何 敏,董曉慶,石利民,王雅倩,張守剛

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一種以發(fā)熱伴血小板、白細(xì)胞減少,嚴(yán)重者可出現(xiàn)出血和多器官功能障礙,甚至死亡的疾病。其致病原為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),簡(jiǎn)稱新型布尼亞病毒[1-2]。自2010年在我國(guó)河南、湖北等地出現(xiàn)后,各地報(bào)告的SFTS發(fā)病數(shù)逐年增加,并且多個(gè)省份發(fā)生SFTS 聚集疫情[3-5]。近年來(lái),南京市報(bào)告的SFTS病例數(shù)明顯高于以往[6],但聚集性案例鮮有發(fā)生。2020年4月南京鼓樓醫(yī)院收診了6例疑似一起聚集性SFTS疫情病人,對(duì)所有疑似病例進(jìn)行SFTSV 核酸檢測(cè),陽(yáng)性者擴(kuò)增S基因片段、測(cè)序并開展序列比對(duì)、溯源分析,為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)SFTSV 感染監(jiān)測(cè)和防控提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2020年4月15日南京市疾病預(yù)防控制中心收到南京鼓樓醫(yī)院送檢的6份急性期全血標(biāo)本,根據(jù)臨床特征和流行病學(xué)資料,疑似為一起聚集性SFTS事件。6例病人先后出現(xiàn)發(fā)熱、血小板減少等癥狀,且有聚集史。南京市疾病預(yù)防控制中心收檢樣本后,立即開展檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR 儀器(ABI Q5)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR 法)(達(dá)安基因)、SP96全自動(dòng)核酸提取儀(達(dá)安基 因)、One step RT-PCR kit(日 本TAKARA 公司)、Qiacel毛細(xì)管電泳儀(德國(guó)QIAGEN 公司),PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 方 法

1.3.1 核酸檢測(cè) 全血標(biāo)本,3 000×g離心5 min,分離血清。吸取200μL血清,按試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA,采用熒光定量PCR 法對(duì)所提核酸進(jìn)行新型布尼亞病毒的檢測(cè),陽(yáng)性標(biāo)本核酸留存,實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 S基因的擴(kuò)增和序列測(cè)定

1.3.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)SFTSV 的S基因特點(diǎn)自行設(shè)計(jì)片段引物。引物序列見(jiàn)表1。引物由上海英駿公司合成。

表1 S基因片段擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for amplification of the S gene fragment

1.3.2.2 病毒RNA 擴(kuò)增和測(cè)序 以 提取的病毒RNA 為模板,進(jìn)行一步法RT-PCR 擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)條件為50 ℃,30 min,94℃2 min;94℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。使用Qiacel對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,檢測(cè)有無(wú)目的條帶,隨后送至上海生工生物有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.3.2.3 基因測(cè)序及序列分析 用Dnastar中Seq-Man軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,獲得S目的基因片段序列;應(yīng)用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各樣本S基因序列進(jìn)行在線BLAST 比對(duì),分析最大相似性株。文中涉及的其他地區(qū)SFTSV 相關(guān)參考株S基因序列從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank 中下載。采用Meg Aline法進(jìn)行核苷酸序列同源性比較,MEGA5.2軟件對(duì)S 基因核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析,用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,可靠性分析采用Bootstrap法,循環(huán)次數(shù)設(shè)為1000。

2 結(jié)果

2.1 疑似聚集疫情病例關(guān)系特征 根據(jù)發(fā)病時(shí)間順序?qū)Σ±M(jìn)行編號(hào),1號(hào)病例,實(shí)驗(yàn)室標(biāo)號(hào)Nanjing200415-3許某,男,35歲,農(nóng)民,2020 年4 月1日發(fā)病,4月11日前往南京鼓樓醫(yī)院就診。后續(xù)2～6號(hào)病例2020年4月8日至4月11日期間相繼發(fā)病并就診。流行病學(xué)資料顯示,1號(hào)病例發(fā)病前自述有蜱蟲叮咬史,后續(xù)病例5例均無(wú)蜱蟲叮咬史。2號(hào)、4號(hào)與1號(hào)病例存在親屬關(guān)系,3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)自訴與1 號(hào)病例發(fā)生直接接觸(血液),無(wú)其他SFTS確診病例接觸史。2例為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民,余3例為工人,工作地點(diǎn)不同,工作環(huán)境中不存在疾病傳播媒介。2～6號(hào)病例發(fā)病時(shí)間集中,且有共同聚集、暴露史。初步考慮,該起疫情可能為一起直接接觸1號(hào)病例導(dǎo)致的聚集性疫情。見(jiàn)表1。

