耿瑜欣 李紅姣 鄭建偉 張 芹 于麗娜 李佳秋 李保會

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 保定 071000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院 保定 071000)

皂莢屬(Gleditsia)是雙子葉植物綱、薔薇目、豆科植物，約12種，多分布于熱帶和溫帶地區(qū)(蘭彥平等， 2006)，中國原產(chǎn)8種，引進(jìn)1種，分布與栽培于我國各個省區(qū)，覆蓋區(qū)約占國土面積的50% (顧萬春等， 2003)，喜光，稍耐蔭，具有較強(qiáng)的耐旱性，多生于山坡林中或谷地、路旁，屬深根性植物，在微酸性、石灰質(zhì)、輕鹽堿土甚至粘土或砂土也能正常生長，壽命可達(dá)六七百年(范理璋， 2008)。皂莢樹的干燥棘刺，又稱皂刺、皂針等，中國藥典中記載： 皂刺有消腫、脫毒、排膿和殺蟲等功效。用于癰疽初起或膿成不潰； 外治疥癬麻風(fēng)(國家藥典委員會， 2020)，是傳統(tǒng)的藥材用料。

近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)皂刺中含有黃酮、酚酸、香豆素、甾醇、內(nèi)酯、三萜皂苷等多種成分，具有抗氧化(宋忠興等， 2019)、抗菌(Lietal., 2016)、抗癌(Parketal., 2014)、提高免疫力等作用，因此皂刺在臨床上應(yīng)用非常廣泛(張妍等， 2017； 劉偉杰， 2013)，且皂刺的萜類化合物在工業(yè)上也發(fā)揮著重要作用(Jiangetal., 2007)。因其綜合利用價值高，供需不平衡，導(dǎo)致皂莢樹種植面積迅速擴(kuò)大，但由于過分關(guān)注前期效益，皂莢栽培過程中出現(xiàn)種類雜亂、低產(chǎn)量、低質(zhì)量等問題，影響了皂莢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和效益的提升。

代謝組學(xué)用于特定時期生物體內(nèi)所有代謝物的定性和定量分析，研究對象多為相對分子質(zhì)量小于1000的小分子物質(zhì)(楊軍等， 2005)。植物代謝組學(xué)分析的對象包括初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。前者主要包括碳水化合物、氨基酸、普通脂肪酸、核酸等，是維持植物生長和生命活動的必需物質(zhì)(Bourgaudetal., 2001)，后者的產(chǎn)生受發(fā)育程度、組織分化和影響生物合成基因表達(dá)的外界刺激因素的控制(邱立友等， 2010)，它的產(chǎn)生和分布通常與物種、器官、組織和生長階段有關(guān)(Vinaleetal., 2010)。許多植物的活性藥用成分都是其中的次生代謝物，并且在人工種植條件下，產(chǎn)量有賴于初級代謝產(chǎn)物的積累，品質(zhì)取決于次生代謝產(chǎn)物的積累。植物次生代謝的過程是保證藥用成分質(zhì)量和有效性的基礎(chǔ)(蘇文華等， 2005)。近年來，眾多學(xué)者利用代謝組學(xué)的方法研究苦蕎(Fagopyrumtataricum)(Lietal., 2019)、銀杏(Ginkgobiloba)(Mengetal., 2019)、柑橘(Citrusreticulata)(Wangetal., 2019)等植物中代謝產(chǎn)物的差異。

本研究以皂莢(G.sinensis)和野皂莢(G.microphylla)干燥棘刺為研究對象，基于UPLC-MS/MS自建平臺和自建數(shù)據(jù)庫，檢測并分析皂刺中的次生代謝物，探索和分析差異代謝物的代謝途徑和代謝機(jī)制，為皂刺功能性化合物的分離鑒定以及研究開發(fā)提供理論依據(jù)，進(jìn)而為皂莢優(yōu)良品種的開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化效益的提升奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

皂莢刺粗壯，有長的分枝，多呈圓錐狀，長達(dá)16 cm(CS-1-3)； 野皂莢刺通常較細(xì)，1或2個短分支，刺長約1.5～5 cm，(WS-1-3)(王世依等， 2016)(圖1)。

