為明顯，說明三者在群落豐富度上差別較大。

2.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

采用高通量測序（16S rDNA）的方法對醬香型白酒大回酒酒醅細(xì)菌在屬水平上的物種組成進(jìn)行分析，相對豐度排名前30的細(xì)菌屬見圖1。

圖1 大回酒酒醅細(xì)菌在屬水平的相對豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria in Dahui-jiu Jiupei at genus level

高通量測序的結(jié)果顯示，第三、四、五輪次酒醅樣品中共檢測到282個屬，其中相對豐度＞1%的細(xì)菌屬共有17種，相對豐度較高的有勞爾氏菌屬（Ralstonia）、Unidentified_Mitochondria和芽孢桿菌屬（Bacillus），是大回酒輪次酒醅中主要的細(xì)菌組成。第三輪次酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬是勞爾氏菌屬（Ralstonia），占總豐度的33.03%，其次是芽孢桿菌屬（Bacillus）和海洋桿菌（Oceanobacillus），分別占總豐度的11.47%和6.80%。第四輪次酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬是Unidentified_Mitochondria，占總豐度的14.09%，其次是克氏假單胞菌（Kroppenstedtia）和海洋桿菌（Oceanobacillus），分別占總豐度的7.94%和7.77%。第五輪次酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬與第四輪次相同，是Unidentified_Mitochondria，占總豐度的25.10%，其次是克氏假單胞菌（Kroppenstedtia）和芽孢桿菌屬（Bacillus），分別占總豐度的7.23%、5.67%。因此，第三輪次與第四、五輪次酒醅在屬水平上的主要細(xì)菌菌群差異較大。在細(xì)菌種類上，第四、五輪次酒醅細(xì)菌種類一致，第三輪次與第四、五輪次不同，這與Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的分析結(jié)果一致。在細(xì)菌豐度上，第四輪次與第五輪次酒醅的優(yōu)勢菌群（Unidentified_Mitochondria）豐度差別較大，分別為14.09%和25.10%，而第三輪次酒醅在細(xì)菌種類和豐度上與第四、五輪次均差別較大，因此第三、四、五輪次酒醅在細(xì)菌豐度上形成了明顯的梯度差異，這與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)的分析結(jié)果一致。

2.4 醬香型白酒大回酒酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)

2.4.1 真菌群落多樣性

對醬香型白酒大回酒酒醅真菌菌群的多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 大回酒酒醅真菌菌群多樣性分析結(jié)果Table 4 Fungal flora diversity analysis results of Dahui-jiu Jiupei

由表4可知，真菌群落多樣性指數(shù)分析顯示醬香型白酒第三、四、五輪次酒醅樣品測序的Coverage指數(shù)均達(dá)到了100%，樣品的測序覆蓋率高，測序結(jié)果能夠真實(shí)反映樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示，第三、四、五輪次酒醅的真菌群落多樣性可分為兩個等級，其中，相對于第五輪次酒醅，第三、四輪次酒醅中真菌的這兩種指數(shù)的數(shù)值相近且較小。第五輪次酒醅中真菌的這兩種指數(shù)的數(shù)值較大。因此，第三、四輪次酒醅中真菌群落多樣性較低，第五輪次酒醅中真菌群落多樣性較高。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯示，第三輪次酒醅該兩種指數(shù)的數(shù)值較小，第四、五輪次酒醅對應(yīng)的兩種指數(shù)相近且較大，因此，第三輪次酒醅真菌群落豐富度較小，第四、五輪次酒醅真菌群落豐富度較大，且第四、五輪次酒醅在真菌豐富度上接近，第三輪次與第四、五輪次酒醅差別較大。

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu)

采用高通量測序的方法對醬香型白酒大回酒酒醅真菌在屬水平上的物種組成進(jìn)行分析，相對豐度排名前30的真菌屬見圖2。

圖2 大回酒酒醅真菌在屬水平的相對豐度Fig.2 Relative abundance of fungus in Dahui-jiu Jiupei at genus level

