黃 鈺，張婷婷，胡 爽，賈 薇，王優(yōu)美2,，蘇夢翔，花鎮(zhèn)東2,

(1.中國藥科大學藥學院，南京 210009；2.國家禁毒委員會辦公室中國藥科大學禁毒關鍵技術聯(lián)合實驗室，北京 100193；3.公安部禁毒情報技術中心，毒品監(jiān)測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，北京 100193；4. 北京警察學院，北京 102202)

合成大麻素(SCs)是新精神活性物質(NPS)的重要組成，該類物質能結合并激動生物體內的大麻素受體CB1和CB2，人體攝入后能產生類似吸食天然大麻的興奮和致幻感。合成大麻素類物質的濫用于2004年在歐洲出現(xiàn)，其中以“Spice/K2”香料最為常見[1]。由于合成大麻素制造成本低、致幻效果強、新品種更新?lián)Q代迅速，很快在世界范圍內流行?！?021年世界毒品問題報告》指出[2]：合成大麻素仍然是目前世界上濫用最廣泛的毒品，并且在過去十年里呈逐年遞增的趨勢。近年來，國內濫用合成大麻素制品的案例不斷增多。為此，我國于2021年7月1日起，將合成大麻素類物質整類列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》，按照公告要求[3-4]，符合圖1所示7類化學結構通式的合成大麻素類物質均屬于管制范圍。為此，亟需建立相應的檢測方法用于濫用人員的篩查識別。

注：R1代表取代或未取代的C3～C8烴基、取代或未取代的含有1～3個雜原子的雜環(huán)基、取代或未取代的含有1～3個雜原子的雜環(huán)基取代的甲基或乙基；R2代表氫或甲基或無任何原子；R3代表取代或未取代的C6～C10芳基、取代或未取代的C3～C10烴基、取代或未取代的含有1～3個雜原子的雜環(huán)基、取代或未取代的含有1～3個雜原子的雜環(huán)基取代的甲基或乙基；R4代表氫、取代或未取代的苯基、取代或未取代的苯甲基；R5代表取代或未取代的C3～C10烴基；X代表N或C；Y代表N或CH；Z代表O或NH或無任何原子圖1 合成大麻素化學結構通式Fig.1 General skeleton structures of synthetic cannabinoids

目前，可用于毒品檢測的生物樣本包括尿液、血液、唾液和毛發(fā)。血液和尿液的檢測窗口期較短，主要用于確定短期內的吸毒情況。然而，由于合成大麻素類物質極性較弱，血液和尿液中原體濃度極低，且代謝產物復雜，標準品不易獲得，檢測難度較大。相比之下，毛發(fā)樣品具有易獲取、易保存的優(yōu)點，能夠提供更長的檢測窗口(長達數(shù)月)，同時毛發(fā)中合成大麻素基本以原體形式存在，檢測分析相對簡單[5-6]。

目前，液相色譜-質譜聯(lián)用技術已廣泛應用于毒品的生物樣本檢測[7-9]，其中關于合成大麻素定性、定量檢測的研究逐年增加，但通常單個方法所涵蓋的樣品種類有限，尤其缺乏針對近期流行的吲唑酰胺和吲哚酰胺類合成大麻素的檢測[10-12]，而且進行高通量篩查時分析時間延長，檢測效率降低[13-15]。

基于此，本研究擬利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)法同時檢測毛發(fā)中112種合成大麻素類物質，涵蓋國家毒品實驗室近年來監(jiān)測發(fā)現(xiàn)存在非法制販和濫用的所有合成大麻素品種，同時保證方法的高靈敏度，一次進樣即可實現(xiàn)高通量的篩查及定量。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Triple QuadTM6500三重四極桿質譜儀：美國Sciex公司產品；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀：美國Waters公司產品；百萬分之一電子天平：德國Sartorius公司產品；KQ-600DE型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；冷凍研磨儀：北京萬孚智能科技有限公司產品；Milli-Q advantage A10超純水裝置：德國Merck公司產品；具蓋研磨管含氧化鋯研磨球：北京柏丞科技有限公司產品。