皂刺采集地點(diǎn)為河北省保定市(38°29′15.42″N，115°34′39.65″E)，生長環(huán)境、栽培措施一致，采集時間為2020年11月，兩個種分別選取3株長勢一致的植株作為3個重復(fù)，均為種子繁殖，約20年生，隨機(jī)采集其1年生刺，迅速用酒精擦拭干凈，切成小段放入離心管后放入液氮中，后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 皂刺取樣示例Fig. 1 Examples of spina gleditsiae sampling

1.2 樣品處理

生物樣品放置于凍干機(jī)(Scientz-100F)中真空冷凍干燥； 利用研磨儀(MM 400, Retsch)研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀； 稱取100 mg溶于1.2 mL 70% 的甲醇提取液中； 每30 min渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，樣本置于4 ℃冰箱過夜； 離心(轉(zhuǎn)速 12 000 r·min-1，10 min)后，吸取上清液，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 液相條件 色譜柱： Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm； 流動相： A相為超純水(加入0.1%的甲酸)，B相為乙腈(加入0.1%的甲酸)； 洗脫梯度： 0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min； 流速0.35 mL·min-1； 柱溫40 ℃； 進(jìn)樣量4 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 LIT和三重四極桿(QQQ)掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(Q TRAP)的AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運(yùn)行正負(fù)兩種離子模式。ESI源操作參數(shù)如下： 離子源，渦輪噴霧； 源溫度550 ℃； 離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負(fù)離子模式)； 離子源氣體I(GSI)，氣體II(GSII)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10和100 μmol·L-1聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體(氮?dú)?設(shè)置為中等。通過進(jìn)一步的DP和CE優(yōu)化，完成了各個MRM離子對的DP和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個時期監(jiān)測一組特定的MRM離子對。

1.4 質(zhì)控樣本

質(zhì)控樣本(QC)是3種皂刺的混合物，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。儀器分析過程中，每10個樣本插入1個質(zhì)控樣本，用來觀察分析過程的重復(fù)性是否良好。

1.5 數(shù)據(jù)結(jié)果評估

基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB4.0(metware database)，該數(shù)據(jù)庫屬于自建庫，物質(zhì)的信息來源包括公共數(shù)據(jù)庫、標(biāo)品數(shù)據(jù)庫和自解譜的數(shù)據(jù)，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性。代謝物定量是利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正(Fragaetal., 2010)。采用多元統(tǒng)計分析，對2組樣本進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)、聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)、 重復(fù)相關(guān)性評估、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)檢測所采集的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明這項研究中記錄的數(shù)據(jù)具有良好的可重復(fù)性和可靠性。結(jié)合單變量統(tǒng)計分析和多元統(tǒng)計分析的方法，初步篩選出不同品種或組織間的差異代謝物。后結(jié)合單變量分析P值(P-value)或差異倍數(shù)值(fold change，F(xiàn)C)來篩選出顯著差異代謝物。用差異倍數(shù)值、OPLS-DA模型的VIP值來篩選差異代謝物，其篩選標(biāo)準(zhǔn)： VIP ≥ 1，P< 0.05，差異倍數(shù)值 ≥ 2 和差異倍數(shù)值 ≤ 0.5的代謝物為差異代謝物，并將對應(yīng)的顯著差異代謝物KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂刺樣品的代謝組總體分析

基于UPLC-MS/MS自建平臺和MWDB4.0數(shù)據(jù)庫，圖2是皂莢刺和野皂莢刺的樣品在正、負(fù)2種離子模式下的總離子流圖(total ion chromatography，TIC)，2個種的皂刺基本趨勢相似，但在個別時間有所差異。共檢測到457種次生代謝物(圖3)，包括酚酸169種，占36.9%； 黃酮137種，占29.9%； 木脂素和香豆素27種，占5.9%； 其他 32種，占7.0%； 鞣質(zhì)22種，占4.8%； 生物堿59種，占12.9%，萜類11種，占2.4%。酚酸物質(zhì)種類占比最多，其次是黃酮、生物堿等代謝物。酚酸、生物堿類在皂莢刺和野皂莢刺中含量均較多。

圖2 皂莢刺和野皂莢刺的總離子流圖Fig. 2 TIC of G. sinensis and G. microphylla spinesa：皂莢刺負(fù)離子模式； b：野皂莢刺負(fù)離子模式； c：皂莢刺正離子模式； d：野皂莢刺正離子模式。a： TIC of G. sinensis spines negative ion mode; b： TIC of G. microphylla spines negative ion mode; c： TIC of G. sinensis spines positive ion mode; d： TIC of G. microphylla spines positive ion mode.

