石哲芳,羅春雨,李亞飛,劉 奇
獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的一類傳染性疾病。根據(jù)聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署(UNAIDS)2021年報(bào)告,截止2020 年年底,全球現(xiàn)存活HIV感染者人數(shù)達(dá)到3 770 萬(wàn),其中2020 年新發(fā)HIV感染者有150萬(wàn),AIDS相關(guān)死亡人數(shù)達(dá)68萬(wàn)[1]。
在HIV-1感染過(guò)程中,病毒包膜糖蛋白(Env)介導(dǎo)的膜融合是HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞的關(guān)鍵步驟,并決定了病毒株的細(xì)胞嗜性?;诓《九c靶細(xì)胞表面輔助受體結(jié)合能力的不同,HIV-1毒株可分為3種類型:R5型、X4型和R5X4型[2]。其中,利用CCR5輔助受體的分離株稱為R5型病毒,利用CXCR4輔助受體的分離株稱為X4 型病毒,既能利用CCR5又能利用CXCR4 的稱為R5X4 型或雙嗜性病毒。其中,HIV-1的實(shí)驗(yàn)室病毒株NL4-3(X4型)[3],被用來(lái)進(jìn)行抗HIV-1藥物的活性測(cè)定。
但是,HIV-1的活病毒檢測(cè)需要在P3 級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,從而限制了HIV-1進(jìn)入抑制劑的研究活動(dòng)。研究首先構(gòu)建了一種能同時(shí)表達(dá)NL4-3的env基因及綠色熒光蛋白GFP的真核表達(dá)質(zhì)粒并瞬轉(zhuǎn)293T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,以表達(dá)CCR5 和CXCR4 的TZM-b1 細(xì)胞作為靶細(xì)胞,用于檢測(cè)HIV-1介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合的檢測(cè)模型。該模型是一種無(wú)病毒感染風(fēng)險(xiǎn)、可視化、能夠在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作的HIV-1進(jìn)入抑制劑檢測(cè)模型。
1.1 材 料
1.1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和多肽 感受態(tài)細(xì)胞(DH-5α)購(gòu)自天根生物科技有限公司??寺≥d體p AAVIRES-GFP、含有HIV-1 NL4-3env基因的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-NL4-3、HEK-293T 與TZM-b1 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。多肽C34、T1144由浙江昂拓萊司公司合成。其中C34 序列為:WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL;T1144 序列為:TTWEAWDRAIAEYAARIEA LLRALQEQQEKNEAALREL。
1.1.2 主要試劑EcoRI、XhoI等限制性內(nèi)切酶及T4 DNA Ligase購(gòu)自Takara公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;快速小提質(zhì)粒試劑盒、大提質(zhì)粒試劑盒、DNA 純化試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司;EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Life-iLab李記生物;DMEM 培養(yǎng)基及細(xì)胞凍存液購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司;胎牛血清購(gòu)自TheromoFisher公司;胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、BSA、TMB、4%福爾馬林緩沖液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。帶有人Fc標(biāo)簽的CD4蛋白購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司。NaCl、KCl、Na2HCO3、KH2PO4、枸櫞酸、H2O2購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑有限公司,羊抗人IgG 購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司。
1.2 方 法