1.2 材料與試劑

112種合成大麻素類物質標準品：均由公安部第三研究所提供，詳細信息列于附表1(請登錄《質譜學報》官網http:∥www.jcmss.com.cn下載)；乙腈和甲醇：均為色譜純，德國Merck公司產品；實驗中所檢測的毛發(fā)樣品均為真實案件繳獲。

1.3 樣品制備

1.3.1標準溶液的制備 準確稱取1 mg標準品，分別用甲醇溶解并定容至1 mL，得到1 g/L標準儲備溶液，于-20 ℃密封避光儲存。分別取適量的標準儲備溶液，用甲醇稀釋得到1 mg/L混合標準工作溶液，4 ℃下密封避光保存。系列混合標準工作溶液使用甲醇連續(xù)稀釋得到，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2樣品提取 依次用適量的0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液、水、丙酮洗滌毛發(fā)樣品，渦旋、振蕩各5 min，置于通風櫥中揮干。精確稱取約20 mg毛發(fā)樣品于具蓋研磨管中，加入1 mL甲醇，于球磨機中研磨提取2 min，研磨提取液以14 000 r/min離心10 min，取適量上清液置于進樣瓶中，供LC-MS檢測。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 條件1：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)；洗脫程序：0.0～9.0 min(5%～100%B)，9.0～11.0 min(100%B)，11.0～11.1 min(100%～5%B)，11.1～13.0 min(5%B)；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

條件2：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)，采用50%B等度洗脫；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

條件3：色譜柱為Kinetex F5 柱(3.0 mm×50 mm×2.6 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)，采用55%B等度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

1.4.2質譜條件 電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；多反應監(jiān)測模式(Scheduled MRM)；檢測窗40 s；離子源溫度500 ℃；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓強413.7 kPa；輔助加熱氣壓強448.2 kPa；氣簾氣壓強275.8 kPa；碰撞氣為氮氣；典型合成大麻素的信息列于表1。

表1 代表性合成大麻素的信息Table 1 Information of representative synthetic cannabinoids

續(xù)表1

續(xù)表1

2 結果與討論

2.1 提取和進樣溶劑的選擇

目前，對毛發(fā)樣品中毒品成分的提取方法主要有酸水解法、堿水解法和有機溶劑提取法[16-19]。酸水解法和堿水解法能將毛發(fā)完全消解，但由于合成大麻素類物質的水溶性不佳，消解后需要使用有機溶劑進行提取和濃縮[20-21]，步驟較繁瑣，不利于大批量樣品的分析，且可能影響分子內含酯鍵合成大麻素的穩(wěn)定性。甲醇是有機溶劑提取法常用的溶劑，對包括合成大麻素在內的各類毒品和新精神活性物質的提取效果良好[15,22]，因此，本研究選擇甲醇作為提取溶劑。

為避免色譜分離過程中的溶劑效應，在分析甲基苯丙胺等強極性毒品時，需要使用水對甲醇提取液進行稀釋。本研究考察了甲醇-水溶液(1∶1,V/V)和純甲醇溶液的進樣情況，結果表明，所有物質在這2種條件下均具有良好的峰形，表明合成大麻素類物質極性較弱，受溶劑效應干擾較小。實驗還發(fā)現(xiàn)，部分保留時間大于8 min的合成大麻素在甲醇溶劑進樣時的響應更強，可能是由于這些物質在甲醇-水溶液中溶解度過低，有一部分被進樣瓶吸附所致。以6種合成大麻素為例，對比圖示于圖2。為此，本實驗最終選擇甲醇提取液過濾后直接進樣的方式。

圖2 不同溶劑體系中6種合成大麻素混合標準溶液(1 μg/L)的總離子流圖Fig.2 Total ions chromatograms of standard solution for 6 synthetic cannabinoids (1 μg/L) in different solvent systems

