楊治華 陳雪梅 陳春樺 張麗苗 董 智 譚 雪 李昌曉

(三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室 西南山地生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)國家級培育基地 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 重慶 400715)

三峽水庫自成功運行以來，采取“蓄清排渾”的運行方式，水位海拔145～175 m。由于水庫水位周期性漲落，水庫兩岸形成了兩條平行的垂直落差達(dá)30 m，總面積約348.93 km2的季節(jié)性水位消落帶(樊大勇等， 2015)。新形成的水庫消落帶具有水淹時間長、水淹深度大、水淹反季節(jié)性等特點。生長環(huán)境的巨大變化和反季節(jié)水淹的頻繁干擾導(dǎo)致原有大部分植物因不能適應(yīng)而逐漸消亡(盧志軍等2010; 樊大勇等2015)。三峽庫區(qū)消落帶面臨生物多樣性降低、水土流失嚴(yán)重以及生態(tài)系統(tǒng)退化等一系列問題(揭勝麟等， 2012； 朱妮妮等， 2015)。因此，三峽水庫消落帶植被的恢復(fù)重建對維持三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境的健康和穩(wěn)定具有十分重要的意義。研究表明，池杉(Taxodiumdistichumvar.imbricatum)能夠耐受三峽水庫蓄水導(dǎo)致的長時間和反季節(jié)水淹的頻繁干擾，為三峽庫區(qū)消落帶適生木本植物(李昌曉等， 2008； 王朝英等， 2012； 李波等， 2015； 賀燕燕等， 2018； 劉明輝等， 2020)。

池杉為裸子植物杉科(Taxodiaceae)落羽杉屬(Taxodium)(落羽松屬)落葉陽性大喬木，是古老的孑遺植物(鄭萬鈞等， 1978； 于永福，1994),原產(chǎn)于美國東南部和墨西哥灣沿岸，現(xiàn)在我國長江南北及珠江、淮河流域廣范栽培(楊美凌， 2010)。除了具有耐水淹特性，池杉還具有耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)、生長迅速、木材性能好、觀賞價值高等優(yōu)點(汪企明等， 1993，1995)，是庫區(qū)消落帶植被恢復(fù)和江河濕地造林的優(yōu)良樹種，因此研究其生產(chǎn)擴(kuò)繁技術(shù)具有非常重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值(李曉玲等， 2016)。種子繁殖是植物最常見的繁殖方式，但池杉種子不加處理直接播種育苗后發(fā)芽遲緩，苗木出土參差不齊, 連續(xù)時間長達(dá) 60余天，少數(shù)甚至隔年出苗，因此，耗種量大，成苗率低，生產(chǎn)管理困難(史忠禮等， 1984； 鄒雪生，1991； Liuetal.， 2009)。

種子休眠是具有正常活力的種子在適宜的光照、溫度、水分和氧氣等環(huán)境條件下仍不能萌發(fā)的現(xiàn)象(Baskin，1998； Finch-Savage， 2006)。種子的休眠特性是植物為適應(yīng)氣候變化、溫度差異、水分條件等環(huán)境因素并保持自身繁殖發(fā)展而形成的一種生物學(xué)特性。不同標(biāo)準(zhǔn)將種子休眠劃分為不同類型。Baskin 分類系統(tǒng)(Baskinetal.， 2004)使用類型、級別和模式作為分類系統(tǒng)的3個層次，將種子休眠劃分為5種休眠類型： 物理休眠(physical dormancy, PY)是因種皮或果皮透水、透氣不良或產(chǎn)生機(jī)械阻力而導(dǎo)致的種子無法萌發(fā)； 生理休眠(physiological dormancy, PD)是因種子內(nèi)部存在抑制物質(zhì)而導(dǎo)致的種子無法萌發(fā)； 形態(tài)休眠(morphological dormancy, MD)是因種胚沒有發(fā)育完全，經(jīng)過一段時間使胚發(fā)育完全后種子才能萌發(fā)； 形態(tài)生理休眠(morphophysiological dormancy, MPD)是因種胚未發(fā)育完全而導(dǎo)致的生理休眠； 復(fù)合休眠(combinational dormancy, PY+PD)是因種皮或果皮不透水，同時種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物，即兼具物理休眠和生理休眠。從生物學(xué)角度來講，種子休眠是植物經(jīng)長期演化所獲得的一種對環(huán)境條件及其季節(jié)性變化的生物學(xué)適應(yīng)(Guillaumeetal.， 2017)，對植物的生存、延續(xù)和種質(zhì)資源的可持續(xù)利用均有積極作用，但也給造林、育種、引種和繁殖等帶來困難。

