郝 爽，張振國，尤宏?duì)帲R 林，唐紅霞，劉肖蓮，徐曉麗，谷德賢，羅 璋

(1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221； 2.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，2018年該品種養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)1.117×106t[1]。目前，病害仍然是限制凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，2018年我國因病害造成的凡納濱對蝦養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失達(dá)117.8億元[2]。其中，由致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的急性肝胰腺壞死病是一種常見病害，患病蝦的主要癥狀為空腸空胃，肝胰腺發(fā)白，病理切片顯示肝胰腺小管崩塌、上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落[3-5]。傳統(tǒng)養(yǎng)殖中常使用化學(xué)制品和抗生素控制疾病的發(fā)生，由此帶來的藥物殘留和耐藥菌株問題，越發(fā)受到社會關(guān)注。因此，尋找綠色環(huán)保的藥物替代品已成為研究熱點(diǎn)[6-7]。

益生菌是一種活性微生物，具有安全、無毒、無副作用等特性。許多研究表明，益生菌可以通過改善水體養(yǎng)殖環(huán)境、調(diào)節(jié)對蝦腸道內(nèi)微生態(tài)平衡和影響宿主黏膜與系統(tǒng)免疫等方式減少病害的發(fā)生[8]。目前，常用于對蝦養(yǎng)殖中的益生菌種類主要有乳酸菌、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌等[9-11]。當(dāng)前研究較多的為單一菌株對宿主的影響，而復(fù)合益生菌在對蝦養(yǎng)殖中的使用效果研究相對較少。此外，關(guān)于益生菌對凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響研究，絕大部分集中于投喂期間，而對停止投喂后的變化關(guān)注較少，實(shí)際應(yīng)用中，益生菌常被施用于養(yǎng)殖關(guān)鍵期而非全周期，因此投喂益生菌制劑后對機(jī)體的持續(xù)影響值得探討。

在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室篩選到2株能對副溶血弧菌產(chǎn)生拮抗作用的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，并委托某企業(yè)進(jìn)行小批量試制。筆者選用枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌制成的復(fù)合益生菌，將其加入凡納濱對蝦基礎(chǔ)飼料中，在連續(xù)投喂益生菌28 d和結(jié)束投喂28 d后，分別測定凡納濱對蝦腸道微生物菌群的變化，比較不同時(shí)期機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)，并結(jié)合人工感染試驗(yàn)，探討復(fù)合益生菌制劑對凡納濱對蝦腸道菌群組成和抗病力的影響，以期為復(fù)合益生菌在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

試驗(yàn)用復(fù)合益生菌制劑由本實(shí)驗(yàn)室保存，其中枯草芽孢桿菌密度為5×106cfu/g，乳酸乳球菌密度為5×107cfu/g。參照文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果，向基礎(chǔ)飼料中拌入0.5%復(fù)合益生菌，制成試驗(yàn)飼料備用。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用健康凡納濱對蝦由天津市晟淼水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供，初始體長(6.88±0.53) cm，初始體質(zhì)量(2.22±0.32) g。試驗(yàn)開始前先進(jìn)行對蝦白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)、致病性副溶血弧菌、偷死野田村病毒等幾種常見病原檢測，以確定其不含特定病原。

凡納濱對蝦暫養(yǎng)14 d后隨機(jī)分為2組，即復(fù)合益生菌試驗(yàn)組和對照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行200尾蝦，分別置于容量為1000 L的養(yǎng)殖桶中，水溫(24.5±0.5) ℃，鹽度25，連續(xù)充氧保持含量5 mg/L以上。養(yǎng)殖試驗(yàn)周期56 d，試驗(yàn)開始前禁飼24 h，試驗(yàn)期間每日投飼3次，日投餌量為凡納濱對蝦體質(zhì)量的6%～10%，投喂比例分別為20%、20%和60%。試驗(yàn)組凡納濱對蝦先投喂試驗(yàn)飼料28 d，后投喂基礎(chǔ)飼料28 d，對照組持續(xù)投喂基礎(chǔ)飼料56 d。

1.3 樣本采集與處理

在試驗(yàn)第28天和第56天采集樣本，從試驗(yàn)組和對照組的3個(gè)平行中，每平行隨機(jī)抽取5尾凡納濱對蝦，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇擦拭凡納濱對蝦體表，無菌條件下于冰盤上剖取凡納濱對蝦完整腸道，將同平行的5尾凡納濱對蝦腸道合并為1個(gè)樣本，各時(shí)間點(diǎn)每組共采集3個(gè)平行樣本。凡納濱對蝦腸道用生理鹽水漂洗后裝入無菌冷凍管，迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存，以備腸道菌群檢測分析。

