胡宗云，楊培民，閆有利

(遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省水生動(dòng)物病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 遼陽 111000)

目前，水生動(dòng)物致病菌的判定需要借助培養(yǎng)、分離和生化鑒定等技術(shù)[14-15]，這種方法耗時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜且敏感性低；16S rDNA分子鑒定方法近年來應(yīng)用較為廣泛，這種方法需要測(cè)序，耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高；此外，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)及單重PCR檢測(cè)技術(shù)用于病原菌的檢測(cè)也有報(bào)道，這些方法通常只能檢測(cè)單種致病菌[16]。與單重PCR相比，多重PCR具有高效率、高通量及低成本的特性[17-18]。目前，多重PCR技術(shù)已被廣泛用于基因突變[18]、病原微生物[19]、寄生蟲[20]等多個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)。就水生動(dòng)物病原微生物檢測(cè)而言，一些學(xué)者開發(fā)出了可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌[21-24]和病毒[25-26]的多重PCR檢測(cè)方法；另有學(xué)者將多重PCR技術(shù)用于致病菌[27]和病毒[28]的分型研究。這些工作有效提升了檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，在科研和生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力。筆者以近幾年遼寧地區(qū)淡水魚常見病原菌為檢測(cè)對(duì)象，以嗜水氣單胞菌的溶血素(hlyA)基因、遲鈍愛德華氏菌的效應(yīng)蛋白(eseD)基因、蠟樣芽孢桿菌非溶血性腸毒素(nheA)基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，旨在建立可同時(shí)檢測(cè)3種致病菌的單管多重PCR檢測(cè)方法，以期為3種病原菌的快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

嗜水氣單胞菌AH10501、蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303和遲鈍愛德華氏菌ATCC49231購(gòu)自南京茂捷微生物科技有限公司；蠟樣芽孢桿菌HHG[12]、愛德華氏菌(E.ictaluri)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、希瓦氏菌(Shewanellasp.)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、10×PCR buffer、DL5000 marker購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。主要儀器包括ABI 2720型PCR儀(賽默飛世爾科技，美國(guó))、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)(Protein Simple公司,美國(guó))、Nano drop One C超微量紫外—可見光分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技，美國(guó))、高速冷凍離心機(jī)(賀默, 德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與基因組DNA提取

挑取供試菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)挑取單克隆菌落置于滅菌的1.5 mL EP管中，按照試劑盒操作說明提取基因組DNA。提取的DNA經(jīng)Nano Drop One C測(cè)定濃度后，置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的3個(gè)細(xì)菌對(duì)應(yīng)的毒力基因序列，通過Primer primier 6.0軟件，并參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)多對(duì)引物；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì)和預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證后獲得了3對(duì)特異性和兼容性較強(qiáng)的引物對(duì)(表1)。

表1 多重PCR擴(kuò)增用引物信息

1.2.3 多重PCR特異性檢驗(yàn)

取各待測(cè)細(xì)菌基因組DNA 50 ng作為模板，加入25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。反應(yīng)體系包括：hlyA、eseD和nheA引物3對(duì)(每條引物終濃度0.4 μmol/L)，10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP混合物(各2.5 mmol/L)2 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.3 μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(90 V電壓下電泳30 min)，選擇嗜水氣單胞菌AH10501、蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303和遲鈍愛德華氏菌ATCC49231的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得序列與GenBank中的菌株進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

1.2.4.1 模板質(zhì)量濃度組合的優(yōu)化

在25 μL PCR反應(yīng)體系中，將3株標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA按不同質(zhì)量濃度進(jìn)行組合，組合中嗜水氣單胞菌AH10501、蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303和遲鈍愛德華氏菌ATCC 49231的終質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、2.5 ng/μL，2.5、1.0、1.0 ng/μL，1.0、2.5、1.0 ng/μL，2.5、2.5、2.5 ng/μL和1.0、1.0、1.0 ng/μL。PCR反應(yīng)體系其他組分為：3個(gè)基因的上、下游引物各1 μL(每條引物終濃度為0.4 μmol/L)，10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP混合物(各 2.5 mmol/L)2 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.3 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序同1.2.3，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)條帶亮暗及清晰程度確定最佳的模板質(zhì)量濃度組合。