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于不同骨架結構合成大麻素的極性存在較大差異，為保證所有目標物在合適的時間范圍內出峰，優(yōu)先采用梯度洗脫的方式進行色譜分離(1.4.1節(jié)中條件1)，洗脫和平衡總時間為13 min，該條件下112種合成大麻素的出峰時間范圍為3.58～9.32 min，色譜峰峰形良好，示于圖3。由于分析目標物較多，不可避免地會出現(xiàn)多種物質洗脫時間接近的情況。即使在質譜分析過程中盡量選擇特征性強的子離子，仍有一些物質的全部MRM通道存在交叉干擾，只能依靠洗脫時間的不同進行區(qū)分。如JWH-007和JWH-019互為同分異構體，二者在3個MRM通道的子離子質荷比完全相同，各通道峰面積的比例也高度相似，但二者的保留時間分別為7.98和8.19 min，差異大于2%。因此，可以通過色譜保留時間進行區(qū)分。

圖3 112種合成大麻素的總離子流圖(1 μg/L)Fig.3 Total ions chromatogram of 112 synthetic cannabinoids (1 μg/L)

此外，ADB-FUBINACA、APINACA-2H和5F-SDB-005這3種以吲唑為母核的物質，其所有MRM通道分別受相應的以吲哚為母核的ADB-FUBICA、APICA、5F-MN-18同位素峰的干擾，但可根據色譜保留時間的差異進行區(qū)分。

排除以上情況后，最終僅有FUB-PB-22和MDMB-FUBICA，AMB-FUBICA和MEP-FUBICA，以及5F-PB-22、5F-MDMB-PICA和5F-EMB-PICA這3組共7種物質的MRM通道完全相同。使用更平緩的洗脫梯度能改善分離效果，但分析時間將延長，不利于實際工作中大批量樣品的篩查。為此，嘗試建立獨立的色譜洗脫程序用于以上物質的區(qū)分。當不改變色譜柱和流動相，采用1.4.1節(jié)的條件2時，分離情況示于圖4a，F(xiàn)UB-PB-22和MDMB-FUBICA，以及5F-PB-22、5F-MDMB-PICA和5F-EMB-PICA可實現(xiàn)有效分離，但AMB-FUBICA和MEP-FUBICA仍被同時洗脫。進一步使用保留機理不同的五氟苯基固定相色譜柱，并使用含0.1%甲酸的甲醇作為有機相在55%比例下等度洗脫(1.4.1節(jié)條件3)，AMB-FUBICA和MEP-FUBICA可實現(xiàn)有效分離，分離情況示于圖4b。

注：a.1.4.1節(jié)條件2；b.1.4.1節(jié)條件3；1.MEP-FUBICA；2.AMB-FUBICA；3.5F-EMB-PICA；4.5F-MDMB-PICA；5.5F-PB-22；6.MDMB-FUBICA；7.FUB-PB-22圖4 目標物的分離情況Fig.4 Separation of targets

根據以上實驗結果，最終色譜洗脫條件確定為1個通用梯度洗脫方法和2個補充等度洗脫方法，當通用梯度洗脫方法篩查發(fā)現(xiàn)存在不能區(qū)分的物質時，可使用補充等度洗脫方法進行確證。鑒于這7種物質占目標物總數(shù)的比例僅為6.25%，可以預見，實際工作中需要使用補充方法的樣品僅為少數(shù)，不會對篩查效率造成影響。