圖3 皂莢和野皂莢刺中代謝物含量差異Fig. 3 Differences in the content of G. sinensis spines and G. microphylla spines metabolites

圖4 2組樣品的代謝組主成分分析(a)與聚類熱圖(b)Fig. 4 PCA(a) and HCA(b) of the 2 groups of samplesCS：皂莢G. sinensis； WS：野皂莢G. microphylla； Mix：混合樣本Mixed samples.

2.2 皂莢和野皂莢刺次生代謝物差異分析與篩選

通過對樣本(包括質(zhì)控樣品)進(jìn)行主成分分析，以便初步了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。全部樣本的主成分分析如圖4a所示，2組之間第一主成分貢獻(xiàn)值達(dá)39.36%，第二主成分貢獻(xiàn)值達(dá)15.9%，2組之間代謝有明顯的分離趨勢，且組間代謝物存在差異。利用代謝物在不同樣本間的積累模式進(jìn)行聚類分析，顯示不同種皂刺的次生代謝物可明顯分為2個聚類(圖4b)，樣本間的次生代謝物積累有顯著差異。

為進(jìn)一步了解皂莢和野皂莢刺次生代謝物間的差異，以皂莢刺為對照，結(jié)合差異倍數(shù)值來進(jìn)一步篩選出差異代謝物，選取差異倍數(shù)值 ≥ 2和差異倍數(shù)值 ≤ 0.5的代謝物。2個種的皂刺的顯著差異代謝物共213種，其中121種代謝物的含量在野皂莢刺中含量較高，包括55種酚酸，這些代謝物涉及到苯丙烷生物合成、黃酮類生物合成、色氨酸代謝、茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成； 54種黃酮，其涉及到黃酮類生物合成、異黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花色素生物合成； 5種木脂素和香豆素； 4種生物堿，涉及到脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝； 2種萜類，1種其他物質(zhì)(圖5)。92種物質(zhì)的含量在皂莢刺中含量較高，包括21種酚酸，它們涉及到泛醌和其他萜類-醌生物合成、葉酸生物合成、異喹啉生物堿的生物合成、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝； 19種黃酮，它們涉及到黃酮類生物合成、異黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成； 14種鞣質(zhì)； 14種生物堿，它們涉及到脂代謝、色氨酸代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、精氨酸和酪氨酸代謝； 8種木脂素和香豆素，涉及到苯丙烷生物合成、各種次生代謝產(chǎn)物的生物合成-第2部分； 16種其他，涉及到硫胺代謝、乙醛酸和二羧酸的代謝、碳代謝、2-氧代羧酸代謝、氨基酸的生物合成。

通過比較得出皂莢刺和野皂莢刺的差異代謝物主要集中在黃酮和酚酸類物質(zhì)。酚酸類差異代謝物主要集中在氨基酸代謝途徑和輔助因子和維生素代謝中； 黃酮類差異代謝物主要集中在和黃酮類次生代謝途徑中，生物堿類差異代謝物主要集中在氨基酸代謝途徑中，氨基酸可經(jīng)過一些特殊途徑轉(zhuǎn)變成生物堿。

圖5 差異代謝物分類Fig. 5 Differential metabolite classification

在對所檢測到的代謝物進(jìn)行定性和定量分析后，結(jié)合具體樣品的分組情況，比較了各分組中代謝物定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化。表1展示出經(jīng)差異倍數(shù)log2處理后排在前10的差異表達(dá)代謝物。與皂莢刺相比，野皂莢刺中含量升高的物質(zhì)包括5種酚酸、3種黃酮、1種木脂素和1種萜類； 含量降低的物質(zhì)包括3種黃酮，2種鞣質(zhì)，2種茋類，2種生物堿，1種香豆素。松柏苷屬于酚酸，在野皂莢刺中含量較高，是皂莢刺的19.41倍； 異牡荊素-2″-O-鼠李糖苷屬于黃酮，在皂莢刺中含量較高，是野皂莢刺的20.32倍。

