寇永杰 ,李 瑞 ,鄭亞東 ,夏天奇 ,時恒枝 ,王 璞 ,楊 興,孫曉林

多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)在自然條件下主要寄生在終末宿主狐貍體內,其幼蟲多房棘球蚴則寄生在嚙齒動物體內。在少數(shù)情況下,人因食用了被蟲卵污染的食物或水也可以感染,引起多房棘球蚴病,又稱泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)。AE在我國西北牧區(qū)是一種比較常見的寄生蟲病,傳播范圍廣,致病力強,嚴重危害牧民的生命健康[1]。在寄生過程中,多房棘球蚴不僅對肝臟造成機械性損傷,也能引起肝臟腫大和膿腫,進而誘發(fā)肝癌。由于AE 潛伏期較長,達5～10年之久,且缺乏有效的早期檢測方法和有效的治療手段,使得該病在我國現(xiàn)階段仍有一定的流行,難以根除[2]。

隨著對RNA 分子研究的深入,一類特異結合RNA 分子的蛋白質,即RNA 結合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)被發(fā)現(xiàn),它們在多房棘球絳蟲的生命活動和寄生蟲-宿主互作中發(fā)揮重要作用。RBPs是一類與RNA 結合并參與RNA 合成、翻譯、剪切和代謝的蛋白質[3]。除了少部分非編碼RNA是以核酶的形式存在并發(fā)揮作用外,大部分則需要與RBPs結合形成RNA-蛋白質復合物而發(fā)揮作用[4]。RBPs的種類有很多,約占細胞總蛋白的6%～8%,但目前只有為數(shù)不多的RBPs的生物學功能較為清楚,例如Argonautes蛋白(AGO)、Human antigen R 蛋白(HuR)、RNA 結合 蛋 白Tristetraprolin(TTP)等。這些蛋白主要與RNA 分子發(fā)生互作,負責調控甲基化修飾、miRNAs沉默復合體的形成、可變剪切等生物學過程[5-7]。RBPs作為一種多功能調節(jié)因子,其修飾及空間構象的改變也可影響與RNA 結合的穩(wěn)定性,從而引起細胞一系列生物學功能的改變,這些變化往往會導致各種疾病的發(fā)生[8-9]。事實證明,RBPs對RNA 的調控作用,還受到一些與RBPs互作的效應蛋白影響。但到目前為止,對多房棘球絳蟲RBPs及其互作蛋白質的研究鮮有報道[10]。

本研究通對多房棘球絳蟲RNA 結合蛋白編碼基因進行分析,發(fā)現(xiàn)RNA binding proteins 28(EmuJ_001107900.1,RBP28)是一種在多房棘球絳蟲中表達的RBPs。通過制備特異性較高的多克隆抗體,探究了RBP28蛋白在蟲體及其細胞內的分布情況。同時利用免疫共沉淀和蛋白質質譜分析技術,初步篩選了潛在與RBP28互作的蛋白質。這有助于進一步解析RBP28與其蛋白質之間的互作關系及其生物學功能。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲與實驗動物 實驗所用的多房棘球蚴為實驗室保存;新西蘭大白兔SCXK(甘)2020-0002購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 原核表達質粒p ET-28a、BL21(DE)感受態(tài)細胞均為實驗室保存;TRIzol LS Reagent購自美國Ambion公司;IPTG、細胞裂解液和蛋白酶抑制劑購自ThermoFisher公司;HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司;免疫共沉淀試劑購自美國GE公司。

1.3 多房棘球蚴總RNA 和總蛋白的提取 按照RNA 提取試劑的操作步驟,提取多房棘球蚴總RNA,并測定RNA 濃度。蟲體總蛋白的提取方法如下:將混有蛋白酶抑制劑的IP 裂解液(1∶100)500μL 與蟲體混勻,進行研磨破碎;隨后于4 ℃,13 000×g離心20 min,收集上清,測定蛋白濃度。

1.4 RBP28編碼基因的擴增、原核表達及重組蛋白的純化 按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行cDNA 合成。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中RBP28基因序列設計帶有BamH I和SacⅠ酶切位點的引物,上游引物為:5′-GGATCCATGGGGCGGAGGTCAGGG-3′;下游引物為:5′-GAGCTCTTACTTTCCTTTCTTCGG3′-(下標序列為酶切位點序列),PCR 反應體系:96 ℃變性3 min;95℃30 s,57℃40 s,72℃90s,36個循環(huán);72℃10 min。將目的產物連接至p ET-28a質粒,并轉入BL21菌株,加入IPTG 進行16 ℃誘導培養(yǎng)。超聲破碎后,用Ni-NTA 柱進行蛋白純化,8% SDSPAGE檢測目的蛋白純度。

