劉春霞，段國霞，劉麗君，陳素敏，李翠枝*，呂志勇

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

對嬰幼兒來說，母乳是生長發(fā)育過程中最理想的食物來源。乳脂肪作為母乳的重要成分之一，雖然僅占母乳的3%～5%，卻能提供50%～60%的能量，也提供必需脂肪酸、脂溶性維生素和生物活性物質(zhì)，是嬰兒成長所需能量的主要來源[1-2]。乳脂肪中甘油三酯大部分都是U-S-U結(jié)構(gòu)（U代表不飽和脂肪酸，S代表飽和脂肪酸）[3-7]，這與大部分植物油的構(gòu)型顯著不同[8-12]。人乳脂的組成和結(jié)構(gòu)比較特殊，從人乳脂脂肪酸組成來看，主要包括油酸、棕櫚酸和亞油酸，分別占人乳脂的5%～35%、20%～30%、10%～20%[13-14]。因此。由這3種脂肪酸通過一定方式生成的1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯（1-oleic-2-palmitic-3-linoleic acid triglyceride，OPL）為U-S-U結(jié)構(gòu)[15-18]，這種獨特的結(jié)構(gòu)可促進嬰兒對脂肪和鈣的吸收，并對脂代謝有顯著影響[19-22]。夏袁[23]分析我國無錫地區(qū)309 份不同哺乳時期母乳的甘油三酯組成，發(fā)現(xiàn)OPL含量最高，可達23.24%～28.34%。OPL約占母乳脂中甘油三酯含量的25%，是中國母乳中含量最豐富的甘油三酯之一，嬰兒配方乳粉是嬰兒最理想的人乳替代食品[24-26]。

牛乳是嬰幼兒配方乳粉的重要原料，而它與母乳相比吸收率較低，主要因為牛乳脂肪中棕櫚酸的位置分布主要在sn-1和sn-3位酯化，sn-2棕櫚酸酯占35%，遠低于母乳中sn-2棕櫚酸酯含量。為使這些嬰幼兒獲得與母乳相似的營養(yǎng)，就需要對牛乳脂肪進行結(jié)構(gòu)化改造，或采用結(jié)構(gòu)油脂，使其甘油三酯的脂肪酸組成更接近母乳[27-30]。所以，有必要開發(fā)一種能夠滿足添加OPL乳粉的檢測方法。

本研究主要針對乳粉基質(zhì)，采用CP-TAP CB彈性石英毛細管柱進行分離，氫火焰離子化檢測器測定OPL的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉：市場隨機抽取共6 種樣品。

標準物質(zhì)：OPL標準品（C55H100O6，純度≥99%）北京曼哈格生物科技有限公司；石油醚（分析純）、乙醚（分析純）、無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；氨水（優(yōu)級純）、氫氧化鉀（分析純）天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；正庚烷（色譜純） 天津光復(fù)精細化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀（配備氫火焰離子化檢測器）美國安捷倫公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SuperVario-N多功能離心機 德國Funke Gerber公司；Pro UV超純水機 美國賽默飛世爾公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京興偉儀器有限公司；MS 3 basic渦旋振蕩器、RVID旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

1.3.1.1 樣品水解稱取乳粉試樣約1.0 g至毛氏抽脂瓶中，加入10 mL（65±5）℃的水溶解試樣，振搖，使樣品完全溶解，加入2 mL體積分數(shù)為25%的氨水，置于60～70 ℃水浴中15～20 min，約3～5 min左右振蕩1 次，取出，冷卻至室溫，靜置30 s。

1.3.1.2 脂肪提取

加入10 mL乙醇，加入2 滴1 g/100 mL剛果紅，混勻[31-34]。加入25 mL乙醚，塞上塞子按100 次/min振搖1 min。再加入25 mL石油醚，塞上塞子按100 次/min振搖30 s[35-37]。500～600 r/min離心5 min，使醚層、水層分開。傾出上清液于250 mL圓底燒瓶中，為第1次提取。第2次提取加入的試劑為5 mL乙醇、15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，離心分層后傾出上清液與第1次上清液合并。第3次提取不加入乙醇，加入15 mL乙醚、15 mL石油醚，操作同前，離心分層后傾出上清液與前2 次上清液合并。

1.3.1.3 樣液濃縮

把裝有合并醚液的圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，（60±2）℃通入氮氣旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至近干，用正己烷（或正庚烷）溶解殘留物并定容至10 mL，渦旋振蕩器混勻，0.45 μm有機針式濾器過濾即為待測液。

1.3.2 儀器工作條件

CP-TAP色譜柱（25 m×0.25 mm，0.10 μm）[38]；進樣器溫度330 ℃，分流進樣，分流比1∶10，進樣體積1.0 μL；氫火焰離子化檢測器溫度360 ℃，載氣：氮氣；尾吹流量（氮氣）25 mL/min；程序升溫：初始溫度250 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升至280 ℃，以10 ℃/min的速率升至340 ℃，保持1 min，以1 ℃/min的速率升至350 ℃，保持20 min。

1.3.3 結(jié)果計算

按照下式計算樣品中OPL含量。

式中：A樣為樣品中OPL峰面積；A標為OPL標樣峰面積；ρ標為配制的OPL標樣質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為定容體積/mL；m為待測樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對所涉及到的數(shù)據(jù)和圖譜進行處理和繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理條件優(yōu)化