2.3 皂莢和野皂莢刺相同代謝產(chǎn)物分析

皂莢和野皂莢刺的相同代謝產(chǎn)物如圖6所示，相同代謝產(chǎn)物中皂莢刺中含量較高(>1.00E+07)的有東莨菪苷、異莨菪亭、原花青素 B2、苯甲酰蘋果酸、二氫山奈酚-3-O-葡萄糖苷、檸檬酸*、對羥基苯甲酸、香草醛、奎寧酸、原花青素 B1、落新婦苷、異槲皮苷*，含量中等(1.00E+07-1.00E+06)的有香橙素、異杞柳苷、櫻桃苷、葫蘆巴堿、澤蘭黃酮、3-O-甲基槲皮素、原花青素 B3、芹菜素-6-C-(2″-葡萄糖基)阿拉伯糖苷、阿魏酰腐胺、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷*、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷*、蘆丁、5-O-對香豆?？鼘幩?、香葉木素-7-O-半乳糖苷、3-O-阿魏?？鼘幩?、阿魏酸-4-O-葡萄糖苷、木犀草素，含量較少(<1.00E+06)的有新綠原酸*、香葉木素*、高車前素*、綠原酸*、二咖啡?；Р菟帷㈤纹に?7-O-蕓香糖苷-4′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷-7-O-葡萄糖苷、異綠原酸B、異綠原酸C。

野皂莢刺中相同代謝產(chǎn)物含量較高(>1.00E+07)的有香葉木素-7-O-半乳糖苷、3-O-阿魏?？鼘幩?、二咖啡?；Р菟?、香葉木素*、5-O-對香豆?？鼘幩?、葫蘆巴堿、芹菜素-6-C-(2″-葡萄糖基)阿拉伯糖苷、蘆丁、澤蘭黃酮、高車前素*、香橙素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷*、異鼠李素-7-O-葡萄糖苷*、3-O-甲基槲皮素、阿魏酸-4-O-葡萄糖苷，含量中等(1.00E+07～1.00E+06)的有槲皮素-7-O-蕓香糖苷-4′-O-葡萄糖苷、綠原酸*、異綠原酸C、香草醛、槲皮素-3-O-蕓香糖苷-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、異槲皮苷*、異綠原酸B、新綠原酸*、苯甲酰蘋果酸、東莨菪苷、檸檬酸*、對羥基苯甲酸、奎寧酸、二氫山奈酚-3-O-葡萄糖苷、異杞柳苷，含量較少的有櫻桃苷、異莨菪亭、落新婦苷、阿魏酰腐胺、原花青素B2、原花青素B1、原花青素B3。

皂莢刺中優(yōu)勢代謝物(>2.00E+07)為東莨菪苷、異莨菪亭、原花青素B2，野皂莢刺的優(yōu)勢代謝物為香葉木素-7-O-半乳糖苷、3-O-阿魏酰奎寧酸、二咖啡酰基莽草酸、香葉木素*、5-O-對香豆酰奎寧酸、葫蘆巴堿。

表1 皂莢和野皂莢刺差異表達(dá)代謝物Tab.1 Differentially expressed metabolites of G. sinensis spines and G. microphylla spines