1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中HIV NL4-3的env基因序列(登錄號(hào):MN685349)及其上下游序列設(shè)計(jì)PCR 引物,由昆明擎科生物科技有限公司合成。其中上游引物(NL4-3-F):5′-GGAATTCCGGAGACAGCGACGAAGA-3′;下游引物(NL4-3-R):5′-CCTCGAGGTCTGCTGCTGGCTCAGCT-3′(下劃線處分別是EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn))。
1.2.2 NL4-3env基因的擴(kuò)增 以含有NL4-3env基因的質(zhì)粒pcDNA-NL4-3為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:2×Phanta Max Buffer 50μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 2μL,d NTP Mix(10 mmol/L each)2μL,NL4-3-F 4μL,NL4-3-R 4μL,DNA 模板4μL,補(bǔ)水至100μL。反應(yīng)條件:95 ℃30 s;95 ℃15 s,60.7 ℃15 s,72 ℃3 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
1.2.3 重組質(zhì)粒p AAV-IRES-GFP-NL4-3env的構(gòu)建 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用天根膠回收試劑盒回收純化,回收產(chǎn)物與p AAV-IRES-GFP分別用EcoRI和XhoI雙酶切。酶切體系:EcoRI和XhoI各2 μL,10×Fast Digest Green Buffer 10μL,DNA 2 μg,補(bǔ)水至100μL。37 ℃酶切20 min后于1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后與p AAV-IRES-GFP載體連接。連接體系:載體100 ng,插入片段與載體以7:1 摩爾比加入,10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL,T4 DNA Ligase 1μL,補(bǔ)水至20μL,均勻混合后至4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板培養(yǎng)后挑取單個(gè)克隆,小提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證,含有3.1 kbp條帶的陽(yáng)性克隆送測(cè)序。
1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞與靶細(xì)胞TZM-b1均采用添加10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素混合液)的高糖DMEM 培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h鋪于6孔板,每孔約5×105個(gè)細(xì)胞。待貼壁細(xì)胞的密度達(dá)80%左右,且細(xì)胞形態(tài)良好時(shí),采用Life-iLab李記生物公司的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。主要步驟如下:取質(zhì)粒DNA 3μg加到125μL無(wú)血清和抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中,作為稀釋質(zhì)粒;取EZ Trans 9μL加到125μL 無(wú)血清和抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中,作為稀釋后的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑。然后將稀釋好的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已經(jīng)稀釋好的質(zhì)粒DNA 當(dāng)中。室溫放置15 min,形成EZ Trans復(fù)合物。將上述250μL EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入293T 細(xì)胞的培養(yǎng)孔中,輕輕搖晃培養(yǎng)使EZ Trans-DNA 復(fù)合物均勻分布。在5% CO2培養(yǎng)箱中37℃下孵育細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12~18 h,棄去含EZ Trans-DNA 復(fù)合物的培養(yǎng)基,更換新鮮培養(yǎng)液,培養(yǎng)至36~48 h。其中,轉(zhuǎn)染p AAV-IRES-GFPNL4-3質(zhì)粒的293T 細(xì)胞命名為293T/NL4-3/EGFP細(xì)胞,轉(zhuǎn)染p AAV-IRES-GFP質(zhì)粒的293T 細(xì)胞命名為293T/EGFP細(xì)胞。