1.2.4.2 引物濃度的優(yōu)化

在25 μL PCR反應(yīng)體系中，通過添加不同體積的引物使每條引物的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.2.3。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析引物濃度對(duì)多重PCR的影響。

1.2.4.3 dNTP濃度的優(yōu)化

在25 μL反應(yīng)體系中，dNTP添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，對(duì)應(yīng)的dNTP總濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol/L，其余組成及反應(yīng)程序與1.2.3相同。通過篩選試驗(yàn)確定dNTP最適濃度。

1.2.4.4 酶活性對(duì)多重PCR的影響

在25 μL反應(yīng)體系中，調(diào)整酶的添加量使其總活性分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 U/μL, 其余組成及反應(yīng)程序與1.2.3相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得酶的最佳用量。

1.2.4.5 退火溫度的優(yōu)化

25 μL反應(yīng)體系中各組分與1.2.3相同，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，分別在51、53、55、57、59 ℃和61 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出最佳的退火溫度。

1.2.5 多重PCR敏感性檢測(cè)

將3株標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA從最初濃度開始按10倍倍比進(jìn)行稀釋，將不同稀釋度的細(xì)菌基因組DNA分別取1 μL加入反應(yīng)體系，作為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)多重PCR反應(yīng)的靈敏度。

1.2.6 多重PCR臨床應(yīng)用

應(yīng)用本次建立的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室近年來從常見淡水魚病魚魚體中分離、保存的218株菌株進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)218株菌株進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增16S rDNA基因并送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)、同源性分析，進(jìn)行菌株的分子鑒定。比較多重PCR檢測(cè)方法和16S rDNA測(cè)序鑒定這兩種方法所得結(jié)果是否一致。

2 結(jié) 果

2.1 多重PCR特異性分析

不同模板在多重PCR檢測(cè)體系中的擴(kuò)增情況見圖1，1～4泳道分別為3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株和本實(shí)驗(yàn)室分離的蠟樣芽孢桿菌HHG株，分別擴(kuò)增出900、500 bp和250 bp大小的片段，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度與預(yù)測(cè)基本一致。而其他參考菌株或宿主基因組DNA做模板時(shí)無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，表明本試驗(yàn)所建立的多重PCR體系與其他菌株及宿主基因組無擴(kuò)增反應(yīng)，該體系具有一定的特異性。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序并與NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，hlyA、eseD和nheA 3個(gè)基因與GenBank中的嗜水氣單胞菌hlyA基因(U81555)、遲鈍愛德華氏eseD基因(AY643478)和蠟樣芽孢桿菌nheA基因(AE017194)高度同源，同源率超過99%。這表明，本體系所擴(kuò)增的產(chǎn)物均為目的產(chǎn)物。

圖1 不同模板在多重PCR反應(yīng)檢測(cè)體系擴(kuò)增狀況Fig.1 Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR amplified against various DNA templatesM.DL 5000 DNA marker； 1.嗜水氣單胞菌AH10501; 2.遲鈍愛德華氏菌ATCC49231; 3.蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303; 4.蠟樣芽孢桿菌分離株HHG; 5.維氏氣單胞菌; 6.豚鼠氣單胞菌; 7.希瓦氏菌; 8.類志賀鄰單胞菌; 9.弗氏檸檬酸桿菌; 10.熒光假單胞菌; 11.鯉基因組DNA; 12.空白對(duì)照.M.DL 5000 marker; 1.A. hydrophila AH10501; 2.E. tarda ATCC49231; 3.B. cereus CMCC(B)63303; 4.B. cereus HHG; 5.A. veronii; 6.A. caviae; 7.Shewanella sp.; 8.P. shigelloides; 9.C. freundii; 10.P. fluorescens; 11.genome DNA of common carp Cyprinus carpio; 12.the blank control.