圖6 皂莢和野皂莢刺相同代謝產(chǎn)物的相對含量Fig. 6 Relative content of the same metabolites of G. sinensis spines and G. microphylla spines1：葫蘆巴堿Trigonelline； 2：對羥基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid； 3：香草醛Vanillin； 4：檸檬酸*Citric acid*； 5：異莨菪亭Isoscopoletin； 6：奎寧酸Quinic acid； 7：苯甲酰蘋果酸Benzoylmalic acid； 8：阿魏酰腐胺N-Feruloylputrescine； 9：木犀草素Luteolin； 10：香橙素Aromadendrin； 11：高車前素*Hispidulin*； 12：香葉木素*Diosmetin*； 13：澤蘭黃酮Nepetin； 14：3-O-甲基槲皮素3-O-methylquercetin； 15：5-O-對香豆?？鼘幩?-O-p-coumaroylquinic acid； 16：綠原酸*Chlorogenic acid*； 17：東莨菪苷Scopolin； 18：新綠原酸*Neochlorogenic acid*； 19：阿魏酸-4-O-葡萄糖苷Ferulic acid-4-O-glucoside； 20：3-O-阿魏酰奎寧酸3-O-feruloylquinic acid； 21：異杞柳苷Isosalipurposide； 22：櫻桃苷Prunin； 23：落新婦苷Astilbin； 24：二氫山奈酚-3-O-葡萄糖苷Dihydrokaempferol-3-O-glucoside； 25：香葉木素-7-O-半乳糖苷Diosmetin-7-O-galactoside； 26：異槲皮苷*Isoquercitrin*； 27：異鼠李素-3-O-葡萄糖苷*Isorhamnetin-3-O-glucoside*； 28：蔓菁苷*Brassicin*； 29：二咖啡酰基莽草酸Dicaffeoylshikimic acid； 30：異綠原酸C Isochlorogenic acid C； 31：異綠原酸B Isochlorogenic acid B； 32：芹菜素-6-C-(2″-葡萄糖基)阿拉伯糖苷Apigenin-6-C-(2″-glucosyl)arabinoside； 33：原花青素B1 Procyanidin B1； 34：原花青素B3 Procyanidin B3； 35：原花青素B2 Procyanidin B2； 36：蘆丁Rutin； 37：槲皮素-3-O-蕓香糖苷-7-O-葡萄糖苷Quercetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside； 38：槲皮素-7-O-蕓香糖苷-4′-O-葡萄糖苷Quercetin-7-O-rutinoside-4′-O-glucoside.

圖7 皂莢刺特有代謝物的相對含量Fig. 7 Relative content of G. sinensis spines metabolites1：東莨菪內(nèi)酯Scopoletin； 2：白皮杉醇Piceatannol； 3：紫檀芪Pterostilbene； 4：水楊苷Salicin； 5：黃顏木素Fustin； 6：芥子酰腐胺Sinapoylputrescine； 7：3,3′,5-三羥基-4′,7-二甲氧基黃烷酮3,3′,5-Trihydroxy-4′,7-dimethoxyflavanone； 8：羅漢松樹脂醇Matairesinol； 9：2,4,6,4′-四羥基-二苯乙烯-2-O-葡萄糖苷2,4,6,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-glucoside； 10： N-對香豆酰-N′-阿魏?；種-p-coumaroyl-N′-feruloylputrescine； 11: 對香豆酰阿魏酰腐胺p-coumaroylferuloylputrescine； 12： N,N′-二阿魏酰腐胺N,N′-diferuloylputrescine； 13：原花青素 A1 Procyanidin A1； 14：葛根素-4′3-葡萄糖苷Puerarin-4′3-glucoside； 15：異牡荊素-2″-O-鼠李糖苷Isovitexin-2″-O-rhamnoside； 16：原花青素 A6Procyanidin A6； 17：香葉木素-8-C-(2″3-鼠李糖基)葡萄糖苷Diosmetin-8-C-(2″-O-rhamnosyl)glucoside； 18: 2′-乙酰毛蕊花糖苷2′-Acetylacteoside； 19：肉桂單寧 B1 Cinnamtannin B1； 20：檳榔鞣質(zhì) B1 Arecatannin B1； 21：原花青素 C2 Procyanidin C2； 22：肉桂單寧 B2 Cinnamtannin B2.

