黃彥臻 王何欣 吳超男 包立軍 蘇 超 錢(qián)永華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所，陜西楊凌 712100)

桑椹在成熟的過(guò)程中易患菌核病，導(dǎo)致其品質(zhì)與產(chǎn)量下降。桑椹菌核病是一種土壤傳播的真菌病，在全國(guó)果桑種植基地均有不同程度發(fā)生，是影響桑果產(chǎn)量的第一大病害，其連年爆發(fā)，發(fā)病病勢(shì)猛、感染速度快且擴(kuò)散范圍大，對(duì)果桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成非常大的危害[1]。目前，桑椹菌核病的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主，使用最多的殺菌劑有多菌靈、甲基托布津等[2]。由于化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，病原菌抗性逐漸增強(qiáng)，藥效降低，桑椹農(nóng)藥殘留增加[3]，環(huán)境污染加重。因此，利用生物防治桑椹菌核病越來(lái)越受到人們的重視[4]。

植物精油作為從植物中提取的天然有效物質(zhì)，許多種植物精油的優(yōu)異的抗菌能力已被證實(shí)。因其高效、低毒、環(huán)境友好等特點(diǎn)，將其作為植物源殺菌劑已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)[5]。植物精油作為一種新型的植物源殺菌劑，相較于傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑，其對(duì)人類(lèi)和環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)更小，符合人們對(duì)綠色防控的需求，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香提取物和丁香酚能夠有效抑制桑椹菌核病病原生長(zhǎng)[6-7]，本文擬對(duì)八角茴香精油和丁香精油的抑菌效果進(jìn)行研究，考察其聯(lián)合抗菌作用，并進(jìn)一步對(duì)其制劑進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，以期為桑椹菌核病生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

桑實(shí)杯盤(pán)菌(Ciboriashiraiana)，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏編號(hào)CCTCC AF 2014019。

1.1.2 供試藥劑

八角茴香油、丁香油(上海源葉生物有限公司)；8%八角微乳、8%丁香微乳、6%丁香八角混合微乳(即8%八角ME、8%丁香ME、6%丁·八ME，西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所提供)；Tween-80(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；PDA培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；70%可濕性甲基托布津粉劑(山西上格之路生物科學(xué)有限公司)；50%多菌靈可濕性粉劑(四川潤(rùn)爾科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精油抑菌活性測(cè)定

供試樣品溶液的配置：丁香油、八角茴香油分別用1% Tween-80蒸餾水溶液溶解，采用二倍連續(xù)稀釋法配成不同質(zhì)量濃度的藥液。

試驗(yàn)方法：吸取2 mL藥液，加入經(jīng)滅菌處理并冷卻至50 °C左右的18 mL培養(yǎng)基中，立即混勻并倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。用6 mm打孔器在菌落邊緣菌絲生長(zhǎng)茂盛處打孔，接種至加藥的PDA平板中央,于28 °C培養(yǎng)72～96 h。觀察抑菌情況,并采取十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。以1% Tween-80蒸餾水溶液作為空白對(duì)照，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

最小抑菌濃度(MIC)定義為完全沒(méi)有菌體生長(zhǎng)的植物精油濃度。

1.2.2 精油復(fù)配的抑菌性能測(cè)定

以?xún)煞N抑菌劑的MIC值為基礎(chǔ)，配制一系列濃度的抑菌劑，即1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC，并將藥液進(jìn)行兩兩聯(lián)合。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)得復(fù)配液的MIC值。以分級(jí)濃度抑制指數(shù)(fractional inhibitory concentration, FIC)作為判斷依據(jù)。

FIC=MICA(聯(lián)合)/MICA(單用)+MICB(聯(lián)合)/MICB(單用)