2.2 多重PCR體系的建立和優(yōu)化

2.2.1 模板質(zhì)量濃度組合優(yōu)化

在多重PCR體系中3對(duì)引物終濃度均為0.4 μmol/L基礎(chǔ)上，3種菌株基因組DNA不同質(zhì)量濃度組合的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。3個(gè)菌株基因組DNA終質(zhì)量濃度為1.0 ng/μL時(shí)，在各個(gè)組合中擴(kuò)增效率均較低；而終質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 ng/μL時(shí)，擴(kuò)增效率明顯增強(qiáng)。因此，3個(gè)菌株基因組DNA最佳模板質(zhì)量濃度組合為2.5、2.5、2.5 ng/μL。

圖2 不同模板質(zhì)量濃度組合對(duì)多重PCR結(jié)果的影響Fig.2 Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR amplified against different DNA concentrations among three pathogensM.DL 5000 DNA marker;1～5.嗜水氣單胞菌、蠟樣芽孢桿菌和遲鈍愛德華氏菌基因組DNA模板質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、2.5 ng/μL，2.5、1.0、1.0 ng/μL，1.0、2.5、1.0 ng/μL，2.5、2.5、2.5 ng/μL，1.0、1.0、1.0 ng/μL.M.DL5000 marker； 1—5.the DNA concentrations of three pathogens (A. hydrophila, B. cereus and E. tarda) in multiplex PCR are 1.0, 2.5, 2.5 ng/μL, 2.5, 1.0, 1.0 ng/μL, 1.0, 2.5, 1.0 ng/μL, 2.5, 2.5, 2.5 ng/μL, and 1.0, 1.0, 1.0 ng/μL, respectively.

2.2.2 引物濃度優(yōu)化

調(diào)整引物濃度進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果見圖3。當(dāng)引物濃度為0.2～0.8 μmol/L時(shí)，hlyA和nheA基因擴(kuò)增效率變化不大；但eseD基因在引物濃度為0.4 μmol/L時(shí)擴(kuò)增效率最高。因此，多重PCR體系最適引物濃度為0.4 μmol/L。

圖3 多重PCR最適引物濃度的選擇Fig.3 Optimization of primer concentration for multiplex PCR detection systemM.DL 5000 DNA marker; 1～4.引物終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L.M.DL 5000 DNA marker; 1—4.the primer concentration of multiplex PCR is 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8 μmol/L, respectively.

2.2.3 dNTP濃度優(yōu)化

dNTP濃度變化對(duì)多重PCR體系的影響見圖4。25 μL反應(yīng)體系中，當(dāng)dNTP終濃度為0.20 μmol/L時(shí)，3個(gè)基因PCR產(chǎn)物條帶最亮，擴(kuò)增效率最高。因此，dNTP最適終濃度為0.20 μmol/L，所對(duì)應(yīng)的dNTP添加量為2.0 μL。

圖4 多重PCR 最適dNTP終濃度的選擇Fig.4 Optimization of dNTP concentration for multiplex PCR detection systemM.DL 5000 DNA marker; 1～6.dNTP終濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol/L.M.DL 5000 DNA marker； 1—6.the concentration of dNTP is 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 and 0.30 μmol/L, respectively.

2.2.4 多重PCR體系中酶濃度的優(yōu)化

在25 μL多重PCR體系中，酶活性由0.02 U/μL增至0.05 U/μL時(shí)，3個(gè)基因擴(kuò)增效率無明顯差異；當(dāng)酶活性為0.06、0.07 U/μL時(shí)，3個(gè)基因擴(kuò)增效率較高，其中酶活性為0.06 U/μL時(shí)，條帶清晰，可滿足多重PCR檢測(cè)體系的需要(圖5)。

圖5 多重PCR最適酶活性的選擇Fig.5 Optimization of DNA polymerase activity for multiplex PCR detection systemM.DL 5000 DNA marker; 1～6.酶活性分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 U/μL.M.DL 5000 DNA marker； 1—6.the activity of DNA polymerase is 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06 and 0.07 U/μL, respectively.