Murphy等(1975)研究表明，池杉種子不存在胚休眠現(xiàn)象，萌發(fā)率低是由于硬且不透水的種皮物理障礙造成的。史忠禮(1980)研究認(rèn)為，池杉種子胚本身具備發(fā)芽能力，只是由于種子的其他部位存在抑制物質(zhì)，從而抑制了胚的萌發(fā)，且似屬ABA(abscisic acid, ABA)的抑制物大部分存在種皮中。Downie等(1996)研究指出，從針葉樹種子中切除的胚置于水中時萌發(fā)，這表明包圍胚的種子組織(種皮、珠心殘體和雌配子體)起著抑制和防止胚根出現(xiàn)的作用。目前，對池杉種子休眠原因的研究較為初步且不夠全面，鑒于此，本試驗旨在通過探索種皮特性，主要包括池杉種子結(jié)構(gòu)、吸水性、內(nèi)源抑制物等與種子休眠的關(guān)系，系統(tǒng)研究休眠原因，進(jìn)一步明確休眠類型，以期為采取措施提高種子的發(fā)芽率和整齊性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

池杉種子產(chǎn)自江蘇省常州市(31°09′—32°04′N、119°08′—120°12′E)，于 2019 年 12月下旬采收，置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。?nèi)源抑制物發(fā)芽試驗所用小白菜(Brassicachinensis)種子品種為快菜538，于2020年7月15日購于興農(nóng)種業(yè)，種子純度≥95%，發(fā)芽率≥85%，水分含量≤7%。

1.2 種子形態(tài)觀察及特征指標(biāo)測定

觀察池杉種子形狀、質(zhì)感、色澤等； 用四分法隨機(jī)選取3×100粒池杉種子，用游標(biāo)卡尺測定種子的縱徑、橫徑、厚度(以種子腹面到背面種脊的最大距離)，以平均值作為種子大?。?依據(jù)《GB2772-1999 林木種子檢驗規(guī)程》，采用百粒法測定種子千粒質(zhì)量。

1.3 種子結(jié)構(gòu)及種皮超微結(jié)構(gòu)觀察

取經(jīng)98%濃硫酸處理15和30 min、60 ℃熱水處理15 min的池杉種子各10粒，參考Ren等(1999)的研究方法將其置于FAA固定液中固定即經(jīng)過乙醇系列(50%，2 h； 70%，17 h； 90%，2 h； 100%，2 h)脫水，然后用100%乙醇脫水3次(每次12 h)，最后轉(zhuǎn)入乙酸異戊酯置換后進(jìn)行臨界點干燥、噴金。在飛納掃描電子顯微鏡下選擇近胚端觀察種子橫斷面及表面等結(jié)構(gòu)，以未進(jìn)行處理的種子為對照并進(jìn)行記錄拍照。

1.4 種子生活力和發(fā)芽率

1.4.1 種子活力測定 依據(jù)《GB2772-1999 林木種子檢驗規(guī)程》，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測定種子生活力。參考宋廷茂(1984)的研究方法，對染色結(jié)果進(jìn)行鑒定： 凡種胚全部染成紅色，種胚的基部少許未染色(少于胚莖長度的1/3)，胚莖少許未染色，或子葉少許未染色者，均稱為有生活力的種子； 而種胚全部沒有染上顏色，或僅有淺紅色斑點，或胚莖呈環(huán)形未染色者，均視為無生活力的種子。