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》方法進行樣品制備，堿水解是利用氨水破壞蛋白質(zhì)、纖維素及結(jié)合態(tài)脂類，使脂肪游離；將游離的脂肪進行濃縮，考察濃縮后是否及時定容對檢測結(jié)果回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）的影響。由表1可知，濃縮后及時定容，樣品回收率、重復(fù)性實驗結(jié)果均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，如果樣品濃縮后放置一段時間再定容，樣品回收率和穩(wěn)定性就會受到影響。

表 1 立即定容和放置20 min后定容的回收率和RSDTable 1 Recoveries and RSD obtained by making up the samples to a constant volume immediately and after 20 min of storage

2.2 色譜柱選擇

選用Restek Rtx-65TG色譜柱（30 m×0.25 mm，0.10 μm）與Agilent CP-TAP CB色譜柱（25 m×0.25 mm，0.1 0 μ m）進行實驗，根據(jù)《中國藥典》要求，分離度需大于1.5。通過比較，Restek Rtx-65 TG色譜柱分離度達不到要求；Agilent CP-TAP CB色譜柱分離度如圖1所示，實現(xiàn)了完全分離。因此選用Agilent CPTAP CB毛細管色譜柱。

圖 1 乳粉樣品中OPL色譜圖Fig. 1 Chromatogram of OPL in milk powder samples

2.3 程序升溫條件選擇

選擇好色譜柱后，程序升溫條件的確立是根據(jù)《中國藥典》要求，需要實現(xiàn)樣品與雜峰的分離度大于1.5，首先設(shè)定的升溫程序為：初始溫度175 ℃；175～300 ℃，升溫速率50 ℃/min，保持0.5 min；300～350 ℃，升溫速率7 ℃/min，保持25 min。這一程序升溫不能實現(xiàn)OPL與雜峰分離度大于1.5。通過提高初始溫度，降低升溫速率，實現(xiàn)了目標峰與雜峰的分離度大于1.5。優(yōu)化后的升溫程序為：初始溫度250 ℃，保持1 min，250～280 ℃，升溫速率20 ℃/min；280～340 ℃，升溫速率10 ℃/min，保持1 min；340～350 ℃，升溫速率1 ℃/min，保持20 min。

2.4 標準溶液及乳粉樣品色譜圖

確定最佳的樣品處理條件、色譜柱及程序升溫條件后，得到標準溶液和乳粉樣品溶液的色譜圖如圖2所示。

圖 2 1 100 μg/mL標準溶液（A）及乳粉樣品（B）色譜圖Fig. 2 Chromatograms of 1 100 μg/mL standard solution (A) and milk powder samples (B)

2.5 方法重復(fù)性

分別對不同OPL含量的乳粉進行6 次平行實驗，得到6 個測定值和RSD。根據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，被測組分含量為1 g/100 g時，RSD≤2.7%；10 g/100 g時，RSD≤2.0%。由表2可知，OPL含量為1.12、3.67、5.45 g/100 g時，RSD分別為1.289%、1.987%、1.998%，均＜2.0%，重復(fù)性實驗符合要求。

表 2 乳粉OPL含量測定結(jié)果（n=6）Table 2 Results of determination of OPL in milk powder samples (n = 6)

2.6 方法準確度

根據(jù)GB/T 27417—2017的要求，被測組分含量＞100 mg/kg，加標回收率為95%～105%。由表3可知，不同乳粉樣品中OPL的加標回收率為95.2%～101.9%，準確度符合要求。

表 3 加標回收率實驗結(jié)果Table 3 Recovery of OPL from spiked samples

2.7 檢出限和定量限

由 表4 可 知， 乳 粉1 樣 品 稀 釋5 倍（ 稀 釋后測定結(jié)果為0.2 g/1 0 0 g 左右）重復(fù)測定6 次結(jié)果為均能檢出，信噪比為5.2 ～5.5，根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》大于檢出限信噪比為3的規(guī)定，滿足檢出限要求；乳粉1樣品測定結(jié)果為1.120 g/100 g，信噪比為13.4、14.2、13.6、13.8、13.9、14.0，大于定量限信噪比為10的規(guī)定，滿足定量限要求。

表 4 定量限、檢出限測定結(jié)果（n=6）Table 4 Determination results of LOQ and LOD (n=6)

2.8 盲樣結(jié)果

由表5可知，8 種乳粉中OPL含量不同，部分乳粉中OPL含量低于檢出限，說明不同乳粉產(chǎn)品OPL的添加量不同。

3 結(jié) 論

采用隨機抽取的乳粉樣品進行實驗條件優(yōu)化，確定最佳實驗條件為乙醚和石油醚提取乳粉樣品中的油脂，通過CP-TAP CB氣相色譜柱分離，以氫火焰離子化檢測器檢測，外標法定量。結(jié)果表明，乳粉中OPL的添加量為1～6 g/100 g時，加標回收率為95.2%～101.9%，RSD為1.289%～1.998%，此方法具有較好的準確性、重復(fù)性、分離度和精密度，同時能夠有效分離乳粉中的C52甘油三酯，提供了一種能準確測定乳粉中OPL的方法，對于嬰幼兒配方乳粉添加OPL這一物質(zhì)的檢測有重要參考意義，使這些嬰幼兒能獲得與母乳相似的營養(yǎng)[39]。