鄒倫妃，張啟偉，肖 琛，熊 淼，鄭 琦

(江漢大學(xué)光電化學(xué)材料與器件教育部重點實驗室，湖北 武漢 430054)

蛋白質(zhì)是生命活動的主要執(zhí)行者，通常呈現(xiàn)多樣化的翻譯后修飾(PTMs)，其中磷酸化修飾最為普遍。細(xì)胞通過激酶“寫入”磷酸基與磷酸酶“擦除”磷酸基，可改變蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)對其活性調(diào)節(jié)，進而調(diào)控生物的生長發(fā)育(增殖分化與凋亡等)[1]、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-3]以及疾病的發(fā)生發(fā)展等[4-5]。在很長一段時間內(nèi)，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點在于突破分析技術(shù)障礙，以鑒定大量的磷酸化蛋白質(zhì)以及定位磷酸基位點[6-7]。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展與成熟，蛋白質(zhì)磷酸化研究由早期的定性分析逐步擴展到定量分析[8-13]。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)磷酸化過程是短暫且動態(tài)變化的，通過定量分析掌握這些變化規(guī)律，將有助于了解磷酸化蛋白質(zhì)在生命活動調(diào)控中的機理作用，進一步洞悉生命活動中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物功能的實現(xiàn)機制。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾的定量分析一般基于“自下而上”(bottom-up)的質(zhì)譜方法，主要分為無標(biāo)記定量技術(shù)[14]、以含有穩(wěn)定同位素的多肽作為內(nèi)標(biāo)的絕對定量技術(shù)[15-16]、化學(xué)標(biāo)記技術(shù)[17]。其中，化學(xué)標(biāo)記技術(shù)是在提取蛋白質(zhì)或多肽后再標(biāo)記特定氨基酸，主要分為輕重同位素標(biāo)記法和同整質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記法。常見的輕重同位素標(biāo)記試劑有同位素編碼親和標(biāo)簽(ICAT)[18-19]、甲醛[20]，分別標(biāo)記半胱氨酸、多肽N端與賴氨酸，將輕重同位素標(biāo)記的樣品混合后，可通過質(zhì)譜分析不同樣品中同一個蛋白質(zhì)的相對豐度差異；以同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)[21]、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)技術(shù)[22]為代表的同整質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記法是使用一組具有同整質(zhì)量的試劑分別標(biāo)記不同樣品，通過觀察樣品混合后在二級質(zhì)譜圖中各報告基團的相對豐度，進而比較對應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異。除此之外，有報道[10-11]通過去磷酸基后的加成反應(yīng)特異性地標(biāo)記磷酸化多肽，然而，因其反應(yīng)條件較苛刻，使得該方法可能會破壞多肽結(jié)構(gòu)。使用胺類試劑衍生羧基的化學(xué)標(biāo)記法已應(yīng)用于蛋白質(zhì)的糖基化修飾研究[23]。該方法在高通量的磷酸化蛋白分析方面具有如下特點：1) 在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的蛋白酶均可酶切目標(biāo)物產(chǎn)生標(biāo)記位點，具有廣譜性；2) 輕重同位素標(biāo)記的差異至少可達(dá)6 u，能有效避免多肽同位素峰重疊的風(fēng)險；3) 標(biāo)記過程操作簡單且較溫和，對磷酸化多肽無顯著影響；4) 磷酸化多肽被標(biāo)記后可適當(dāng)增強TiO2的富集特異性以及質(zhì)譜檢測的靈敏度；5) 衍生試劑價廉易得。

本研究擬采用基于胺類試劑衍生羧基的化學(xué)標(biāo)記法進行蛋白質(zhì)的磷酸化修飾研究。使用二甲胺(d0-DMA)與氘代二甲胺(d6-DMA)分別衍生不同樣品后，多肽被輕重同位素標(biāo)記，然后通過TiO2磁顆粒富集和質(zhì)譜檢測完成磷酸化多肽的相對定量分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

M5-TripleTOF 5600+微流液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(microLC-QTOF MS)聯(lián)用儀：美國SCIEX公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源及PeakView 2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；真空離心濃縮儀：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；超純水儀：英國ELGA公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