2.2 SFTSV 核酸檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)送檢的7例全血標(biāo)本進(jìn)行SFTSV 核酸檢測(cè)。其中5例(樣本號(hào) Nanjing200415-1、Nanjing 200415-2、Nanjing200415-4、Nanjing200415-6、Nanjing200415-7)SFTSV 核酸檢測(cè)陽(yáng)性,CT 值分別為35.1、34.3、36.0、35.2、33.4,Nanjing200415-3 為 陰性。見(jiàn)表2。

表2 一起疑似聚集性SFTSV病例基本信息及核酸檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Basic information and nucleic acid test results of a suspected cluster of SFTV cases

2.3 SFTSV S基因片段同源性比較 5例核酸陽(yáng)性(Nanjing200415-1、200415-2、200415-4、200415-6、200415-7)經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增,雙向測(cè)序后,對(duì)所得目的片段S基因進(jìn)行拼接。經(jīng)分析比對(duì),5例核苷酸高度同源,4例核苷酸同源性為100%,200415-2與其他4例核苷酸同源性為99.7%;與南京同期另一病例Nanjing200609-1 核苷酸同源性為95.2%;與GenBank下載的其他地區(qū)SFTSV 參考株的核苷酸同源性為93.8%～100%。經(jīng)NCBI網(wǎng)站在線BLAST 比對(duì),與此次疫情分離株S 基因片段核苷酸同源性最高的毒株為2014 年江蘇地區(qū)分離株JS2014-06和2015年江蘇地區(qū)分離株JS2015-26,核苷酸同源性為100%,見(jiàn)圖1。

圖1 Nanjing200415-1-5與其他SFTSV核苷酸同源性比較Fig.1 Homology comparison of nucleotides between Nanjing200415-1-5 and other SFTSV

2.4 SFTSV S片段進(jìn)化分析 將5例SFTSV 南京株S 片段基因序列與從GenBank 獲取的其他地區(qū)參考株進(jìn)行遺傳進(jìn)化和種系分析。通過(guò)進(jìn)化樹可以看到,自2010年以來(lái),江蘇地區(qū)歷年SFTS均有發(fā)生,基因型以C 型為主,C1、C2、C3、C4亞型均有發(fā)布。C分支內(nèi)的中國(guó)各地區(qū)流行株間高度同源,未發(fā)現(xiàn)地區(qū)差異。此次聚集性疫情的5例SFTSV分離株在同一進(jìn)化樹C2 亞型分支上聚集成一簇,親緣關(guān)系近;與2014年、2015年江蘇及安徽的流行株、2010年江蘇株、河南及安徽參比株形成遺傳距離相近的一個(gè)C2 亞型小分支;一株近期(2020年6月份)南京株分布在C4 亞型分支上,在C1、C3 亞型分支沒(méi)有分布。余日本和韓國(guó)毒株處于J基因型分支。見(jiàn)圖2。

圖2 2020年南京市一起聚集性SFTSV陽(yáng)性株S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Sgene of an outbreak of SFTSV positive strains in Nanjing in 2020