1.4.2 種子萌發(fā)試驗 選取飽滿池杉種子，用2%硫酸銅溶液消毒15 min，清水洗凈后置于內(nèi)墊雙層濾紙的培養(yǎng)皿(φ9 cm)，每皿40粒，5個重復(fù)，保持濾紙濕潤，在人工氣候箱25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，周期性光照(12 h·d-1)，光強(qiáng)3 000 lx，胚根超過2 mm即為萌發(fā)，每2天觀察記錄萌發(fā)情況，計算萌發(fā)指標(biāo)。本試驗用萌發(fā)時滯(germination time lag，GTL)、發(fā)芽勢(germination energy，GE)、萌發(fā)率(germination percentage，GP)3個參數(shù)評價萌發(fā)效果。GTL(d)為萌發(fā)啟動時間，指從萌發(fā)試驗開始到第1粒種子開始萌發(fā)所用時間； GE(%)=第15天萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%； GP(%)=萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。萌發(fā)時長設(shè)定為30天。

1.5 種皮透水性及種子各部分含水量的測定

分別取自然風(fēng)干的完整種子、刻傷處理種子(刀片割破種皮)、98% H2SO4酸蝕30 min的種子各50粒，參考山金鳳等(2019)的研究，測定種子吸水率。

種子吸水率(%)= (Wt―W0)/W0× 100%，式中：Wt為種子吸水t時間后3次測量的質(zhì)量平均值，W0為種子吸水前起始質(zhì)量。吸水完畢以時間為橫坐標(biāo)，吸水率為縱坐標(biāo)，繪制吸水曲線。

在種皮透水性測定結(jié)束后，將飽和狀態(tài)的池杉種子剝離出種皮和剩余部分(主要包括雌配子體和胚，以下簡稱種仁)，以未處理的完整干種子為對照，將其種皮與種仁分別放入鋁盒中，采用恒高溫烘干法測定并計算種子各部分含水量，以了解在吸水試驗中池杉種皮和種仁的吸水能力以及種皮是否阻礙種仁吸水。

各部分含水量(%)=(m1-m2)/(m1-m3)×100%，式中:m1為樣品盒和蓋及樣品的烘前質(zhì)量(g)；m2為樣品盒和蓋及樣品的烘后質(zhì)量(g)；m3為樣品盒和蓋的質(zhì)量(g) 。

1.6 池杉種子內(nèi)源抑制物的提取和生物測定

1.6.1 種子各部分甲醇浸提液的提取 準(zhǔn)確稱量池杉完整種子、種皮、種仁10 g，在預(yù)冷的研缽內(nèi)研碎后過1 mm篩，用4～10倍體積的80%的甲醇溶液，在4 ℃下恒溫密閉浸提，期間多次取出搖動使其充分浸提。24 h后過濾，然后再重復(fù)2次，混合3次所得浸提液，56 ℃減壓濃縮，蒸干后用甲醇溶解瓶內(nèi)干物質(zhì)，定容至25 mL(即濃度為0.4 g·mL-1)，分別取醇提液制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2 g·mL-1的溶液待用。

1.6.2 提取液的生物測定 將1.6.1中所述的溶液各3 mL置于內(nèi)墊雙層濾紙的培養(yǎng)皿(Φ9 cm)中，待有機(jī)溶液完全揮發(fā)后，每個培養(yǎng)皿中再加入3 mL蒸餾水和50 粒白菜種子。以同體積蒸餾水作為對照，每個處理3個重復(fù)。將各培養(yǎng)皿均勻的置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，用40 ℃浸泡20 min后的白菜籽進(jìn)行不同提取液種類及濃度的發(fā)芽影響測定，以鑒定抑制物活性。以胚根長至白菜籽的2倍為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，48 h后統(tǒng)計白菜籽的發(fā)芽率，72 h后用游標(biāo)卡尺測量白菜的苗高和根長。

1.7 種皮各溶劑相生物測定

按系統(tǒng)溶劑法(李慶梅等， 2013)，將種皮甲醇浸提液分離為石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相，取各分離相制取質(zhì)量濃度為0.5、1 g·mL-1的溶液待用。按1.6.2方法對各分離相進(jìn)行生物活性測定，生物測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理，利用 SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD 法檢驗其差異顯著性，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE) 表示，用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 池杉種子基本形態(tài)