1.4 腸道微生物基因組測序分析

委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司提取樣本腸道微生物基因組DNA，針對細(xì)菌16S rDNA基因V3+V4區(qū)片段設(shè)計(jì)通用引物，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收純化。根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina Nova測序平臺對該文庫進(jìn)行雙末端測序，經(jīng)過Reads拼接、過濾后得到有效數(shù)據(jù)，基于97%一致性將序列聚類成為運(yùn)算分類單元(OTUs)，然后對運(yùn)算分類單元序列比對到Silva132數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析。

根據(jù)運(yùn)算分類單元分析結(jié)果：一方面，對每個(gè)運(yùn)算分類單元的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息及分布情況，對運(yùn)算分類單元進(jìn)行豐富度、多樣性指數(shù)分析，比較樣本菌群結(jié)構(gòu)組成；另一方面，對運(yùn)算分類單元進(jìn)行多序列比對，通過主坐標(biāo)分析(PcoA)和樣本聚類樹展示，探討不同組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。

1.5 攻毒試驗(yàn)

致病性副溶血弧菌菌株DX-2018-1由本實(shí)驗(yàn)室保存，參照文獻(xiàn)[13]方法測定其半致死密度(LC50)：將180尾平均體長(8.40±1.30) cm、平均體質(zhì)量(4.31±1.02) g的健康凡納濱對蝦隨機(jī)分成6組(4個(gè)感染組，1個(gè)對照組，1個(gè)空白組)，養(yǎng)殖于天津市水產(chǎn)研究所淡水試驗(yàn)站室內(nèi)圓形養(yǎng)殖桶(有效水體100 L)。感染組設(shè)置9.7×106、9.7×105、9.7×104、9.7×103cfu/mL的4種密度梯度菌液進(jìn)行浸泡感染；對照組凡納濱對蝦用不含細(xì)菌的海水進(jìn)行模擬感染；空白組凡納濱對蝦不進(jìn)行模擬感染，一直正常養(yǎng)殖。預(yù)試驗(yàn)期間凡納濱對蝦每日投飼3次、換水1次，換水量為總水體的30%，并相應(yīng)補(bǔ)充菌液以維持海水中原菌液密度。連續(xù)觀察7 d，記錄凡納濱對蝦的存活情況，計(jì)算半致死密度。

養(yǎng)殖試驗(yàn)第28天，從試驗(yàn)組和對照組的3個(gè)平行中，每平行隨機(jī)取30尾蝦，用2×半致死密度菌液進(jìn)行浸泡感染攻毒試驗(yàn)，飼養(yǎng)管理方式與預(yù)試驗(yàn)相同，連續(xù)觀察14 d，記錄對蝦存活情況，計(jì)算累計(jì)死亡率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

攻毒試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，顯著性水平為0.05，極顯著性水平為0.01。

2 結(jié) 果

2.1 物種注釋及樣本復(fù)雜度分析

對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，在97%相似性水平上生成運(yùn)算分類單元序列，統(tǒng)計(jì)各組樣本總序列及運(yùn)算分類單元數(shù)量，進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析(表1)。各組樣本總序列均值為65 469 bp，產(chǎn)生的運(yùn)算分類單元數(shù)量為393～872個(gè)。在相同時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組運(yùn)算分類單元數(shù)量均值均高于對照組，其中第28天試驗(yàn)組樣本運(yùn)算分類單元數(shù)量均值最高。

用Observed species和Chao1指數(shù)度量樣本菌群豐度，Shannon指數(shù)評估樣本菌群多樣性。同一時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組樣本的Observed species、Chao1和Shannon指數(shù)均值均高于對照組；第56天，試驗(yàn)組Observed species和Chao1指數(shù)均值較該組第28天有所降低，但仍高于對照組。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)2組樣本的菌群多樣性(n=3)

等級聚類曲線可直觀反映樣本中物種的豐度和均勻度，第28天試驗(yàn)組物種豐度和均勻度最高，第56天對照組物種豐度最低，同一時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組樣本物種豐度均高于對照組(圖1)。這與菌群多樣性指數(shù)分析結(jié)果一致。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)2組樣本等級聚類曲線Fig.1 The Rank-Abundance curves of samples from two groups at different time

2.2 菌群結(jié)構(gòu)組成的變化

根據(jù)各組物種注釋及豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選取在門分類水平上豐度排名前10的物種進(jìn)行分析(圖2)。各組凡納濱對蝦腸道菌群在門水平上組成成分主要有變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、疣微菌門、軟壁菌門等。第56天，試驗(yàn)組中放線菌門、厚壁菌門菌群比例高于其他各組。試驗(yàn)期間，各組腸道中不同門類菌群比例發(fā)生變化，但變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門總含量均在95%以上，占主要優(yōu)勢。