1.2.5 細(xì)胞ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞NL4-3env的表達(dá)水平 參照文獻(xiàn)[4]介紹的方法并稍作改進(jìn)。1)去除穩(wěn)定表達(dá)p AAV-IRES-GFP-NL4-3和p AAVIRES-GFP細(xì)胞的培養(yǎng)上清,用PBS洗2次;2)每孔加入125μL 10%甲醛室溫固定15 min,雙蒸水洗3次,晾干;3)每孔加入250μL 含2% BSA 的PBS,37 ℃封閉1 h,雙蒸水洗3次;4)加入1% BSA 的PBS稀釋后的帶有人Fc標(biāo)簽的CD4(1∶5 000)50 μL,37 ℃孵育2 h,雙蒸水洗板5次;5)加入50μL含1%BSA 的PBS稀釋的羊抗人IgG(1∶10 000),37 ℃孵育1 h,雙蒸水洗板5次;6)加入TMB顯色劑50 μL,室溫顯色20 min,加 入25 μL 10%H2SO4溶液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD值,此OD 值反應(yīng)293T/NL4-3/EGFP、293T/EGFP細(xì)胞上NL4-3env的表達(dá)水平。
1.2.6 NL4-3env介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合 細(xì)胞融合前一天將靶細(xì)胞TZM-b1鋪于96孔板,每孔約5×104個(gè)細(xì)胞。在96 孔培養(yǎng)板上,將穩(wěn)定表達(dá)HIV-1包膜蛋白env的效應(yīng)細(xì)胞293T/NL4-3/EGFP和陰性對(duì)照細(xì)胞293T/EGFP,與含有CD4受體和CXCR4輔助受體的靶細(xì)胞TZM-b1混合,在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng),并于不同時(shí)間點(diǎn)使用熒光顯微鏡的綠色熒光通道觀察細(xì)胞融合情況。
1.2.7 陽(yáng)性藥物的抑制活性測(cè)定 以C34 和T1144為HIV 進(jìn)入抑制劑陽(yáng)性藥物[5-6],測(cè)定其在本模型的抑制活性。293T/NL4-3/EGFP 與TZMb1共培養(yǎng)作為陽(yáng)性孔;293T/EGFP 與TZM-b1共培養(yǎng)作為陰性孔;以C34和T1144與293T/NL4-3/EGFP及TZM-b1共培養(yǎng)作為檢測(cè)孔。于2 h后,計(jì)算各孔的細(xì)胞融合情況,同時(shí)計(jì)算檢測(cè)孔中C34及T1144對(duì)細(xì)胞融合的抑制率。抑制率=[1-(E-N)/(P-N)]×100%。其中“E”代表實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞融合率;“P”和“N”分別代表陽(yáng)性組和陰性組的細(xì)胞融合率。半數(shù)抑制濃度(IC50)使用Calsusyn軟件進(jìn)行計(jì)算。
2.1 293T/NL4-3/EGFP的質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定以HIV NL4-3的DNA 為模板,擴(kuò)增env的全長(zhǎng)基因。經(jīng)雙酶切后連接入p AAV-IRES-GFP載體,并轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。抽提質(zhì)粒,用EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定,得到6.1 kbp的載體片段和3.1 kbp的env基因片段(圖1A),提示重組p AAV-IRES-GFP-NL4-3env質(zhì)粒構(gòu)建成功。測(cè)序后Blast結(jié)果與HIV NL4-3env基因完全吻合。
p AAV-IRES-GFP-NL4-3經(jīng)大提質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞(293T/NL4-3/EGFP),結(jié)果如圖1B??梢?jiàn)該質(zhì)粒能成功表達(dá)GFP,轉(zhuǎn)染效率良好,可以進(jìn)行后續(xù)的融合實(shí)驗(yàn)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證NL4-3env的表達(dá)情況,使用細(xì)胞ELISA 檢測(cè)不同細(xì)胞的env表達(dá)水平(結(jié)果見(jiàn)圖1C)。其中,293T 細(xì)胞OD 值為(0.092±0.006);p AAV-IRES-GFP轉(zhuǎn)染后的293T 細(xì)胞,其OD 值為(0.147±0.033);轉(zhuǎn)染p AAV-IRES-GFP-NL4-3的293T 細(xì)胞,OD 值達(dá)(0.904±0.112)以上。其P/N 值(P:OD293T/NL4-3/EGFP,N:OD293T/EGFP)為(6.15±2.13)≥2.1,提示轉(zhuǎn)染后的293T 細(xì)胞(293T/NL4-3/EGFP)可成功表達(dá)NL4-3env。
圖1 293T/NL4-3/EGFP的質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及env 表達(dá)鑒定Fig.1 Plasmid construction,transfection and env expression identification of 293T/NL4-3/EGFP