池杉種子外部輪廓呈不規(guī)則三角形或多邊形，微扁； 表面光滑，有光澤，合點區(qū)(即發(fā)育成熟的種子與種鱗的分離點)表面粗糙； 有明顯尖銳的種脊，皮厚，堅硬，具有瘤和凸緣(圖1A)； 種子紅褐色，極少數(shù)深褐色。去除種皮的種仁呈長橢圓形，胚乳及胚呈乳白色(圖1B)，胚乳表面被覆淡褐色膜質(zhì)珠心膜(圖1C)，子葉4～9片(圖4D)； 種子長(11.72±0.19) mm，寬(6.04±0.12) mm，厚(6.00±0.11) mm，千粒質(zhì)量為(88.5±0.09)g； 種皮質(zhì)量約占種子質(zhì)量的71.61%。

2.2 種子生活力和發(fā)芽率

池杉種子的生活力測定結(jié)果為： 胚呈紅色，具有生活力的種子占80.95%，未完全染色不具備生活力的種子占8.38%，無胚或胚已皺縮的空粒種子占10.67%。池杉種子發(fā)芽試驗的萌發(fā)率為0，說明存在極顯著的休眠現(xiàn)象。

2.3 種皮的超微結(jié)構(gòu)

包被池杉種胚的組織主要包括種皮、殘余珠心(珠心膜和珠心帽)和胚乳(即雌配子體)。其中，種皮的光滑表面是外表皮(圖2A1)，它由1層縱向伸長的薄壁細(xì)胞組成(圖2A2)，紋飾清晰，外表面覆蓋著蠟質(zhì)。外表皮在處理和儲藏過程中極易脫落，圖2A3為外表皮自然脫落的種皮橫切面，顯示外表皮下面是種皮層，池杉種皮分為外種皮、中種皮和內(nèi)種皮3層。外種皮由1或2層形狀較規(guī)則的薄壁細(xì)胞組成，細(xì)胞排列緊密，無明顯間隙； 中種皮是種皮主要的堅硬部分，由數(shù)層排列緊密且強(qiáng)烈木質(zhì)化的厚壁細(xì)胞組成，這些細(xì)胞的細(xì)胞壁分布大量紋孔； 內(nèi)種皮是種皮的最內(nèi)層，在成熟的干種子中，內(nèi)種皮由來自薄壁細(xì)胞的壓縮死細(xì)胞組成，這些細(xì)胞在種子發(fā)育過程中逐漸退化(Tillman-Sutelaetal.， 1995a； 1995b)，從種皮的橫切面來看，池杉的內(nèi)種皮以鱗片層的形式出現(xiàn)在中種皮的內(nèi)表面(圖2A3)。

圖1 池杉種子的解剖結(jié)構(gòu)Fig. 1 The anatomical structures of Taxodium distichum var. imbricatumA：種子正面; B：種子橫切面; C：種仁; D：胚。ch:合點區(qū); mi: 珠孔; mg: 雌配子體; em:種胚; nc: 珠心帽; nr: 珠心殘余, 珠心膜; co: 子葉. A: Front of the seed; B: Cross section of seed; C: Kerne; D: Embryo. ch: Chalazal region; mi: Micropyle; em: Embryo; nc: Nucellar cap; nr: Nucellar remnants; co: Cotyledons.

與對照相比，熱水處理過程中外表皮全部脫落，外種皮裸露出來，與外表皮細(xì)胞相比，外種皮細(xì)胞較短，表面紋飾清晰，細(xì)胞排列緊密，未出現(xiàn)紋孔和明顯細(xì)胞縫隙(圖2B1,B2)； 熱水處理后的種皮橫切面顯示，池杉種皮結(jié)構(gòu)無明顯改變，細(xì)胞層仍然排列緊密，與對照組無明顯區(qū)別(圖2B3)。經(jīng)98%酸蝕15 min 后，與對照相比，種皮表面紋理被破壞，并出現(xiàn)許多腐蝕裂痕和腐蝕坑，有紋孔出現(xiàn)(圖2C1、C2)； 從橫切面來看，種子外表皮和外種皮已被完全腐蝕，種皮結(jié)構(gòu)受損，中種皮裸露并變薄(圖2C3)，酸蝕15 min增強(qiáng)了種皮透性。酸蝕30 min 后種皮結(jié)構(gòu)種皮表面出現(xiàn)大量腐蝕裂痕和腐蝕坑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞(圖2D1、D2)； 中種皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)細(xì)胞壁上的紋孔清晰可見，種皮結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，中種皮進(jìn)一步變薄，種皮透性進(jìn)一步增加(圖2D3)。