圖8 野皂莢刺特有代謝物的相對含量Fig. 8 Relative content of G. microphylla spines metabolites1：云杉苷Picein； 2：柚皮素-4′,7-二甲醚Naringenin-4′,7-dimethyl ether； 3：5-O-咖啡酰莽草酸5-O-caffeoylshikimic acid； 4：松柏苷Coniferin； 5：咖啡酰對羥基苯甲酰酒石酸Caffeoyl(p-hydroxybenzoyl)tartaric acid； 6: 咖啡酰對香豆酰酒石酸Caffeoyl-p-coumaroyltartaric acid； 7： 6-O-葡萄糖基-阿魏酰苯甲酸6-O-glucosyl-feruloylbenzoic acid； 8：4-O-(6′-O-葡萄糖基咖啡酰)-4-羥基苯甲酸4-O-(6′-O-glucosylcaffeoyl)-4-hydroxybenzoic acid； 9：洋丁香苷A Syringalide A； 10：4-對香豆酰鼠李糖基-(1→6)-D-葡萄糖4-p-cumaroyl-rhamnosyl-(1→6)-D-glucose； 11：3,4-二沒食子酰莽草酸3,4-digalloylshikimic acid； 12：4-O-(6′-O-葡萄糖基咖啡酰)-3,4-二羥基苯甲酸4-O-(6′-O-glucosylcaffeoyl)-3,4-dihydroxybenzoic acid； 13：4-O-(6′-O-葡萄糖基-阿魏酰)-3,4-二羥基芐醇4-O-(6′-O-glucosylferuloyl)-3,4-dihydroxybenzyl alcohol； 14： 1′-O-(3,4-二羥基苯乙基)-O-咖啡?；?葡萄糖苷1′-O-(3,4-dihydroxyphenethyl)-O-caffeoyl-glucoside； 15：阿魏酰阿魏酰酒石酸Feruloylferuloyltartaric acid； 16：芥子酰對香豆酰酒石酸Sinapoyl-p-coumaroyltartaric acid； 17： 對香豆?？鼘幩?4′-O-葡萄糖醛酸苷p-coumaroylquinic acid-4′-O-glucuronide； 18：3,5-二咖啡?？崴?,5-dicaffeoylquinic acid； 19：3-O-阿魏?？鼘幩?O-葡萄糖苷3-O-feruloylquinic acid-O-glucoside； 20：1-羥基松脂醇-1-O-葡萄糖苷1-hydroxypinoresinol-1-O-glucoside； 21：5′-甲氧基羅漢松脂苷5′-methoxymatairesinoside； 22：異杞柳苷-6″-O-對香豆酸Isosalipurposide-6″-O-p-coumaric acid； 23：二芥子酰葡萄糖苷Disinapoyl glucoside； 24：槲皮素-3-O-(2″-肉桂酰)葡萄糖苷Quercetin-3-O-(2″-cinnamoyl)glucoside； 25：槲皮素-3-O-(2″-對香豆酰)葡萄糖苷Quercetin-3-O-(2″-p-Coumaroyl)glucoside； 26：金圣草黃素-7-O-(6″-阿魏酰)葡萄糖苷Chrysoeriol-7-O-(6″-feruloyl)glucoside； 27：苜蓿酸-3-O-葡萄糖醛酸苷-28-O-鼠李糖基(1,2)-阿拉伯糖苷Medicagenic acid-3-O-glucuronide-28-O-rhamnosyl(1,2)-arabinoside.

2.4 皂莢和野皂刺特有代謝物分析

皂莢刺中特有的代謝物有22種(圖7)，分屬于酚酸、木脂素、香豆素、生物堿、黃酮、鞣質(zhì)、茋類、其他類物質(zhì)，其中異牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、N,N′-二阿魏酰腐胺、香葉木素-8-C-(2″-O-鼠李糖基)葡萄糖苷、紫檀芪、原花青素C2相對含量較高(> 1.00E+06)，其他代謝物的相對含量較低。

野皂莢刺中特有的代謝物有27種(圖8)，分別屬于黃酮、木脂素、萜類、酚酸類物質(zhì)，其中松柏苷、5-O-咖啡酰莽草酸、槲皮素-3-O-(2″-對香豆酰)葡萄糖苷的相對含量較高(> 1.00E+06)，其他代謝物的相對含量較低。

2.5 差異代謝物富集分析

差異顯著代謝物KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類(圖9)，發(fā)現(xiàn)皂莢和野皂莢刺有60個差異顯著的代謝物被注釋到28條代謝途徑中(表2)，顯著富集的代謝途徑是茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成，其次是黃酮類生物合成、異黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、硫胺代謝、苯丙烷生物合成。其中茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成最為顯著，此代謝途徑中，含量升高的差異代謝物為酚酸類物質(zhì)5-O-咖啡酰莽草酸、5-O-對香豆?？鼘幩?，含量降低的差異代謝物為茋類物質(zhì)白藜蘆醇、白皮杉醇、紫檀芪，差異倍數(shù)值為1.53～17.33。黃酮類生物合成和苯丙烷生物合成富集了較多的差異代謝物。