選取豐度排名前20的屬，根據(jù)其在各組中的豐度信息進(jìn)行聚類分析，顏色深淺表示物種豐度的高低(圖3)。第28天，弧菌屬(Vibrio)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)在對照組中比例較大，而在試驗(yàn)組中比例較?。坏?6天，對照組中黏著桿菌屬(Tenacibaculum)比例較大；同一時(shí)間點(diǎn)，魯杰氏菌屬(Ruegeria)在試驗(yàn)組中比例均大于對照組。

2.3 多樣本比較分析

對各組樣本作主坐標(biāo)分析(圖4)：每個(gè)點(diǎn)表示1個(gè)樣本，同一平行的3個(gè)樣本用相同符號表示；樣本在圖中距離越接近，微生物群落結(jié)構(gòu)越相似，差異性越小。對照組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本距離較近，微生物群落組成相似度較高；在主成分1上，對照組與第28天試驗(yàn)組距離相比于第56天試驗(yàn)組更遠(yuǎn)。

為研究不同樣本間的相似性，基于各樣本運(yùn)算分類單元分析結(jié)果，以Unweighted Unifrac距離算法，對樣本距離矩陣進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析，構(gòu)建樣本聚類樹，2組間的分支長度越短，表示在物種多樣性方面存在的差異越小(圖5)。對照組的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本聚為一支，再與第56天試驗(yàn)組聚為一支，第28天試驗(yàn)組單獨(dú)聚為一支，這與主坐標(biāo)分析結(jié)果一致。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)2組樣本在門水平上的物種豐度Fig.2 Species abundance of samples from two groups at different time on phylum level

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)2組樣本在屬水平上的物種豐度聚類分析Fig.3 Cluster analysis of species abundance of samples from two groups at different time on genus level

2.4 攻毒試驗(yàn)凡納濱對蝦累計(jì)死亡率

不同密度副溶血弧菌DX-2018-1引起凡納濱對蝦的死亡數(shù)見表2，根據(jù)凡納濱對蝦死亡數(shù)量，計(jì)算該菌株對凡納濱對蝦的半致死密度為7.7×105cfu/mL。

用1.54×106cfu/mL(2×半致死密度)密度DX-2018-1菌液對凡納濱對蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，試驗(yàn)組凡納濱對蝦累計(jì)死亡率(64.4±11.7)%，對照組累計(jì)死亡率(81.1±5.1)%，試驗(yàn)組凡納濱對蝦累計(jì)死亡率平均降低16.7%，但與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

圖4 基于運(yùn)算分類單元水平的主坐標(biāo)分析Fig.4 PCoA analysis based on OTU level

圖5 基于Unweighted Unifrac算法的非加權(quán)組平均法聚類樹Fig.5 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac algorithm

圖6 攻毒試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of an artificial infection test

3 討 論

3.1 添加復(fù)合益生菌對凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)影響

腸道微生物與機(jī)體營養(yǎng)代謝、胃腸道發(fā)育及免疫防御有著密切聯(lián)系，對于蝦類的生長存活具有重要生理意義[14]。研究表明，益生菌可以通過與有害微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)及生存繁殖空間，拮抗有害微生物生長，從而改善水產(chǎn)動物的腸道菌群組成[15]。近幾年興起的高通量測序技術(shù)，使微生物區(qū)系組成研究更加精確，能夠深入揭示菌群結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性，已成為研究腸道微生物群落的主要技術(shù)之一[16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)投喂復(fù)合益生菌28 d能提高凡納濱對蝦腸道菌群的豐度和多樣性；且在停止投喂28 d后仍對凡納濱對蝦腸道微生物產(chǎn)生持續(xù)影響，這可能與益生菌在腸道中的定殖有關(guān)。目前，水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)使用的益生菌大多為非土著來源菌株，特別是陸源性的芽孢桿菌和光合細(xì)菌等菌株應(yīng)用較多，這些非土著益生菌在水產(chǎn)動物腸道中難以穩(wěn)定存在和持續(xù)發(fā)揮作用[12,18]。本試驗(yàn)選用的枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌是本實(shí)驗(yàn)室自健康凡納濱對蝦腸道中篩選獲得，這種土著菌株能更好地在蝦腸道中定殖，投喂后發(fā)揮作用的時(shí)間更長。