圖2 池杉種皮的超微結(jié)構(gòu)Fig. 2 The ultrastructure of seed coat of Taxodium distichum var. imbricatumA1-A2: 對照,未處理種子表面; A3: 外表皮自然脫落的種皮橫切面; B1-B2: 60 ℃處理15 min后的種皮表面; B3: 60 ℃處理15 min后的種皮橫切面; C1-C2: 酸蝕15 min后種皮表面; C3: 酸蝕15 min后種皮橫切面; D1-D2: 酸蝕30 min后種皮表面; D3: 酸蝕30 min后種皮橫切面. ep:外表皮; sa:外種皮; scl:中種皮; en: 內(nèi)種皮; mg: 雌配子體; pi: 紋孔; nr: 珠心殘余, 珠心膜. A1- A2: Control, untreated seed surface; A3: Cross section of seed coat in which the epidermis has fallen naturally; B1-B2: Surface of seed coat treated at 60 ℃ for 15 min; B3: Cross section of seed coat treated at 60 ℃ for 15 min; C1-C2: Seed coat surface after acid-scarified 15 min; C3: Cross section of seed coat after acid-scarified 15 min; D1-D2: Seed coat surface after acid-scarified 30 min; D3: Cross section of seed coat after acid-scarified 30 min; ep: epicuticle; sa: sarcotesta; scl: sclerotesta; en: endotesta; mg: megagametophyte; pi: pits; nr: nucellar remnants.

2.4 種皮的透水性

池杉種子的吸水曲線見圖3，可知酸蝕處理、刻傷處理與完整種子吸水曲線變化趨勢相似，吸水率隨時間延長而增加。在開始吸水的24 h內(nèi)，各處理吸水速度都很快，酸蝕處理的最快，吸水率達(dá)到46.39%； 吸水24 h后各處理種子的吸水速度均有所放緩。刻傷處理和完整種子經(jīng)過96 h吸水后，吸水率趨向穩(wěn)定，維持在38%左右。酸蝕處理種子經(jīng)168 h吸水后，種子吸水率穩(wěn)定在65%左右。完整種子和刻傷處理種子的吸水基本一致，差異不顯著(P>0.05)，但酸蝕處理種子吸水率顯著增大，達(dá)到極顯著差異(P<0.01)。由此可見，池杉種子自然吸水過程大致分為3個時期，即快速吸水期(0～24 h)、緩慢吸水期(24～96 h)、近飽和期(96～240 h)。

將完全吸水飽和的池杉種子進(jìn)行解剖，分離出種皮和種仁兩部分，測定含水量，以未經(jīng)吸水性測定的干種子作為對照，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，經(jīng)不同處理的池杉種子種皮含水量均高于胚乳，在吸水達(dá)到完全飽和后，完整種子種皮含水量(42.58%)與刻傷處理種皮含水量(42.08%)無顯著差異(P>0.05)，而酸蝕處理(53.66%)的種皮含水量與完整種子差異顯著(P<0.05)，這可能是由于酸蝕增強(qiáng)了種皮透性，促進(jìn)了種子吸水。與對照組相比，完整種子、酸蝕種子和刻傷處理種子的種仁含水量分別比對照高出25.84%、35.03%和28.69%，酸蝕處理的種仁含水量最高(41.65%)，與完整種子差異極顯著(P<0.01)； 完整種子含水量(32.46%)與刻傷后的種仁含水量(35.30%)無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同種皮處理對池杉種子吸水率的影響Fig.3 Effects of different coat treatments on water absorption rate of T. distichum var. imbricatum seeds

圖4 不同處理種子的種皮、種仁含水量差異Fig. 4 The effects of different treatments on water contents of seed coat and kernel不同大寫字母表示相同處理不同部位有顯著性差異，P<0.05； 不同小寫字母表示相同部位不同處理有顯著性差異(P<0.05)。下同。The different capital letters indicate significant differences in different parts of the same treatment, P<0.05; the different lowercase letters indicate significant differences in the same parts under different treatments (P<0.05). The same below.