2.3 質譜條件優(yōu)化

2.3.1離子對參數(shù)優(yōu)化 首先，在流動注射模式下對112種合成大麻素的質譜參數(shù)進行優(yōu)化。結果表明，絕大多數(shù)合成大麻素在ESI+模式下均可產生較高強度的[M+H]+準分子離子，在此基礎上選擇響應值高、特征性強的2～3個子離子建立MRM通道，并對去簇電壓和碰撞能量進行優(yōu)化。鑒于112種合成大麻素中存在大量分子質量接近、結構類似的物質，選擇子離子時應盡量避開普遍存在的m/z144.0(吲哚甲酰離子)和m/z145.0(吲唑甲酰離子)等離子，以免產生不同物質之間的相互干擾。如ADB-BUTINACA和AB-PINACA的母離子均為m/z331.2，分別建立的3個MRM通道中有1個相同的子離子m/z286.2，其余2個互不相同，可有效區(qū)分。5F-AMB-PICA和4F-MDMB-BUTICA，ADB-BINACA和5Cl-AB-PINACA，5F-AMB和4F-MDMB-BUTINACA這3對物質具有類似情況。此外，優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，NM-2201分子中的酯鍵穩(wěn)定性較差，易發(fā)生源內裂解，導致碎片離子m/z232.1的強度遠高于準分子離子m/z376.2，且m/z376.2碰撞誘導解離后得到的子離子也以m/z232.1為主。因此，除m/z376.2/232.1通道外，其余2個MRM通道的選擇以m/z232.1為母離子，能有效提高檢測靈敏度。最終優(yōu)化得到的112種合成大麻素的離子對參數(shù)列于附表1。

2.3.2離子源參數(shù)優(yōu)化 離子源參數(shù)的選擇會對離子化效率及靈敏度產生影響。本實驗以1 μg/L混合標準溶液為樣品，對離子源溫度、電噴霧電壓、霧化氣壓強及輔助加熱氣壓強等質譜參數(shù)進行優(yōu)化，以化合物定量離子通道的最優(yōu)靈敏度，確定最佳參數(shù)。實驗結果表明，大部分目標物在離子源溫度500 ℃和電噴霧電壓5 500 V下具有較好的靈敏度，13種代表性物質的離子源參數(shù)優(yōu)化結果示于圖5，而霧化氣和輔助加熱氣無顯著影響。

注：a.不同離子源溫度；b.不同電噴霧電壓圖5 13種代表性合成大麻素的離子源參數(shù)優(yōu)化結果Fig.5 Optimization results of ion source parameters for 13 representative synthetic cannabinoids

2.4 方法學驗證

2.4.1檢出限、定量限和線性范圍 取空白毛發(fā)按照1.3.2節(jié)方法處理，得到空白基質溶液，并以此配制成一系列空白添加溶液進行測試，分別以信噪比(S/N)>3和S/N>10確定檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，線性相關系數(shù)r≥0.999 0作為線性范圍。結果表明，112種合成大麻素的檢出限范圍為0.2～1 ng/g，定量限范圍為0.5～5 ng/g；AB-FUBINACA、5F-ADBICA、ADB-PINACA、5F-ADB-PINACA、APINACA-2H、EMB-FUBINACA、5F-BTP7AIC、5F-MN-24及EDMB-PINACA在1～100 ng/g濃度范圍內的線性關系良好；JWH-250、A-834,735、A-796,260、CUMYL-PEGACLONE及5F-CUMYL-P7AICA在2.5～250 ng/g濃度范圍內的線性關系良好；5F-APINAC在5～500 ng/g濃度范圍內的線性關系良好；其余97種合成大麻素在0.5～100 ng/g濃度范圍內具有良好的線性關系，表明該方法具有較高靈敏度，可滿足毛發(fā)中痕量目標物的檢測要求。各目標物的檢出限、線性范圍及相關系數(shù)列于附表2。

2.4.2基質效應和提取回收率 向空白毛發(fā)中添加1、5、25、100 ng/g的112種合成大麻素類物質，并按照1.3.2節(jié)方法處理，測得目標物峰面積為A；用甲醇溶劑配制相應濃度的混合標準溶液，測得目標物峰面積為B；取空白毛發(fā)按照1.3.2節(jié)方法處理，得到空白基質溶液，配制相應濃度的空白添加溶液，測得峰面積為C。提取回收率=A/C×100%，基質效應(ME)=C/B×100%。根據實驗結果，4個添加濃度水平下，112種合成大麻素的基質效應為81.0%～117.8%，無明顯的基質抑制和基質增強作用，提取回收率為80.4%～119.7%，表明本方法的定量分析結果具有準確性和可靠性。各目標物的回收率和基質效應結果列于附表2。