2.2.5 多重PCR體系中退火溫度的優(yōu)化

當(dāng)退火溫度在51～61 ℃變化時(shí)，3個(gè)基因均可獲得有效的擴(kuò)增(圖6)。當(dāng)退火溫度為51 ℃和57 ℃時(shí)，3個(gè)基因擴(kuò)增效率相對(duì)較低；當(dāng)退火溫度為59 ℃和61 ℃時(shí)，hlyA和nheA基因擴(kuò)增效率略高于eseD基因；當(dāng)退火溫度為53 ℃和55 ℃時(shí)，3個(gè)基因擴(kuò)增效率較高，條帶清晰明亮，為避免溫度較低引起非特異擴(kuò)增，選擇55 ℃作為多重PCR反應(yīng)體系的退火溫度。

圖6 多重PCR 最適退火溫度的選擇Fig.6 Optimization of annealing temperature for multiplex PCR detection systemM.DL 5000 DNA marker; 1～6.退火溫度分別為51、53、55、57、59、61 ℃.M.DL 5000 DNA marker; 1—6.the annealing temperature is 51, 53, 55, 57, 59 and 61 ℃, respectively.

多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果表明，最佳反應(yīng)體系為：hlyA、eseD和nheA基因上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，嗜水氣單胞菌AH10501、蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303和遲鈍愛德華氏菌ATCC49231 DNA添加量均為50 ng，10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP混合物(各2.5 mmol/L)2 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.3 μL，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。最佳反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

2.3 多重PCR敏感性檢測(cè)

本試驗(yàn)中試劑盒提取的嗜水氣單胞菌AH10501、遲鈍愛德華氏菌ATCC49231和蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303基因組DNA質(zhì)量濃度分別為48、30 ng/μL和26 ng/μL。當(dāng)稀釋倍數(shù)為10時(shí)，模板添加量為4.8、3.0 ng和2.6 ng，hlyA、eseD和nheA基因均有可識(shí)別的較弱擴(kuò)增。因此，在本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，多重PCR反應(yīng)體系對(duì)嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和蠟樣芽孢桿菌最低檢出劑量分別為4.8、3.0 ng和2.6 ng(圖7)。

圖7 模板稀釋法測(cè)定多重PCR敏感性試驗(yàn)Fig.7 Sensitivity assay of multiplex PCR by DNA templates dilutionM.DL 5000 DNA marker； 1～4.嗜水氣單胞菌AH10501基因組DNA 100～103稀釋后作為模板擴(kuò)增狀況； 5～8.遲鈍愛德華氏菌ATCC49231基因組DNA 100～103稀釋后作為模板擴(kuò)增狀況； 9～12.蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303基因組DNA 100～103稀釋后作為模板擴(kuò)增狀況.M.DL 5000 DNA marker; 1—4.agarose gel electrophoresis of multiplex PCR amplified against various DNA templates ranging from 100—103 in A. hydrophila AH10501; 5—8.agarose gel electrophoresis of multiplex PCR amplified against various DNA templates ranging from 100—103 in E. tarda ATCC49231; 9—12.agarose gel electrophoresis of multiplex PCR amplified against various DNA templates ranging from 100—103 in B. cereus CMCC(B)63303.