高通量測序的結(jié)果顯示，第三、四、五輪次酒醅樣品中共檢測到112個真菌屬，其中相對豐度＞1%的真菌屬共有10種，分別是畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、酵母菌屬（Saccharomyces）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、曲霉屬（Aspergillus）、紅曲霉（Monascus）、絲衣霉菌屬（Byssochlamys）、根霉屬（Rhizopus），是大回酒輪次酒醅中主要的真菌組成。

第三輪次酒醅中優(yōu)勢真菌屬是畢赤酵母屬（Pichia），占總豐度的65.12%，其次是伊薩酵母屬（Issatchenkia）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces），分別占總豐度的21.66%和12.31%。第四輪次酒醅中的優(yōu)勢真菌屬是伊薩酵母屬（Issatchenkia），占總豐度的81.88%，其次是畢赤酵母屬（Pichia）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces），分別占總豐度的2.01%和1.14%。第五輪次酒醅中的優(yōu)勢酵母屬是接合酵母屬（Zygosaccharomyces），占總豐度的42.48%，其次是伊薩酵母屬（Issatchenkia）和畢赤酵母屬（Pichia），分別占總豐度的34.16%和9.63%。由第三、四、五輪次酒醅中豐度較高的真菌種類及豐度分析，畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）三類真菌是大回酒輪次酒醅中的豐度較高的真菌，第三、四、五輪次酒醅在主要真菌種類上相同。在真菌豐度上，第三、四、五輪次酒醅的差異較大，畢赤酵母屬、伊薩酵母屬和接合酵母屬分別在第三、四、五輪次酒醅中成為優(yōu)勢真菌屬，這可能與真菌隨輪次的演替有關(guān)。

2.5 醬香型白酒大回酒風(fēng)味潛在調(diào)控機(jī)制分析

2.5.1 理化指標(biāo)與微生物關(guān)聯(lián)性

以理化指標(biāo)為環(huán)境因子，采用典范對應(yīng)分析對醬香型白酒大回酒酒醅理化環(huán)境和微生物之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究，其典范對應(yīng)分析結(jié)果見圖3。

圖3 酒醅理化指標(biāo)與微生物之間的典范對應(yīng)分析Fig.3 Canonical correspondence analysis between physicochemical indexes and microorganisms of Jiupei

由圖3可知，在水分、酸度、淀粉和還原糖四種理化指標(biāo)中，水分和酸度對酒醅中微生物的影響相對較大，淀粉和還原糖對酒醅微生物的影響相對較小。環(huán)境因子對輪次酒醅的潛在影響分析顯示，對第三輪次酒醅影響最大的環(huán)境因子是水分，其次是酸度，淀粉和還原糖對第三輪次酒醅的影響較小。對第四輪次酒醅影響最大的環(huán)境因子是還原糖，淀粉、水分和酸度對第四輪次酒醅的影響相對較小。對第五輪次酒醅影響最大的環(huán)境因子是淀粉，其次是酸度，水分和還原糖對第五輪次酒醅的影響相對較小。

環(huán)境因子對輪次酒醅中微生物潛在影響的分析顯示，與酸度和水分呈現(xiàn)正相關(guān)的微生物主要有15種，包括細(xì)菌12種和真菌3種，其中可能對酸度和水分影響較大的微生物主要有不動桿菌屬（Acinetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和Unidentified_Mitochondria等。與酸度和水分呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的微生物主要有5種，包括細(xì)菌4種和真菌1種。與淀粉呈現(xiàn)正相關(guān)的微生物主要有17種，包括細(xì)菌10種和真菌7種，其中可能對淀粉影響較大的微生物是海洋桿菌（Oceanobacillus）。與還原糖呈現(xiàn)正相關(guān)的微生物主要有18種，包括細(xì)菌和真菌各9種，可能對還原糖影響較大的微生物有海洋桿菌（Oceanobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和伊薩酵母屬（Issatchenkia）等。