2.5 池杉種子各部分甲醇浸提液對白菜幼苗苗高和根長的影響

由圖5可知，在濃度0.2和0.4 g·mL-1的種子浸提液中，白菜苗高均值分別為對照(12.49 mm)的79.77%和 76.40%。說明池杉種子的浸提液對白菜幼苗生長有抑制作用，且抑制作用隨濃度增大而增強(qiáng)。在濃度0.2和0.4 g·mL-1的種皮浸提液濃度中的白菜苗高分別為分別為對照(12.49 mm)的81.88%和77.76%，與種子浸提液無顯著差異(P>0.05)； 但在濃度0.2和0.4 g·mL-1的種仁浸提液下，白菜苗高分別為對照的90.83%和87.65%。由此說明，池杉種子不同部位的甲醇浸提液對白菜幼苗生長的抑制作用不同，表現(xiàn)為種皮的抑制作用高于種仁，抑制作用隨提取液濃度增大而增強(qiáng)。

在0.2和0.4 g·mL-1的種皮浸提液下的根長分別為分別為對照(33.67 mm)的86.21%和62.51%； 在0.2和0.4 g·mL-1的種仁浸提液下的根長分別為對照的134.60%和97.26%。方差分析和多重比較結(jié)果表明： 0.4 g·mL-1的種子浸提液抑制作用與種皮浸提液有極顯著差異(P<0.01)，與種仁浸提液無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明，種皮對白菜根長抑制作用最強(qiáng)，且抑制效應(yīng)隨濃度增大而增加，種仁未表現(xiàn)出明顯抑制作用。由此可初步證實池杉種子含有內(nèi)源抑制物質(zhì)，且基本存在于種皮。

圖5 池杉種子不同部分甲醇浸提液對白菜苗高和根長的影響Fig.5 The effects of methanol extracts from different fractions of T. distichum var. imbricatum seeds on shoot length and root length of Brassica pekinensis

圖6 池杉種皮各溶劑相對白菜幼苗苗高和根長的影響Fig.6 The effects of different separation phase of Taxodium distichum var. imbricatum seeds coat on shoot length and root length of Brassica pekinensis

2.6 池杉種皮各溶劑相對白菜幼苗苗高和根長的影響

由圖6可知，在0.5 g·mL-1的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相下的白菜平均苗高分別為對照(12.70 mm)的68.39%、81.05%、85.92%、80.91%和93.81%，各分離相抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為石油醚相>甲醇相>乙醚相>乙酸乙酯相>水相。1 g·mL-1的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相下的白菜平均苗高分別為對照的63.54%、74.37%、71.76%、75.06%和83.33%，各分離相抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為石油醚相>乙酸乙酯相>乙醚相>甲醇相>水相。方差分析和多重比較表明，石油醚相與其他各相呈極顯著差異(0.5 g·mL-1時F=14.692，P<0.01； 1 g·mL-1時F=10.329，P<0.01)。以上結(jié)果說明，池杉種皮甲醇浸提液分離出的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相以及水相對白菜幼苗苗高生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制作用隨濃度提高而增強(qiáng)，且石油醚相中的抑制物質(zhì)抑制活性最強(qiáng)。

在0.5 g·mL-1的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相下的白菜平均根長分別為對照(31.09 mm)的56.00%、108.40%、102.60%、92.89%和102.78%，各分離相抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為石油醚相>甲醇相>乙酸乙酯相>水相>乙醚相。在1 g·mL-1的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相下的白菜平均根長分別為對照的44.36%、107.90%、100.89%、79.40%和100.16%，各分離相抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為石油醚相>甲醇相>水相>乙酸乙酯相>乙醚相。方差分析和多重比較表明，石油醚相與其他各相呈極顯著差異(0.5 g·mL-1時F=105.284，P<0.01； 1 g·mL-1時F=250.853，P<0.01)。由此說明，乙酸乙酯相、水相和乙醚相未表現(xiàn)出明顯抑制作用，但幼苗根長隨濃度增大有下降趨勢。對白菜幼苗根生長表現(xiàn)出抑制作用的主要為石油醚相和甲醇相，且抑制作用隨濃度增大而增強(qiáng)。池杉種皮中抑制活性強(qiáng)的抑制物質(zhì)主要集中于石油醚相。