2.4 多重PCR臨床應(yīng)用

應(yīng)用本次建立的多重PCR方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室近年來從各種病魚魚體中分離、保存的218株菌株進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)多重PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陽性樣本187個(gè)，其中嗜水氣單胞菌108株、蠟樣芽孢桿菌54株、遲鈍愛德華氏菌25株；剩余31株DNA未擴(kuò)增目的條帶(圖8)。同時(shí)對(duì)218株菌株進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序驗(yàn)證，所得16S rDNA序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心中進(jìn)行BLAST比對(duì)及同源性分析，結(jié)果顯示，108株與嗜水氣單胞菌、25株與遲鈍愛德華氏菌、54株與蠟樣芽孢桿菌的同源性達(dá)到99%以上，其他31株，主要為維氏氣單胞菌和柱狀嗜纖維菌(Cytophagacolumnaris)、弗氏檸檬酸桿菌等。多重PCR檢測(cè)分離菌株與16S rDNA鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，2種方法均鑒定出嗜水氣單胞菌108株、遲鈍愛德華氏菌25株、蠟樣芽孢桿菌54株，符合率達(dá)100%(表2)。

圖8 多重PCR體系檢測(cè)分離菌株的電泳結(jié)果Fig.8 Agarose electrophoresis of multiplex PCR amplified by the template of the isolated strainsM.DL 5000 DNA marker; 1～21.分離菌株基因組DNA在多重PCR體系中擴(kuò)增結(jié)果.M.DL 5000 DNA marker; 1—21.agarose electrophoresis of multiplex PCR amplified by the sample template in genomes of the isolates.

表2 多重PCR檢測(cè)分離菌株與16S rDNA鑒定結(jié)果比較

3 討 論

3.1 影響多重PCR特異性擴(kuò)增的因素

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可將微量的基因片段短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，并具有較高的靈敏度和特異性，可對(duì)目的基因進(jìn)行快速檢測(cè)，目前廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病檢測(cè)中[29-30]。多重PCR又稱多重引物PCR，是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。多重PCR檢測(cè)方法的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，引物要特異性強(qiáng)，引物內(nèi)部避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在擴(kuò)增過程中引物與引物之間避免形成二聚體，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小不同且能在電泳時(shí)區(qū)分開。筆者以嗜水氣單胞菌的溶血素(hlyA)基因、遲鈍愛德華氏菌的效應(yīng)蛋白(eseD)基因、蠟樣芽孢桿菌非溶血性腸毒素(nheA)基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，合成了3對(duì)特異性引物，以3種菌的混合DNA為模板，運(yùn)用多重PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出了長(zhǎng)度分別為876、440 bp和239 bp的目的片段，通過特異性檢驗(yàn)分析了該反應(yīng)體系在不同菌株中的擴(kuò)增狀況，確定了該多重PCR檢測(cè)體系的特異性。通過對(duì)模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度、Taq酶活性和退火溫度等進(jìn)行多重PCR條件的優(yōu)化，建立了最適的PCR反應(yīng)體系，并用建立的多重PCR體系對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離菌株進(jìn)行鑒定，其結(jié)果與16S rDNA鑒定結(jié)果的符合率為100%。該P(yáng)CR檢測(cè)體系的建立有效縮短了3種魚源致病菌的檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作過程，降低了檢測(cè)成本，可以滿足臨床檢測(cè)的需要。