乙腈(ACN，LC-MS級)：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲酸(FA，LC-MS級)、10%氨水(HPLC級)：美國FLUKA公司產(chǎn)品；牛血清酪蛋白、N-甲基嗎啉、(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸鹽(PyAOP)、尿素、碳酸氫銨、二甲基亞砜(DMSO)、丙酮：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、胰蛋白酶(Tryspin)、重組賴氨酰內(nèi)切酶(Lys-C)：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；三氟乙酸(TFA)、二甲胺鹽酸鹽、氘代二甲胺鹽酸鹽、乙醇、乙醇酸：上海阿拉丁生化科技有限公司產(chǎn)品；TiO2磁珠：廈門普睿邁格生物科技有限公司產(chǎn)品；C18固相萃取柱：深圳逗點生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 C18色譜柱(3.0 μm×0.3 mm×150 mm)，柱溫40 ℃；流動相：2%ACN(含0.1%FA)(A)和98%ACN(含0.1%FA)(B)；梯度洗脫：0～2 min(5%B)，2～30 min(5%～38%B)，30～38 min(38%～90%B)，38～43 min(90%B)，43～45 min(90%～5%B)，45～60 min(5%B)；流速6 μL/min；進樣量5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)；正離子模式；離子源溫度350 ℃；噴霧電壓5 500 V；離子源氣體GS1為110.32 kPa，GS2為124.11 kPa；氣簾氣(CUR)為206.85 kPa；一級質(zhì)譜掃描范圍m/z300～1 250；二級質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 500。

1.4 實驗方法

1.4.1羧基的酰胺化 將酪蛋白溶解于8 mol/L尿素溶液中，用DTT和IAM處理以保持二硫鍵處于打開狀態(tài)；用Lys-C和Trypsin混合酶酶切蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品成多肽。酶切后的肽段用經(jīng)2 mL H2O、2 mL 80%ACN(含0.1%TFA)、2 mL 0.1%TFA預(yù)處理的C18固相萃取柱脫鹽，隨后用1 mL 50%ACN(含0.1%TFA)洗脫。

將干燥后的樣品溶于40 μL DMSO(含1 mol/L d0-DMA和0.5 mol/LN-甲基嗎啉)中，再加入40 μL 50 mmol/L PyAOP溶液(溶于DMSO中)，反應(yīng)溶液于常溫且黑暗處靜置1 h，以酰胺化羧基[24]。

1.4.2磷酸化多肽的富集 用200 μL 80% ACN(含0.1%TFA)稀釋衍生后的樣品，向其中加入20 μL TiO2磁珠懸浮液并振蕩1 h。用100 μL 30%丙酮(含0.1%TFA)和100 μL 50%ACN(含0.1%TFA)各洗滌磁珠2次，隨后用200 μL 20%ACN(含5% NH4OH)洗脫多肽。未衍生樣品的富集方法如下：干燥樣品用上樣緩沖液(1 mol/L乙醇酸溶于80%ACN和5%TFA中)溶解后與20 μL TiO2磁珠懸浮液混合；分別用100 μL上樣緩沖液、100 μL 80%ACN(含0.1%TFA)、100 μL 10%ACN(含0.2%TFA)洗滌磁珠1、3、1次，隨后用240 μL 1%NH4OH洗脫多肽。所有樣品真空干燥后于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3穩(wěn)定同位素標(biāo)記 將酪蛋白酶解后的多肽按照物質(zhì)的量比1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1分別用d0-DMA、d6-DMA標(biāo)記。輕重標(biāo)記的多肽在混合后經(jīng)TiO2磁珠富集并真空干燥。

1.4.4數(shù)據(jù)分析 使用ProteinPilot(4.7版)和PeakView(2.1版)軟件處理LC-MS采集的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生原理

DMA能夠酰胺化羧基，可與酶切后肽段中的天冬氨酸R基團、谷氨酸R基團以及肽鏈C端發(fā)生反應(yīng)，示于圖1。多肽衍生后，每個位點可導(dǎo)致其分子質(zhì)量增加27 u。一方面，羧基的酰胺化可編輯成一種氨基酸修飾，從而兼容常用的蛋白質(zhì)鑒定軟件；另一方面，使用d0-DMA和d6-DMA分別對多肽進行輕重標(biāo)記時，每個衍生位點可產(chǎn)生6 u的分子質(zhì)量差異，有效避免了輕重標(biāo)記多肽的同位素峰重疊，為該方法應(yīng)用于多肽的相對定量分析提供了保障。

圖1 二甲胺衍生多肽的天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基以及C-末端示意圖Fig.1 Schematic diagrams of the aspartic acid residue, glutamic acid residue and C-terminal of the peptide derivatized by dimethylamine