2.2 293T/NL4-3/EGFP與TZM-b1細(xì)胞的融合根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,NL4-3 病毒可以感染TZM-b1[7]。因此我們首先使用TZM-b1 作為細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。將p AAV-IRES-EGFP-NL4-3 以及p AAVIRES-EGFP 分別轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞,獲得293T/NL4-3/EGFP細(xì)胞與293T/EGFP細(xì)胞。然后將其與TZM-b1共同孵育。該效應(yīng)細(xì)胞特異識(shí)別TZMb1細(xì)胞上的CD4、CXCR4受體,兩者發(fā)生融合。結(jié)果如圖2。
將293T/NL4-3/EGFP 效應(yīng)細(xì)胞與TZM-b1靶細(xì)胞在37 ℃共同培養(yǎng)2 h后,細(xì)胞與細(xì)胞發(fā)生融合,融合與未融合細(xì)胞相比,面積增大,熒光強(qiáng)度變?nèi)?。這是由于細(xì)胞發(fā)生融合的同時(shí),EGFP 從293T/NL4-3/EGFP效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)散到靶細(xì)胞TZMb1中,導(dǎo)致綠色熒光在細(xì)胞中重新分布。對(duì)照組293T/EGFP并沒(méi)有發(fā)生融合,表明這是由NL4-3env介導(dǎo)的細(xì)胞融合。
共培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞與細(xì)胞之間形成更大的融合,在光學(xué)視野和熒光視野下都能看到。與實(shí)驗(yàn)組相比,對(duì)照組在培養(yǎng)過(guò)程中,既沒(méi)有發(fā)生融合,也沒(méi)有形成大的合胞體。之后我們進(jìn)一步使用DAPI對(duì)融合細(xì)胞(2 h的融合形態(tài))進(jìn)行細(xì)胞核染色。DAPI為一種可以穿透細(xì)胞膜并和細(xì)胞核中的雙鏈DNA 結(jié)合的熒光染料,在364 nm 波長(zhǎng)激發(fā)后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的藍(lán)色熒光。經(jīng)DAPI染核以后,我們可以清楚的看到,發(fā)生融合的細(xì)胞可見(jiàn)2個(gè)或更多的細(xì)胞核,見(jiàn)圖3框選區(qū)域。而沒(méi)有融合的細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞核。這進(jìn)一步證實(shí)了,圖中綠色熒光范圍增大,熒光變暗的細(xì)胞是293T/NL4-3/EGFP細(xì)胞與TZM-b1細(xì)胞融合的產(chǎn)物。
圖3 融合細(xì)胞的細(xì)胞核染色(20×)Fig.3 Nuclear staining of fused cells(20×)
2.3 HIV 進(jìn)入抑制劑的活性檢測(cè) 為檢測(cè)在該模型上HIV 進(jìn)入抑制劑的效果,我們選用了HIV 進(jìn)入抑制劑C34和T1144進(jìn)行方法驗(yàn)證,同時(shí)用EK1作陰性對(duì)照(一種冠狀病毒融合抑制劑)[8]。結(jié)果表明(圖4),HIV 進(jìn)入抑制劑C34、T1144均以劑量依賴的方式有效地抑制了NL4-3env誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合,而EK1 則對(duì)NL4-3 融合沒(méi)有抑制作用。其中,C34的IC50為(72±6.24)nmol/L,T1144的IC50為(15±6.94)nmol/L,均與前人報(bào)道的IC50值(低nmol/L水平)相當(dāng)[5-6,9]。
圖4 NL4-3 env 介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合模型上HIV進(jìn)入抑制劑抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of HIV entry inhibitor on envmediated cell-cell fusion model of NL4-3
臨床治療艾滋病主要采用的是由逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合使用的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (Highly activate anti-retroviral therapy,HAART),又稱“雞尾酒療法”[10]。但長(zhǎng)期使用此療法可引起嚴(yán)重不良反應(yīng),并且容易誘導(dǎo)HIV 突變,從而導(dǎo)致耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重[11]。為了解決艾滋病毒耐藥性問(wèn)題,對(duì)新型抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的需求日益增加。因此迫切需要可靠和簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)候選抗艾滋病毒藥物。