4 討論

4.1 種皮結(jié)構(gòu)和種子休眠關(guān)系

種子萌發(fā)的第一步是吸水，只有充分吸水，才能引起相關(guān)酶的活化，進(jìn)而增強(qiáng)種子的呼吸作用和同化速率(趙群金等， 1998； 顏升等， 2014)。種皮是最先接觸到水的結(jié)構(gòu)，種子的外源休眠往往與種皮有關(guān)，了解種皮結(jié)構(gòu)、測定種皮透性有利于了解休眠原因(尹黎燕等， 2002)。池杉種皮厚且堅硬，占據(jù)了種子大部分質(zhì)量，且被覆蠟質(zhì)，外種皮細(xì)胞排列緊密，內(nèi)種皮含有木質(zhì)素、蠟和黃褐色色素(Renetal., 1999)，但由于外表皮易脫落，中種皮分布大量紋孔等原因，推測池杉種皮對水分吸收具有一定阻礙，但不會完全抑制種仁的吸水。熱水處理和酸蝕處理是增強(qiáng)種子透性的有效方法，不僅可以使種皮龜裂、軟化，還能去除種皮表面的蠟質(zhì)和油脂，改善種皮的透性，促進(jìn)種子萌發(fā)(楊期和等， 2006)。但本試驗的熱水處理未對池杉種皮的微型態(tài)造成影響，細(xì)胞排列和種皮結(jié)構(gòu)無明顯變化，說明熱水處理對促進(jìn)池杉種皮透性無明顯作用。在酸蝕處理后，種皮表面出現(xiàn)的裂痕和腐蝕坑有利于增強(qiáng)種子的透性，且酸蝕處理會使種皮變薄，胚根萌出的機(jī)械束縛減弱，有利于種子吸漲和萌發(fā)。但濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，處理時間過長易對種胚造成傷害，本試驗中酸蝕30 min未對種胚造成損傷，但是否可以進(jìn)一步延長處理時間還有待進(jìn)一步研究。

池杉種皮存在一定透水性，無論種皮是否破損，種仁均能吸收到部分水分。在吸水試驗結(jié)束后的解剖過程中發(fā)現(xiàn)，與完整種子和刻傷處理種子相比，酸蝕處理的種子更易沿種脊分為兩半，且與完整種子相比，酸蝕處理的種仁含水量高，這可能是由于酸蝕處理使種皮變薄，削弱了種子的機(jī)械束縛，從而促進(jìn)了種子進(jìn)一步吸水膨脹。吸水96 h時，完整種子已經(jīng)接近飽和，而酸蝕種子還在緩慢吸水的現(xiàn)象。由此推測，池杉種皮的透水性可能不是影響種子萌發(fā)的主要因素，但厚且堅硬的種皮可能對種胚吸漲產(chǎn)生了嚴(yán)重的機(jī)械阻力，進(jìn)而可能抑制胚根的生長和伸長，造成種子萌發(fā)遲緩。這與青錢柳(Cyclocaryapaliurus)(楊萬霞等， 2005)、華西小石枳(Osteomelesschwerinae)(李佛蓮等， 2016)、歐洲冬青(Ilexaquifolium)(賈有偉等， 2017)和白皮松(Pinusbungeana)(Guoetal., 2018)等的研究結(jié)果相似，其種皮均有一定透水性，但堅硬種皮的機(jī)械障礙對種子萌發(fā)產(chǎn)生了一定抑制作用但與枳椇(Hoveniaacerba)(李英等， 2014)、東京野茉莉(Styraxtonkinensis)(趙婕等， 2019)和合歡(Albiziajulibrissin)(陳麗等， 2019)等的研究結(jié)果不同，這些物種種子的種皮結(jié)構(gòu)致密，存在透水障礙、透氣性差等問題，是導(dǎo)致種子休眠的主要原因。本試驗表明池杉種皮所產(chǎn)生的機(jī)械束縛使種子可能具有物理休眠特性。