1.5 RBP28多克隆抗體的制備及Western blot分析 免疫新西蘭大白兔,進行3次免疫接種,每次接種間隔為15 d。45 d后,收集兔血清,用飽和硫酸氨法純化抗體。利用純化抗體對多房棘球蚴全蟲蛋白和重組蛋白RBP28進行Western blotting檢測,將蛋白變性后經10% SDS-PAGE 電泳分離,將制備的抗體作為一抗,以HRP 標記山羊抗兔IgG 作為二抗,進行蛋白鑒定。

1.6 免疫熒光定位 將制備好的多房棘球蚴包囊切片進行脫蠟和抗原修復。PBS清洗后,加0.25%Triton X-100處理15 min,之后加入RBP28多克隆抗體(1∶200)作為一抗,再加AlexaFluor 594標記的山羊抗家兔IgG(1∶2 000),暗盒中37 ℃孵育1 h。滴加DAPI染液,在鏡下觀察。將多房棘球蚴剪碎后,加入含有胰酶的PBS溶液,37 ℃,消化1 h。將消化后的蟲體細胞加入細胞培養(yǎng)皿。細胞貼壁后,棄上清,加入1 mL 4%多聚甲醛,固定30 min,其他步驟同上。同時,設陰性血清作為對照。

1.7 免疫共沉淀與蛋白銀染 免疫共沉淀步驟參照PierceTMCo-Immunoprecipitation Kit操作說明書進行。分別設置陰性血清組(G－)和多克隆抗體組(G＋)。對免疫共沉淀產物樣品在經10%SDSPAGE電泳后,通過銀染進行檢測。

1.8 質譜分析 將陰性血清組G－和多克隆抗體組G＋的產物送至上海生工生物工程股份有限公司。使用Q Exactive Plus液質聯(lián)用系統(tǒng)進行質譜分析,獲得的質譜數(shù)據(jù)通過ProteinPilot(V4.5)進行檢索。對Uniprot(https://www.uniprot.org)和

Worm Base(https://parasite.wormbase.org/index.html)數(shù)據(jù)庫檢索時,采用Paragon算法,檢索結果以Unused≥1.3為標準進行篩選。

2 結果

2.1 RBP28基因克隆和p ET-28a-RBP28重組質粒的構建、誘導表達及純化 經RT-PCR 擴增得到與RBP28編碼基因大小相同的單一條帶,大小為1 245 bp(圖1A),且p ET-28a-RBP28質粒成功構建(圖1B)。SDS-PAGE 結果顯示,重組蛋白在上清中的表達量較高,相對分子質量約為Mr50 000。在純化過程中,發(fā)現(xiàn)以300 mmol/L咪唑進行洗脫時,純化效果較好(圖1C)。

圖1 RBP28基因擴增及其誘導表達、純化Fig.1 Amplification,induced expression and purification of the RBP28 gene

2.2 RBP28多克隆抗體制備及特異性檢測 采集血清制備RBP28 多克隆抗體,SDS-PAGE 結果可見重鏈和輕鏈(圖2A)。Western blot結果顯示,無論是純化的重組蛋白RBP28還是多房棘球蚴全蛋白約在相對分子質量Mr50 000處均出現(xiàn)明顯的反應條帶,而陰性對照則沒有,表明制備的RBP28重組蛋白抗體具有較好的特異性,如圖2B 和2C 所示。在細粒棘球絳蟲中能夠檢測到很淡的反應條帶,但是條帶位置與RBP28不同,然而在豬帶絳蟲和泡狀帶絳蟲中卻沒檢測到明顯的反應條帶(圖2D),提示RBP28是一種多房棘球絳蟲階段特異表達的RNA 結合蛋白。

圖2 RBP28重組蛋白抗體制備及特異性檢測Fig.2 Preparation and specificity detection of RBP28 recombinant protein antibodies

2.3 RBP28在多房棘球蚴及其細胞中的分布 對多房棘球蚴組織切片熒光染色發(fā)現(xiàn),RBP28蛋白主要分布在生發(fā)層(圖3A),而在多房棘球蚴細胞,它則主要分布于細胞質中(圖3B),提示它可能在寄生蟲生長、發(fā)育中發(fā)揮作用。

圖3 RBP28在多房棘球蚴包囊和細胞中的分布Fig.3 Distribution of RBP28 in E.multilocularis cysts and cells

2.4 免疫共沉淀產物銀染及質譜鑒定結果分析 SDS-PAGE 銀染顯示,RBP28多克隆抗體組(G＋)免疫共沉淀產物,與陰性血清組(G－)的相比,條帶分布有所不同,特別是在相對分子質量Mr70 000～90 000(圖4),可能存在RBP28的互作蛋白。

圖4 免疫共沉淀產物銀染Fig.4 Silver staining of immunoprecipitation products

質譜結果為G－組共獲得蛋白215種,而G＋組獲得蛋白161種。對質譜鑒定結果進行韋恩圖分析,發(fā)現(xiàn)有24種蛋白是G＋組所特有的(圖5)。隨后通過基因序列及功能比對分析,初步篩選出了7個最有可能與RBP28相互作用的蟲體蛋白,包括核糖體產生因子2 同源蛋白(ribosome production factor 2 homolog)、糖蛋白抗原5(glycoprotein antigen 5)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxy kinase)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、14-3-3 蛋白同源物2(14-3-3 protein homolog 2),以及2個未知的保守蛋白,即蛋白Anoctamin 和Expressed conserved protein(表1)。