2.4.3日間和日內精密度 向空白毛發(fā)中添加1、5、25、100 ng/g的112種合成大麻素類物質，按照1.3.2節(jié)方法處理并進樣分析，每個加標水平在1天內平行測定6次，計算相對標準偏差(RSD)，得到日內精密度(intra-RSD)；連續(xù)重復6天，得到日間精密度(inter-RSD)。結果表明，112種合成大麻素的日內精密度為0.4%～7.7%，日間精密度為1.0%～10.6%，表明該方法的重復性良好，對毛發(fā)中多種合成大麻素的分析具有可靠性和實用性。各目標物的精密度結果列于附表2。

表2 實際樣品檢測結果Table 2 Test results of actual cases

2.4.4穩(wěn)定性 向空白毛發(fā)中添加1、5、25、100 ng/g的112種合成大麻素類物質，按照1.3.2節(jié)方法處理，在室溫下2 h內重復進樣6次提取液，放置4 ℃冰箱冷藏6天后再次重復進樣6次，比較前后2次測定響應值的平均值。結果表明，放置6天后，5F-BTP7AIC的響應值顯著降低，4個加標水平為冷藏前的0%～27.7%，這可能是由于該物質中酯鍵與含有氮原子的三唑環(huán)相連易發(fā)生分子內催化酯水解；吲唑酰胺及吲哚酰胺類合成大麻素響應降至冷藏前的50%～70%，表明該類結構物質的穩(wěn)定性欠佳；其余大部分合成大麻素響應降為冷藏前70%～95%。以上結果表明，毛發(fā)樣品處理后應立即檢測，避免長期放置，以保證實驗結果的準確性和可靠性。

2.5 實際樣品分析

利用本方法檢測某地公安部門采集的15份疑似吸食合成大麻素人員的毛發(fā)樣品，檢出4CN-CUMYL-BUTINACA、MDMB-4en-PINACA、4F-MDMB-BUTICA、ADB-BUTINACA、5F-MDMB-PICA等5種合成大麻素類物質，含量為1.4～48.2 ng/g，詳細結果列于表2。其中2號檢材檢出了所有5種物質，各物質的MRM通道均未出現(xiàn)干擾峰，結果示于圖6，表明本方法所選離子對的特異性好、抗干擾能力強。合成大麻素類物質種類繁多，更新?lián)Q代迅速，且常見多種混合使用的情況，以上5種物質均為近半年來國家毒品實驗室在繳獲樣品中檢出頻率較高的品種。在實際樣品檢測中，篩查方法應納入盡量多的目標物以避免漏檢，本方法涵蓋了國內已發(fā)現(xiàn)的所有合成大麻素類物質，同時可根據流行趨勢監(jiān)測結果增加新發(fā)現(xiàn)的物質，具有較高的實用性和擴展性。

圖6 2號檢材中檢出的5種合成大麻素MRM色譜圖Fig.6 Chromatograms of five synthetic cannabinoids detected in the sample 2

3 結論

本研究建立了UPLC-MS/MS法同時檢測毛發(fā)中112種合成大麻素類物質，并對提取回收率、基質效應、日內和日間精密度、檢出限、定量限、線性范圍等參數(shù)進行考察，可成功用于實際毛發(fā)樣品的檢測。本研究實現(xiàn)了對毛發(fā)中目前國內已發(fā)現(xiàn)的所有合成大麻素類物質的同時定性和定量分析，能有效區(qū)分化學結構和性質接近的類似物，前處理方法簡便、分析耗時短，可用于實際工作中大批量樣品的檢測。