許多學(xué)者通過對不同養(yǎng)殖模式、養(yǎng)殖階段和生長環(huán)境的蝦類研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線菌門、厚壁菌門等為健康對蝦腸道菌群主要門類[19-20]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。試驗(yàn)期間，不同門類菌群在各組腸道中比例發(fā)生變化，但主要門類細(xì)菌仍占優(yōu)勢，表明投喂復(fù)合益生菌不會破壞凡納濱對蝦腸道主體菌門類的優(yōu)勢地位。

在屬水平上，不同時(shí)間點(diǎn)各組凡納濱對蝦腸道優(yōu)勢菌有明顯差異。第28天，弧菌屬、假交替單胞菌屬在對照組中比例較大，而在試驗(yàn)組中比例較小，說明添加復(fù)合益生菌在一定程度上抑制了這兩種細(xì)菌的繁殖。已有研究表明，弧菌屬和假交替單胞菌屬是對蝦腸道中常見菌群，但其中有些種類是條件致病菌，當(dāng)外界環(huán)境惡劣，對蝦抵抗力下降時(shí)，條件性致病菌大量繁殖，導(dǎo)致疾病暴發(fā)的可能性往往要大于專性病原菌[21-23]。許多研究表明，乳酸菌和芽孢桿菌能抑制多種弧菌及其他細(xì)菌的生長[24-26]；胡毅等[27]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加單一或復(fù)合益生菌能顯著降低凡納濱對蝦腸道弧菌數(shù)。這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。第56天，對照組中黏著桿菌屬比例較大，而試驗(yàn)組中該菌比例較小。在分類地位上，黏著桿菌屬歸屬于黃桿菌科，黃桿菌科中多數(shù)成員為條件致病菌[28]，在病害趨向水體浮游細(xì)菌群落中占據(jù)較高的相對豐度[29]；已有研究證實(shí)，黏著桿菌屬細(xì)菌易引起水產(chǎn)動物發(fā)病，其豐度增大可能提高機(jī)體的發(fā)病率[30]。同一時(shí)間點(diǎn)，魯杰氏菌屬在試驗(yàn)組中比例均大于對照組。Sonnenschein等[31]發(fā)現(xiàn)1種魯杰氏菌(Ruegeriamobilis)基因組中存在大量原噬菌體和毒素抗毒基因，認(rèn)為其具有作為水產(chǎn)益生菌開發(fā)的潛力。本試驗(yàn)中，組間菌群結(jié)構(gòu)存在變化差異，說明復(fù)合益生菌能在投喂期間和停喂后促進(jìn)對蝦腸道有益菌的生長，抑制條件致病菌增殖，具有調(diào)節(jié)蝦類腸道微生態(tài)平衡，改善腸道微環(huán)境的作用。

主坐標(biāo)分析和非加權(quán)組平均法聚類分析結(jié)果顯示，對照組第28天和第56天微生物群落組成相似度較高，與試驗(yàn)組第56天有一定差別，且與試驗(yàn)組第28天差別較大，說明飼料中添加復(fù)合益生菌能影響凡納濱對蝦腸道微生物組成，在停止投喂后仍會對腸道菌群的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

3.2 添加復(fù)合益生菌對凡納濱對蝦抗病力影響

許多研究表明，飼料中添加益生菌能增強(qiáng)對蝦抗病原感染能力、提高對蝦抗病力，如添加芽孢桿菌[32]、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)[33]或復(fù)合益生菌[34]，均能提高凡納濱對蝦感染弧菌后的成活率。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加復(fù)合益生菌能在一定程度上提高對蝦抗副溶血弧菌的感染能力，這可能與選用的枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌能拮抗副溶血弧菌有關(guān)，雖然其拮抗機(jī)理還不明確，但前期研究表明，這2個(gè)菌株均能分泌抑制副溶血弧菌生長的活性物質(zhì)。腸道菌群分析也表明，試驗(yàn)組凡納濱對蝦腸道中弧菌屬細(xì)菌的數(shù)量少于對照組。

此外，對蝦抗副溶血弧菌感染能力的提升還可能與對蝦免疫力的增強(qiáng)相關(guān)[35-36]。王國霞等[37]在凡納濱對蝦幼蝦飼料中添加不同水平乳酸菌制劑，均能不同程度影響體液免疫因子，提高對蝦免疫力。由于受試驗(yàn)條件限制，筆者未能開展相關(guān)研究，將在今后工作中進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，連續(xù)投喂復(fù)合益生菌28 d能提升凡納濱對蝦腸道菌群的豐度和多樣性，提高副溶血弧菌感染后的成活率，且在停止投喂28 d后仍對腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生持續(xù)影響，證明了該復(fù)合益生菌對凡納濱對蝦具有益生作用，并為優(yōu)化投喂策略、降低養(yǎng)殖成本提供了理論依據(jù)。