總體上，受水分、酸度、淀粉、還原糖等環(huán)境因子影響且在輪次酒醅中相對豐度較高的微生物主要有15種，其中細(xì)菌10種，分別為Kroppenstedtia、不動桿菌屬（Acinetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Unidentified_Mitochondria、單胞菌屬（Stenotrophomonas）、假單胞菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和海洋桿菌（Oceanobacillus），真菌5種，分別為接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、酵母菌屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）。

2.5.2 微生物與風(fēng)味物質(zhì)關(guān)聯(lián)性

根據(jù)大回酒酒醅中主要微生物（相對豐度＞1%）的組成和演替，以及大回酒中風(fēng)味物質(zhì)的組成及變化規(guī)律，采用Spearman相關(guān)性分析研究微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性并構(gòu)建微生物與風(fēng)味物質(zhì)間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖4。

在相對豐度＞1%的27種微生物中，至少與一種風(fēng)味物質(zhì)呈（共43種，表2）顯著相關(guān)性（P＜0.05）的微生物有26種。由圖4可知，異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等23種風(fēng)味物質(zhì)受勞爾氏菌屬（Ralstonia）、Unidentified_Mitochondria、乳桿菌屬（Lactobacillus）和酵母菌屬（Saccharomyces）的影響較大，甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯等11種風(fēng)味物質(zhì)受Kroppenstedtia、畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）的影響較大，庚酸乙酯、苯乙酸乙酯、正己醇、1,2-丙二醇等8種風(fēng)味物質(zhì)受海洋桿菌（Oceanobacillus）影響較大?？傮w上，與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性較強(qiáng)的微生物主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、Unidentified_Mitochondria、海洋桿菌（Oceanobacillus）、酵母菌屬（Saccharomyces）、勞爾氏菌屬（Ralstonia），其次是Kroppenstedtia、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）和畢赤酵母屬（Pichia），上述9種微生物（細(xì)菌5種，真菌4種）可能是影響風(fēng)味物質(zhì)的主要微生物種類。

圖4 風(fēng)味物質(zhì)與屬水平微生物群落相關(guān)性分析結(jié)果Fig.4 Correlation analysis results between flavor substances and microbial community at genus level

2.6 討論

在上述微生物中，9種可能主要影響大回酒風(fēng)味的微生物同時也可能是受水分、酸度、淀粉和還原糖影響的主要微生物種類，是對理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)均有較大影響的微生物。基于此，在大回酒釀造過程中，人們既能通過理化指標(biāo)影響這些微生物的種類和代謝，也可以間接通過理化指標(biāo)的變化反映出大回酒風(fēng)味的穩(wěn)定性。因此，在人們通過監(jiān)測理化指標(biāo)控制大回酒風(fēng)味穩(wěn)定中，這9種微生物可能是釀造過程起主要作用的功能微生物。