表1 可能與RBP28互作的蛋白質Tab.1 Potential proteins in interaction with RBP28

圖5 免疫共沉淀產物ESI質譜測試結果韋恩圖Fig.5 Venn diagram of ESI mass spectrometry results for immunoprecipitation products

3 討論

多房棘球絳蟲屬于圓葉目、帶科、棘球屬,人和易感動物因誤食蟲卵污染的食物而感染該寄生蟲。蟲卵進入到腸胃,激活后突破胃腸道壁進入血液循環(huán),最終定植于寄生部位發(fā)育。由于多房棘球蚴特殊的寄生方式,目前對多房棘球蚴的體內發(fā)育機制仍不清楚[11]。在生物基因的表達中,RBPs發(fā)揮著重要的作用。因此,對于多房棘球絳蟲RBPs的研究有助于了解其生長發(fā)育。在一些物種和疾病中RBPs已經被發(fā)現(xiàn)起到重要的作用,例如研究表明胰島素樣生長因子2 m RNA 結合蛋白家族、Mex-3家族蛋白和Musashi2(MSI2)蛋白家族等一些RBPs與物質代謝、癌癥和腫瘤等有著密切的聯(lián)系[12-14]。此外,RBPs在寄生蟲的生長發(fā)育中也發(fā)揮作用。研究表明,布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)RBP10(RNA binding protein 10)在促進布氏錐蟲的形態(tài)分化的過程中起到關鍵作用[15]。本實驗中,我們選擇多房棘球絳蟲RBP28作為研究對象,通過原核表達、純化、制備特異性多克隆抗體等證實,制備的RBP28多克隆抗體能夠識別多房棘球蚴全蟲蛋白中的天然RBP28,與泡狀帶絳蟲和豬帶絳蟲全蟲蛋白不反應,只與細粒棘球絳蟲全蟲蛋白有著微弱的反應,并且反應條帶位置不同,表明RBP28可是一種多房棘球絳蟲幼蟲階段特異表達的RNA 結合蛋白。

目前大部分研究集中于分析RBPs與RNA 分子之間的相互關系,以了解RBPs如何調控RNA分子,以及這種調控對于維持細胞正常生理活動的作用。一些研究發(fā)現(xiàn),RBPs對特定RNA 分子調控時,存在一些與RBPs類似作用或輔助作用的效應蛋白,很大程度上參與并影響RNA 分子與RBPs之間的互作[16]。例如,人多聚嘧啶結合蛋白1(PTBP1)與lncRNA SNHG6(small nucleolar RNA host gene 6)的結合,受到PTBP1互作蛋白賴氨酸甲基轉移酶(SETD7)的影響,通過競爭性抑制作用來調控PTBP1 與lnc RNA SNHG6 之間的結合,進而影響肝癌的發(fā)生[17]。為了發(fā)現(xiàn)與RBP28互作的蛋白,本研究以RBP28蛋白作為誘餌,在多房棘球蚴全蟲蛋白中篩選互作蛋白。由于多房棘球蚴蛋白質組成復雜,而且本實驗所使用的抗體為多克隆抗體,難免會有一些非特異性的吸附。為了確保實驗的可靠性,我們采用對兔IgG 有較高結合能力的免疫共沉淀Protein G 磁珠,有效降低非特異性結合的影響。

在質譜的結果中,我們發(fā)現(xiàn)有24個蛋白是G＋組所特有的。經過蛋白序列對比和功能預測,我們共篩選出7種可能與RBP28存在互作的蛋白。其中,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和磷酸甘油醛脫氫酶是參與細胞內糖代謝的主要蛋白酶,能夠為細胞內生理活動提供ATP 和供氫體NADPH。我們推測這2種酶可能為RBP28結合并調控靶標RNA 分子的過程中提供必要的能量[18-19]。糖蛋白抗原5和14-3-3蛋白同源物2 具有信號傳導和蛋白質水解功能,可能與RBP28蛋白的生物活性有關[20-21]。核糖體合成因子2 同源蛋白屬于核糖體蛋白家族,在RNA 的翻譯、轉運和多肽的合成方面具有重要的作用。核糖體蛋白也可以作為一種RBPs[22-23],它與RBP28的互作可能對于r RNA 的生物功能具有一定影響。RBP28與這些蛋白的互作及其生物學功能還需進一步研究。上述研究結果為進一步探究多房棘球絳蟲RBP28與其互作蛋白的關系和分子機制提供了一定的參考。

利益沖突:無

引用本文格式:寇永杰,李瑞,鄭亞東,等.多房棘球絳蟲RNA 結合蛋白28的鑒定[J].中國人獸共患病學報,2022,38(6):490-495.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.072