2.2 衍生化處理的影響

在使用酰胺化羧基的化學(xué)標(biāo)記法時，需要考慮2個問題：1) 衍生反應(yīng)是否特異性地發(fā)生在羧基上；2) 羧基中性化將改變多肽的疏水性，這是否會對磷酸化多肽的檢測與富集造成影響。以肽段VPQLEIVPNSAEER為例，其含有4個標(biāo)記位點(除C端外，還有3個位于谷氨酸殘基上)，因此衍生前后的肽段分子質(zhì)量應(yīng)相差108 u。該肽段衍生前后的準(zhǔn)分子離子([M+2H]2+)分別為m/z830.91、884.99，表明其成功地被二甲胺標(biāo)記，示于圖2a和2b。m/z830.91、884.99的MS/MS譜圖中，產(chǎn)物離子b5、y1、y2、y3分別相差27、27、54、81 u，證實衍生反應(yīng)發(fā)生在多肽C端以及谷氨酸殘基上；高豐度的y6、y7等離子表明，磷酸化修飾沒有因衍生反應(yīng)而遭到破壞，示于圖2c、2d。

注：a,c.衍生后；b,d.衍生前圖2 二甲胺衍生VPQLEIVPNSAEER肽段前后的一級(a，b)與二級(c,d)質(zhì)譜圖Fig.2 MS (a, b) and MS/MS (c, d) spectra of peptide VPQLEIVPNSAEER before and after derivatized by dimethylamine

類似地，多肽TVDMESTEVFTK共有4個標(biāo)記位點，其衍生前后的m/z相差54 u。二者的產(chǎn)物離子b3相差27 u，表明在天冬氨酸殘基上發(fā)生了標(biāo)記；豐富的y離子證實磷酸基團未在衍生反應(yīng)時丟失，示于圖3c、3d。二甲胺對磷酸化多肽的酰胺化作用具有高特異性，通常僅發(fā)生在羧基上，而對磷酸基無顯著影響。另外，衍生化作用對多肽的二級碎裂模式影響不大，僅略微增加了產(chǎn)物離子的種類。

注：a,c.衍生后；b,d.衍生前圖3 二甲胺衍生TVDMESTEVFTK肽段前后的一級(a,b)與二級(c,d)質(zhì)譜圖Fig.3 MS (a, b) and MS/MS (c, d) spectra of peptide TVDMESTEVFTK before and after derivatized by dimethylamine

金屬氧化物(以TiO2為代表)親和色譜法是富集生物樣品中磷酸化多肽的常用方法[25]，本研究以此為基礎(chǔ)考察衍生化作用對富集過程的影響。使用商業(yè)化的TiO2磁珠分別處理衍生與未衍生casein酶解肽段后，通過microLC-QTOF MS鑒定其中的磷酸化多肽，結(jié)果列于表1。在衍生前后的樣品中分別檢測到7、8條目標(biāo)肽；有6條肽段在衍生前后均被檢測到，其中2條衍生肽段的峰強度明顯高于未衍生肽段，多肽NTMEHVSSSEESIISQETYK的信號響應(yīng)增加了60多倍；3條衍生肽段的信號響應(yīng)降低了約50%，示于圖4。有3條肽段衍生后比未衍生的信號響應(yīng)增強，另有1條肽段只在衍生后被檢測到，這些肽段衍生位點的數(shù)量在5～8之間，可能意味著達(dá)到一定數(shù)量的衍生位點有利于磷酸化多肽的檢測，然而，過多的衍生位點會導(dǎo)致不完全衍生。因此，酶切蛋白質(zhì)時應(yīng)選擇合適的蛋白酶使多肽的可衍生位點處于適當(dāng)范圍，從而提高磷酸化多肽的鑒定效率。

圖4 衍生前后各肽段提取離子色譜圖的峰面積對比Fig.4 Comparison of peak areas of each peptide before and after derivatization

表1 從衍生和未衍生樣品中鑒定的磷酸化多肽Table 1 Phosphopeptides identified from derivatized and native samples

續(xù)表1

衍生化作用使多肽的質(zhì)荷比向低質(zhì)量端遷移，增加了高電荷離子的相對強度，示于附圖1(請登錄《質(zhì)譜學(xué)報》網(wǎng)站www.jcmss.com.cn下載)，這可能是其提高磷酸化多肽鑒定效率的原因之一。除此之外，還可能與中性化的羧基調(diào)節(jié)富集過程有關(guān)。在酸性環(huán)境下，TiO2的鈦原子帶有正電荷，為路易斯酸，可吸附陰離子；在堿性環(huán)境下則為路易斯堿。調(diào)節(jié)pH值能夠控制鈦原子結(jié)合磷酸根以富集磷酸化多肽，并在堿性環(huán)境下將其洗脫[26-27]。但同時，TiO2也會結(jié)合羧酸根，產(chǎn)生非特異性吸附。在二甲胺中性化多肽的羧基之后，非磷酸化多肽的負(fù)電性消失，由此可能提高TiO2對磷酸化多肽的富集特異性?？傊?，雖然衍生化作用導(dǎo)致一些磷酸化多肽的信號強度降低了約50%，但仍提高了此類多肽的鑒定效率。