在醬香型白酒釀造過程中，水分、酸度、淀粉和還原糖等理化指標(biāo)是企業(yè)監(jiān)控釀造過程和酒品質(zhì)穩(wěn)定的重要途徑。水分的高低影響微生物的代謝活性，且水分也直接影響酸度的大小，水分與酸度兩者共同對微生物的代謝起作用，這可能是水分與酸度呈現(xiàn)正相關(guān)（見圖3）的原因之一。在與酸度呈現(xiàn)正相關(guān)的微生物中，一些微生物能夠代謝產(chǎn)酸，如Lactobacillus代謝產(chǎn)生乳酸，還有一些微生物能夠促進(jìn)產(chǎn)酸，如酵母菌屬（Saccharomyces），它具有促進(jìn)產(chǎn)酸菌代謝產(chǎn)酸的能力[22]，相反地，多種微生物在酸性條件下生長受到抑制或其他影響，與酸度呈現(xiàn)反比，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）等。在釀造過程中，產(chǎn)酸微生物能夠產(chǎn)酸使得酸度提高，而酸度的提高同時也抑制了另一部分微生物的生長和代謝，因此，酸度和微生物之間相互影響，酸度是影響微生物的重要因素，也是微生物代謝和演替的重要體現(xiàn)。淀粉和還原糖均是微生物生長和代謝的碳源和能源，兩者在與微生物的相關(guān)性上有較大的一致性，在豐度變化上較為相似，這些微生物與淀粉、還原糖均呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)性大小的差異可能與微生物利用淀粉和還原糖的難易程度不同有關(guān)。海洋桿菌（Oceanobacillus）已被證實(shí)涉及糖酵解、糖異生等代謝途徑[23]，芽孢桿菌屬（Bacillus）可代謝產(chǎn)生淀粉酶促進(jìn)淀粉的分解與利用，如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等[24-25]，這可能是海洋桿菌（Oceanobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）與淀粉和還原糖呈正相關(guān)的重要原因之一。

微生物代謝是大回酒風(fēng)味物質(zhì)的重要來源，理化指標(biāo)與微生物相互影響的同時，酒體的風(fēng)味物質(zhì)組成同時也發(fā)生相應(yīng)變化，如乳桿菌屬（Lactobacillus）等產(chǎn)酸微生物使得酒體酸味增加，芽孢桿菌屬（Bacillus）、酵母菌屬（Saccharomyces）等菌屬豐度的提高能夠使3-羥基-2-丁酮等醛酮類、酯類等香氣成分含量提高[18]。因此，理化指標(biāo)既能反映微生物的代謝，也能間接反映或推測風(fēng)味物質(zhì)的形成，這可能是醬香型大回酒釀造機(jī)理之一。

3 結(jié)論

本研究以醬香型白酒大回酒及其對應(yīng)酒醅為研究對象，通過分析大回酒風(fēng)味物質(zhì)、酒醅理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)，探索大回酒輪次發(fā)酵的機(jī)理。醬香型白酒大回酒酒醅的水分、酸度、淀粉和還原糖范圍分別為45.84%～47.75%、3.05～3.33 mmol/10 g、26.85%～30.14%和2.75%～3.03%。通過高通量測序，明確了大回酒酒醅中的優(yōu)勢細(xì)菌屬為勞爾氏菌屬（Ralstonia）、Unidentified_Mitochondria和芽孢桿菌屬（Bacillus），優(yōu)勢真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。

CCA分析顯示，可能受水分、酸度、淀粉、還原糖等環(huán)境因子影響（或影響這些環(huán)境指標(biāo)）的微生物主要有15種（細(xì)菌10種，真菌5種）。相關(guān)性分析顯示，影響風(fēng)味物質(zhì)的微生物主要有9種（細(xì)菌5種，真菌4種），分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、Unidentified_Mitochondria、海洋桿菌（Oceanobacillus）、酵母菌屬（Saccharomyces）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、Kroppenstedtia、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）和畢赤酵母屬（Pichia），且該9種微生物均是可能受水分、酸度、淀粉、還原糖等環(huán)境因子影響的微生物種類。因此，9種微生物可能是既影響風(fēng)味又影響理化指標(biāo)的主要微生物種類。在監(jiān)測理化指標(biāo)控制大回酒風(fēng)味穩(wěn)定性的過程中，該9種微生物可能是其中起主要作用的微生物。微生物對理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)的雙向影響可能是人們通過觀察理化指標(biāo)的規(guī)律性變化預(yù)測風(fēng)味物質(zhì)穩(wěn)定的潛在機(jī)理之一。在下一階段工作中，將進(jìn)一步驗(yàn)證理化指標(biāo)、微生物和風(fēng)味物質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為大回酒的生產(chǎn)控制提供可靠的理論依據(jù)。