3 討論

本試驗采用UPLC-MS/MS代謝組學(xué)方法對皂莢和野皂莢2個種的皂刺進(jìn)行分析，共鑒定出8類457種代謝物，主要包括酚酸、黃酮、木脂素、香豆素、鞣質(zhì)、生物堿、萜類和其他多種化合物。就2個種的皂刺的差異次生代謝物來看，代謝物差異種類較多的是黃酮和酚酸類，其他類差異代謝物種類相對較少。

3.1 皂莢和野皂莢刺差異代謝物

黃酮類物質(zhì)是一類植物次生代謝產(chǎn)物，不僅具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等功效(Russoetal., 2012)，在植物體內(nèi)還發(fā)揮著保護(hù)植株、抗逆性、抗病蟲害、激素運(yùn)輸調(diào)節(jié)等作用(Griffiths, 1964)。皂莢刺中的黃酮優(yōu)勢代謝物異牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、香葉木素-8-C-(2″-O-鼠李糖基)葡萄糖苷具有抗氧化(王曉麗， 2014； 鄭新恒， 2018； 陳永芬等， 2004)、抗肝癌、宮頸癌(彭鈺芳等， 2010； 龍玲， 2006； 張妍等， 2017； 何光志等， 2012)等作用，上述兩種物質(zhì)在野皂莢刺中未發(fā)現(xiàn)； 野皂莢刺中的黃酮優(yōu)勢代謝物香葉木素-7-O-半乳糖苷和香葉木素，前者對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，后者對癌細(xì)胞具有抑制作用，因此兩種物質(zhì)可能成為保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛在物質(zhì)(王月華等， 2017)。

酚酸類物質(zhì)是一種分布廣泛、應(yīng)用歷史悠久的芳香類物質(zhì)。在植物體內(nèi)的養(yǎng)分吸收、蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)酶活性以及光合作用等過程或階段起到重要作用。近年來，已從皂刺中分離鑒定了多種酚酸類化合物，具有一定的抗菌消毒(Zhouetal., 2007)和抗炎效果(Seoetal., 2015)。以皂莢刺為對照，野皂莢刺特有的且含量較高的酚酸類物質(zhì)5-O-對香豆酰奎寧酸、松柏苷、5-O-咖啡酰莽草酸、二咖啡?；Р菟幔哂锌寡趸?、清除DPPH自由基(王慧等， 2009； 陶鑫等， 2016)、和ABTS自由基(范金波等， 2015)、抑菌抗炎(趙雪飛， 2018； 陳向陽， 2016)的作用； 皂莢刺中特有的且含量較多的酚酸類物質(zhì)丁香酸具有抗內(nèi)毒素的作用(劉云海等， 2003)，和石酚斛聯(lián)合可抗白內(nèi)障(刁紅星等， 2012)，含量較多的還有阿魏酸，具有降壓(Suzukietal., 2002)、抗氧化(Kawabataetal., 2000)、增強(qiáng)大腦血液循環(huán)的作用(Yanetal., 2001; Hsiehetal., 2002)，因其性質(zhì)穩(wěn)定，毒副作用小，是很多藥的活性成分(黃云劍等， 1998)。上述研究結(jié)果為提取皂刺中的藥用成分提供了依據(jù)，最重要的是為皂莢育種提供了方向，并為創(chuàng)新高質(zhì)量皂刺品種提供了重要見解。

3.2 皂莢和野皂莢刺差異代謝物富集途徑

植物的次生代謝是利用初生代謝的產(chǎn)物加工合成次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物被稱為“植物免疫物質(zhì)”，對人類健康有著舉足輕重的作用，屬于功能性代謝。2個種的皂刺的差異代謝物主要來自于茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成、苯丙烷生物合成、黃酮類生物合成途徑。

茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成代謝途徑顯著富集代謝物(P< 0.05)。參與此代謝途徑的有5-O-咖啡酰莽草酸、5-O-對香豆?？鼘幩?、綠原酸、白藜蘆醇、白皮杉醇和紫檀芪等6種物質(zhì)，皂莢刺中紫檀芪、白皮杉醇含量分別是野皂莢刺的17.34和14.84倍，白皮杉醇是白藜蘆醇的衍生物，紫檀芪被稱為第二代白藜蘆醇，3種物質(zhì)均具有抗癌、抗菌、抗氧化等作用(田京偉等， 2001)。5-O-咖啡酰莽草酸、5-O-對香豆?？鼘幩?、綠原酸在野皂莢刺中含量較高，綠原酸具有廣泛的生物活性，已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個領(lǐng)域(王曉梅等， 2019)。在茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成代謝途徑中，上述6種物質(zhì)是由對香豆酰輔酶A在兩種不同酶的作用下形成，未來可挖掘?qū)ο愣辊］o酶A或兩種酶的合成基因，可通過轉(zhuǎn)基因或后代基因型選擇的方式來選育新的品種。

植物苯丙烷生物合成途徑是植物體內(nèi)一條重要的代謝途徑，東莨菪苷在苯丙烷生物合成途徑中生成東莨菪內(nèi)酯和東莨菪苷，兩種物質(zhì)皆在皂莢刺中含量較高，東莨菪內(nèi)酯在野皂莢刺中未被發(fā)現(xiàn)，異莨菪亭是東莨菪內(nèi)酯的同分異構(gòu)體，有研究發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)都具有一定的平喘效果，在一定的濃度下，表現(xiàn)出良好的清除自由基能力、抗氧化能力和還原能力(Leeetal., 2013； 孔玉珊等， 2014)，但東莨菪內(nèi)酯在合成過程中要比異莨菪亭復(fù)雜，因此在后續(xù)的醫(yī)學(xué)工作中，異莨菪亭代謝物顯得尤為重要(梁曉天等， 2013)。

茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成代謝途徑中的對香豆酰輔酶A在黃酮類生物合成中進(jìn)一步合成異甘草素，異甘草素會產(chǎn)生甘草苷元和紫鉚花素，這兩種物質(zhì)都可生成黃顏木素，有研究發(fā)現(xiàn)皂刺中的黃顏木素可抑制癌癥細(xì)胞的增殖(徐哲等， 2008)，還有研究推測黃顏木素可激活神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路中的小分子，促進(jìn)長期記憶，用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病(Maheretal., 2006)。上述物質(zhì)黃顏木素和紫鉚花素在皂莢刺中含量較高，甘草苷元在野皂莢刺中含量較多，黃顏木素在野皂莢刺中未發(fā)現(xiàn)。因此未來可通過挖掘皂莢刺和野皂莢刺中相關(guān)基因來調(diào)控苯丙烷生物合成或黃酮類物質(zhì)代謝過程，促進(jìn)皂刺優(yōu)良品種中黃酮相關(guān)物質(zhì)的積累，同時也為研究相關(guān)代謝途徑的關(guān)鍵代謝物及其生物合成提供參考。

4 結(jié)論

本試驗在皂莢和野皂莢刺中共鑒定出457種代謝物； 差異代謝物分析結(jié)果顯示共鑒定出213種，主要集中在黃酮和酚酸類物質(zhì)； 皂莢刺中特有的代謝物有22種，異牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、N,N′-二阿魏酰腐胺、香葉木素-8-C-(2″-O-鼠李糖基)葡萄糖苷、紫檀芪、原花青素C2相對含量較高，野皂莢刺中特有的代謝物有27種，松柏苷、5-O-咖啡酰莽草酸、槲皮素-3-O-(2″-對香豆酰)葡萄糖苷的相對含量較高； 茋類、二芳基庚烷類和姜酚的生物合成顯著富集差異代謝物(P< 0.05)，苯丙烷生物合成和黃酮類生物合成代謝途徑富集差異代謝物較多。本研究對皂莢和野皂莢的干燥棘刺的代謝物進(jìn)行初步比較，對后續(xù)皂刺的深入研究和開發(fā)利用提供參考。