此外，多肽衍生后比衍生前的半峰寬略有增加，這可能是由于多肽衍生后的疏水性更強，在反相色譜柱中的洗脫時間延長。綜上，基于酰胺化的化學(xué)標(biāo)記法并不干擾磷酸化多肽的鑒定，且對羧基數(shù)量較多的多肽有更好的檢測效果，展現(xiàn)了較高的應(yīng)用價值。

2.3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記

本實驗分別用d0-DMA與d6-DMA標(biāo)記casein酶解肽段，將輕重標(biāo)記的樣品按照物質(zhì)的量比1∶1混合，使用TiO2磁珠富集后進行LC-MS檢測。混合樣品中肽段TVDMESTEVFTK的質(zhì)譜圖示于圖5。因該多肽含有4個標(biāo)記位點，故輕重標(biāo)記對應(yīng)的準(zhǔn)分子離子([M+2H]2+)分別為m/z787.90、799.98，分子質(zhì)量相差24 u。由圖3b、3c可知，產(chǎn)物離子b3、b4只包含1個衍生位點，因而其輕重標(biāo)記應(yīng)相差6 u，示于圖5b、5c。類似地，離子y5、y6的輕重標(biāo)記相差12 u，y8相差18 u。由此可見，磷酸化多肽的各個衍生位點分別被d0-DMA、d6-DMA成功標(biāo)記。

注：a.同位素標(biāo)記肽的一級質(zhì)譜圖；b.d0-DMA標(biāo)記肽的二級質(zhì)譜圖；c.d6-DMA標(biāo)記肽的二級質(zhì)譜圖圖5 肽段TVDMESTEVFTK的同位素標(biāo)記Fig.5 Isotopic labeling of peptide VDMESTEVFTK

2.4 相對定量范圍和準(zhǔn)確度

為評價基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法用于磷酸化多肽相對定量分析的可行性，本研究分別使用d0-DMA、d6-DMA衍生一系列樣品，并以物質(zhì)的量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5混合，每種比例進行3次重復(fù)實驗。輕重標(biāo)記肽段VPQLEIVPNSAEER的質(zhì)譜圖示于圖6a，各樣品的相對峰強度與物質(zhì)的量比的理論值較吻合。5條多肽的相對定量分析結(jié)果示于圖6b。以提取離子色譜圖的峰面積作為定量依據(jù)，除多肽DIGSESTEDQAMEDIK在理論輕重物質(zhì)的量比5∶1時的誤差較大外，其他多肽在各比例下產(chǎn)生的誤差均小于20%，表明該方法具有良好的相對定量范圍和準(zhǔn)確度，可高通量地比較不同生物樣品中磷酸化多肽的差異化表達(dá)水平。相較于其他化學(xué)標(biāo)記方法，基于羧基酰胺化的穩(wěn)定同位素標(biāo)記法具有價格低廉、不干擾磷酸化多肽的檢測分析、無同位素峰重疊風(fēng)險等優(yōu)勢，而且可以使用不同蛋白酶酶切以調(diào)節(jié)肽段衍生位點的數(shù)量。

注：虛線為理論物質(zhì)的量比圖6 不同物質(zhì)的量比混合樣品中肽段VPQLEIVPNSAEER的一級質(zhì)譜圖(a)和系列物質(zhì)的量比不同肽段的輕重標(biāo)記(b)Fig.6 Mass spectra of peptide VPQLEIVPNSAEER from mixed samples with a series of mole ratio (a) and peptides with different molar ratios derivatized by light and heavy label (b)

2.5 自縮合反應(yīng)的影響

對于C-末端是賴氨酸殘基的多肽，在衍生過程中可能因自縮合而形成七元環(huán)內(nèi)酰胺，這是造成P2與P5肽在衍生后強度降低的原因之一?？梢酝ㄟ^在酶切過程中使用其他蛋白酶，如Glu-C等，以避免多肽的C-末端包含賴氨酸殘基。

3 結(jié)論

本文將基于羧基胺化的標(biāo)記方法應(yīng)用于磷酸化多肽的研究中。通過二甲胺與氘代二甲胺衍生天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和肽鏈C-端的羧基，實現(xiàn)了對磷酸化多肽的同時定性與相對定量分析。該方法不僅具有較好的可靠性與重復(fù)性，而且在一定程度上增強了磷酸化多肽的鑒定效率?；隰然坊臉?biāo)記方法有望應(yīng)用于磷酸化蛋白的相對定量分析，在發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物方面顯現(xiàn)了較大的應(yīng)用潛力。