3 討論

以往監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,近年來(lái)南京及周邊地區(qū)發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)本地病例數(shù)出現(xiàn)了大幅增長(zhǎng),發(fā)病呈逐年上升態(tài)勢(shì)。但是一直以來(lái)江蘇及周邊地區(qū)SFTSV 聚集性疫情較少發(fā)生[6-7]。本次在較短時(shí)間、小范圍內(nèi)共計(jì)6人先后出現(xiàn)發(fā)熱、血小板減少等SFTS典型臨床癥狀[8]。根據(jù)?江蘇省發(fā)熱伴血小板減少綜合征專項(xiàng)監(jiān)測(cè)方案?規(guī)定,2周內(nèi),在同一村莊或在同一山坡等地勞動(dòng)或旅游人員中,出現(xiàn)2 例及以上發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例,或在病例密切接觸者中出現(xiàn)類似病例,為聚集性病例。本次聚集性疫情的發(fā)生,進(jìn)一步說(shuō)明了我市及周邊地區(qū)SFTSV 疫情形勢(shì)日益嚴(yán)峻。

有研究表明蜱可能在該病的傳播過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9],而聚集性疫情病例血液、體液、分泌物等可能是重要的傳播因子[10-11]。此次事件中,1號(hào)病例自述蜱蟲叮咬史,經(jīng)帶毒蜱類叮咬感染SFTSV,但其血液中SFTSV 核酸檢測(cè)為陰性,推測(cè)可能原因?yàn)榘l(fā)病時(shí)間久,且經(jīng)當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)抗病毒治療。對(duì)此病例血清開展抗體補(bǔ)充實(shí)驗(yàn),結(jié)果為Ig M 陰性,IgG 陽(yáng)性,證實(shí)1號(hào)病例確為SFTSV 感染者,且已處于恢復(fù)期。2～6號(hào)病例SFTSV 核酸檢測(cè)陽(yáng)性,均有與1號(hào)病例有共同聚集、接觸史,推測(cè)感染方式為在1號(hào)病例SFTSV 病毒載量較高的急性傳染期內(nèi),接觸其血液、分泌物或排泄物。

SFTS作為一種新發(fā)傳染病,隨著各地報(bào)告病例增加,國(guó)內(nèi)外對(duì)SFTSV 分子流行病學(xué)及基因測(cè)序逐漸增多和深入[12-14]。SFTSV 根據(jù)S片段基因序列分子特征可分為C 和J兩種基因型,其中C 基因型分為C1～C4 4種亞型[14-15]。李志鋒等研究表明,我國(guó)東部地區(qū)目前主要為C 基因型,江蘇和安徽優(yōu)勢(shì)流行株為C2 和C4 亞型,同時(shí)存在少量的C1和C3亞型流行[16]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,本次疫情病例均屬于C2 基因亞型,與江蘇北部及安徽地區(qū)屬同一分支,遺傳進(jìn)化距離較近;與國(guó)內(nèi)其他分離株及日本、韓國(guó)分離株不在同一分支,差異較大。從進(jìn)化樹中還可以看出,從2010年以來(lái),江蘇分離株廣泛分布于C2 亞型分支,不同年份毒株間親緣關(guān)系近,遺傳進(jìn)化速度較為緩慢。另有一部分江蘇流行株分布于C4亞型分支,本次事件同時(shí)期Nanjing200609病例屬于C4亞型分支,說(shuō)明南京地區(qū)同一時(shí)期SFTSV 流行株分子亞型并不單一,為C2亞型和C4亞型共流行狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn),SFTSV 基因型可能與病例嚴(yán)重程度相關(guān),SFTSV 感染死亡病例多為C2基因亞型[17]。本次聚集性疫情病原傳染性強(qiáng),病例癥狀較嚴(yán)重,進(jìn)一步佐證了這一研究。

目前尚無(wú)針對(duì)SFTSV 的特效藥物,也無(wú)有效疫苗可以接種[18]。因此,需積極開展廣泛宣傳,針對(duì)南京市SFTS流行區(qū)重點(diǎn)人群,普及防治知識(shí),提高民眾防病意識(shí)。同時(shí),加強(qiáng)對(duì)SFTS監(jiān)測(cè),通過(guò)對(duì)SFTSV 分子水平研究,掌握我市SFTSV 基因型流行特征以及遺傳進(jìn)化特點(diǎn),為南京地區(qū)SFTS防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:何敏,董曉慶,石利民,等.一起聚集性發(fā)熱伴血小板減少綜合征病原S基因分子進(jìn)化分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(6):502-506.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.068