4.2 內(nèi)源抑制物與種子休眠關(guān)系

內(nèi)源抑制物質(zhì)是隨著植物生長發(fā)育過程而產(chǎn)生的一系列天然化合物，影響細(xì)胞的分化、分裂、伸長和發(fā)育，最終推遲或抑制同種或異種植物種子發(fā)芽。抑制物的存在是引起植物種子休眠的主要原因之一(Kentzer， 2015)。喻梅等(2012)研究發(fā)現(xiàn)野生鴨兒芹(Cryptotaeniajaponica)種子中存在抑制物，其粗提液在較低濃度下即可抑制其種子萌發(fā)； 李慶梅等(2013)發(fā)現(xiàn)櫟類(Quercus)種子中含有抑制物質(zhì)，其主要抑制種子萌芽和生長； 閆芳等(2016)認(rèn)為黃瑞香(Daphnegiraldii)種子有內(nèi)源抑制物，尤其是種胚是引起種子休眠的主要原因。在本研究中，對照條件下白菜種子萌發(fā)率高且生長迅速，而池杉種子浸提液對白菜苗高和根長有一定抑制作用，說明池杉種子含有內(nèi)源抑制物質(zhì)，能抑制異種植物種子萌發(fā)。將池杉種子分為種皮和種仁兩部分，分別進(jìn)行甲醇浸提和白菜苗高和根長的生物測定后表明，抑制物質(zhì)存在于種皮中。

種子內(nèi)部存在的抑制物質(zhì)種類多樣，常見的有氰化氧、酸類、香豆素、ABA、乙烯、酯類、芥子油、生物堿、芳香油等(Thomasetal.， 2000； 劉艷， 2007)，其種類不同，極性也有可能存在差異，因此通過系統(tǒng)溶劑法進(jìn)行分離后，抑制物質(zhì)就分別集中在各有機(jī)相中。黃耀閣等(1998)、張艷杰(2007)采用系統(tǒng)溶劑分離法分別對西洋參(Panaxquinquefolius)果實、南方紅豆杉(Taxuswallichianavar.mairei)種子的浸提液進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)西洋參果實抑制物質(zhì)主要存在于乙醚相和甲醇相中，南方紅豆杉的抑制物質(zhì)則主要集中在種皮的甲醇相中。尚旭嵐等(2011)采用系統(tǒng)分離法對青錢柳(Cydocaryapaliurus)果皮的浸提液進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)果皮的乙醚相中含有的香草酸等抑制物質(zhì)是導(dǎo)致青錢柳休眠的主要原因。本研究中的池杉種皮各分離相的生物測定結(jié)果表明，種皮甲醇浸提液的各分離相對白菜幼苗苗高和根長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中無論苗高還是根長，石油醚相的抑制作用最強(qiáng)，這說明池杉種皮中抑制作用較強(qiáng)的物質(zhì)主要集中于石油醚相中，即池杉種皮內(nèi)的抑制物質(zhì)可能是一些極性較小的物質(zhì)。這些物質(zhì)可能是導(dǎo)致池杉出苗不整齊的主要原因之一，由此說明池杉種子具有生理休眠特性。但內(nèi)源抑制物質(zhì)的成分鑒定還有待通過高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用等方法進(jìn)行分析，今后研究中可對池杉種皮浸提液各分離相對種子自身的抑制作用進(jìn)行探索，以期揭示池杉種子的休眠機(jī)制。

5 結(jié)論

池杉種子具有顯著休眠現(xiàn)象。池杉種皮的透水性不是抑制種子萌發(fā)的因素，種皮的機(jī)械障礙和抑制物質(zhì)可能是造成池杉種子休眠的主要原因，且這些抑制物質(zhì)可能是極性較小的物質(zhì)，因此池杉種子是兼具物理休眠和生理休眠的復(fù)合休眠。