3.2 分子靶標(biāo)的選擇

針對(duì)遼寧地區(qū)常見魚源嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、蠟樣芽孢桿菌的相關(guān)毒力因子，以嗜水氣單胞菌的hlyA基因、遲鈍愛德華氏菌的eseD基因、蠟樣芽孢桿菌的nheA基因?yàn)榉肿影袠?biāo)。hlyA基因是嗜水氣單胞菌的重要毒力因子，大多數(shù)氣單胞菌屬于條件性致病菌，具有致病菌株和非致病菌株之分，以往的研究已證實(shí)，hlyA基因可作為分子靶標(biāo)進(jìn)行致病性氣單胞菌的鑒定[31-32]，所檢測(cè)的非致病性嗜水氣單胞菌分離株均未擴(kuò)增出hlyA和氣溶素(aerA)基因，而致病性嗜水氣單胞菌分離株中至少含有hlyA基因。eseD基因是致病性遲鈍愛德華氏菌胞外產(chǎn)物的重要成分，在致病過程中起著重要作用，并在大菱鲆遲鈍愛德華氏菌毒力因子檢測(cè)中有所報(bào)道[33-35]。nheA基因在蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)中廣泛存在[36]，常作為分子靶標(biāo)用于蠟樣芽孢桿菌鑒定和分子分型[37-39]。目前，有關(guān)水生動(dòng)物源致病性蠟樣芽孢桿菌多重PCR檢測(cè)的報(bào)道相對(duì)較少，一些學(xué)者多采用單重PCR[40-41]或測(cè)序[13]的方式研究蠟樣芽孢桿菌毒力因子的分布情況。本試驗(yàn)中，在多株蠟樣芽孢桿菌中檢測(cè)到了nheA基因，該基因也存在于引發(fā)中華鱉“搖頭病”[40]和半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)出血癥[41]的蠟樣芽孢桿菌中，而通過測(cè)序可知，大菱鲆源蠟樣芽孢桿菌基因組序列[13]中不存在nheA基因。此差異是由菌株生存環(huán)境或來源不同引起的還是由研究方法不同造成的有待進(jìn)一步研究。

3.3 多重PCR檢測(cè)極限的比較

本試驗(yàn)中采用模板稀釋法來確定多重PCR體系的最低檢測(cè)劑量，這種方法在鰻弧菌 (Vibrioanguillarum)[42]、致病性嗜水氣單胞菌[31]的多重PCR檢測(cè)中也有應(yīng)用。一些學(xué)者將菌液梯度稀釋后再提取DNA進(jìn)行檢測(cè)[17,43]，菌液稀釋后提取DNA的量受菌液混勻程度、試劑盒的效率、個(gè)人操作等多種因素影響，由此獲得的最低檢出量存在較大誤差的可能性將會(huì)增加，不利于不同研究間檢測(cè)極限的比較。

病原菌的毒力大小與其基因型有關(guān)，饒靜靜等[31]研究發(fā)現(xiàn)，所檢測(cè)的非致病性嗜水氣單胞菌分離株均未擴(kuò)增出hlyA和aerA基因，而致病性嗜水氣單胞菌分離株中至少含有hlyA基因，其建立的多重PCR體系對(duì)hlyA基因的最低可檢測(cè)模板量為10 ng。筆者建立的多重PCR體系對(duì)hlyA檢測(cè)極限為4.8 ng，高于李晨等[23]報(bào)道的最低檢測(cè)水平(256 pg)。這表明本試驗(yàn)所建立的多重PCR體系對(duì)致病性嗜水氣單胞菌的檢測(cè)是有效的和靈敏度適中的。

4 結(jié) 論

針對(duì)遼寧地區(qū)常見淡水魚病原菌嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、蠟樣芽孢桿菌的相關(guān)毒力因子，選擇特異性較強(qiáng)的嗜水氣單胞菌的溶血素(hlyA)基因、蠟樣芽孢桿菌非溶血性腸毒素(nheA)基因、遲鈍愛德華氏菌的效應(yīng)蛋白(eseD)基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行條件優(yōu)化，建立可同步檢測(cè)3種菌的多重PCR檢測(cè)體系。結(jié)果顯示，3個(gè)毒力基因引物濃度均為0.4 μmol/L，模板質(zhì)量濃度為2.5 ng/μL, dNTP和酶添加量分別為2.5 μL和0.3 μL，退火溫度為55 ℃時(shí)，各目的片段均可較好地?cái)U(kuò)增。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的多重PCR對(duì)嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和蠟樣芽孢桿菌的最低檢測(cè)劑量分別為4.8、3.0、2.6 ng。對(duì)臨床分離的菌株樣本進(jìn)行檢測(cè)，與16S rDNA分子鑒定結(jié)果的符合率為100%。

筆者建立的多重PCR體系檢測(cè)方法特異、靈敏、快速，可同步完成淡水魚源的嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)、鑒定，增強(qiáng)了本地區(qū)魚病流行病學(xué)調(diào)查的準(zhǔn)確性和可靠性。