進(jìn)入抑制劑在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞前就能發(fā)揮作用,在感染最初階段就可將病毒傳播路徑切斷。因此在預(yù)防和治療HIV 感染方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞包括3 個(gè)主要步驟:gp120 與CD4結(jié)合,然后與共受CXCR4或CCR5結(jié)合,隨后gp41發(fā)生構(gòu)象變化,導(dǎo)致病毒和靶細(xì)胞膜融合[12]。根據(jù)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過(guò)程,HIV 進(jìn)入抑制劑可分為:吸附抑制劑、輔助受體抑制劑、融合抑制劑。其中吸附抑制劑是靶向gp120與CD4結(jié)合的抑制劑;輔助受體抑制劑是靶向CCR5或CXCR4的共受體結(jié)合的抑制劑;融合抑制劑是以gp41為作用靶點(diǎn),通過(guò)阻止gp41介導(dǎo)的膜融合過(guò)程中功能性六螺旋體(six-helix bundle,6-HB)結(jié)構(gòu)的形成,進(jìn)而阻斷HIV 進(jìn)入靶細(xì)胞的一類抑制劑[13]。
細(xì)胞-細(xì)胞融合模型是用于檢測(cè)HIV 進(jìn)入抑制劑的重要方法。傳統(tǒng)的HIV 細(xì)胞細(xì)胞融合模型是將感染有HIV-1活病毒的H9細(xì)胞與靶細(xì)胞MT2進(jìn)行融合,進(jìn)而作為進(jìn)入抑制劑的篩選方法[14]。但此方法中H9細(xì)胞呈HIV 的慢性整合感染狀態(tài),具有感染性,因此只能在P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。為了減少實(shí)驗(yàn)室感染風(fēng)險(xiǎn),學(xué)者嘗試構(gòu)建一些無(wú)感染性的細(xì)胞-細(xì)胞融合模型,用于進(jìn)入抑制劑的篩選。其中,王小利等[15]建立的基于包膜蛋白和Tat蛋白篩選HIV-1細(xì)胞融合抑制劑的方法,利用編碼β-半乳糖苷酶和熒光素酶的報(bào)告基因來(lái)進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞融合分析。由于引入相應(yīng)可重復(fù)的報(bào)告基因,從而使實(shí)驗(yàn)更加便于定量分析。然而,當(dāng)2種細(xì)胞融合時(shí),影響任一蛋白之間的相互作用過(guò)程,均會(huì)導(dǎo)致報(bào)告基因的變化,導(dǎo)致這些分析可能減少細(xì)胞-細(xì)胞融合模型的特異性。另一種是使用2種不同熒光親脂性探針的基于熒光的細(xì)胞融合分析,細(xì)胞融合必須通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量,不便于快速篩選HIV-1進(jìn)入抑制劑[16]。
參照課題組前期構(gòu)建的無(wú)感染、可視化MERSCo V 檢測(cè)模型[17],本研究構(gòu)建了一種無(wú)感染性的、可肉眼觀察的HIV-1檢測(cè)模型。該研究首先構(gòu)建了表達(dá)HIV NL4-3env并同時(shí)表達(dá)GFP 的細(xì)胞(293T/NL4-3/EGFP),用于模擬病毒的進(jìn)入過(guò)程,從而與靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞融合,構(gòu)建了一個(gè)能明顯形成合胞體的無(wú)感染性HIVenv誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合檢測(cè)體系。由于使用的是表達(dá)HIV-1包膜蛋白的293T 細(xì)胞模擬病毒與靶細(xì)胞的融合過(guò)程,從而避免了HIV 感染的風(fēng)險(xiǎn),此外,該方法簡(jiǎn)單方便,成本較低,具有很高的特異性,可在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù),因此可在普通生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,并可望發(fā)展成為一個(gè)用于檢測(cè)HIV 進(jìn)入抑制劑的非感染性高內(nèi)涵(High Content Screening,HCS)藥物篩選模型[18]。
利益沖突:無(wú)
引用本文格式:石哲芳,羅春雨,李亞飛,等.HIV NL4-3病毒株非感染性細(xì)胞-細(xì)胞融合模型的構(gòu)建[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(6):496-501.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.070