FIC的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)FIC ≤ 0.5時(shí)，兩種藥物之間起協(xié)同作用；當(dāng)0.5< FIC ≤ 1.0，兩種藥物之間起相加作用；當(dāng)1.0< FIC < 4.0，兩種藥物之間無(wú)相關(guān)作用；FIC ≥4.0時(shí)，兩種藥物起拮抗作用。通過(guò)FIC的判定標(biāo)準(zhǔn)，采用相加后FIC值最小的試驗(yàn)藥物組合來(lái)計(jì)算藥物的最佳復(fù)配比。

1.2.3 不同藥物防治桑椹菌核病的田間試驗(yàn)分析

試驗(yàn)地：西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)示范站，無(wú)核大十果桑品種，樹(shù)齡7 a，每667 m2栽植270株。

藥物設(shè)置：8%八角ME、8%丁香油ME、6%丁·八ME共3個(gè)植物源殺菌劑處理區(qū)，以實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考分設(shè)3種濃度，設(shè)70%甲基托布津WP(粉劑)+50%多菌靈WP(粉劑)1 000倍液1個(gè)常規(guī)農(nóng)藥處理區(qū)，共10個(gè)處理區(qū)和1個(gè)清水對(duì)照(CK)區(qū)；每個(gè)小區(qū)5株桑樹(shù)，對(duì)桑樹(shù)常規(guī)噴藥，以葉面滴水為度，在桑椹收獲前30 d停止用藥。

噴藥時(shí)間與次數(shù)：于4月1日(萌芽期)、4月8日(初花期)、4月18日(盛花期)各噴藥1次，共用藥3次。

發(fā)病率調(diào)查：在桑植成熟期進(jìn)行發(fā)病率調(diào)查，每處理桑樹(shù)按東、南、西、北、上五個(gè)方位取5枝桑條進(jìn)行調(diào)查，共25個(gè)枝條。調(diào)查其病果數(shù)，計(jì)算發(fā)病率及防治效果。

發(fā)病率=病果粒數(shù)/總果粒數(shù)×100%

校正防效=[(對(duì)照區(qū)發(fā)病率-藥劑處理區(qū)發(fā)病率)/對(duì)照區(qū)發(fā)病率]×100%

采用最小顯著差異法(LSD)對(duì)各處理區(qū)的最終發(fā)病率進(jìn)行方差分析。

1.2.4 農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)方法

在桑椹旺盛成熟期間，從常規(guī)農(nóng)藥處理區(qū)的每株桑樹(shù)上隨機(jī)選擇1個(gè)枝條，采摘成熟桑果收集保存。對(duì)其進(jìn)行農(nóng)藥殘留量檢驗(yàn)，50%多菌靈和70%甲基托布津成分按照 GB/T 20769- 2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》方法檢驗(yàn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 23軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析與多重比較。所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角茴香油和丁香油對(duì)桑實(shí)杯盤(pán)菌的抑制效果

由表1可知，八角茴香油與丁香油均表現(xiàn)出良好的對(duì)核盤(pán)菌的抑制效果，并隨著濃度的增大抑制率逐漸增強(qiáng)。在同一試驗(yàn)條件下，相同濃度的八角茴香油效果優(yōu)于丁香油。最小抑菌濃度(MIC)是指抗菌藥物能夠完全抑制菌體生長(zhǎng)的最低濃度。當(dāng)用質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的八角茴香油處理時(shí)，抑制率達(dá)到了100%，即八角茴香油的對(duì)核盤(pán)菌的MIC值為0.25 mg/mL。當(dāng)丁香油質(zhì)量濃度增大到0.5 mg/mL時(shí)，其抑菌率為100%，即丁香油對(duì)核盤(pán)菌的MIC值為0.5 mg/mL。

表1 不同濃度八角茴香油和丁香油對(duì)桑實(shí)杯盤(pán)菌的抑菌率

2.2 精油復(fù)配的抑菌性能測(cè)定

將八角茴香油與丁香油的供試濃度兩兩組合復(fù)配，抑制效果見(jiàn)表2。MICA和MICB分別表示八角茴香油和丁香油對(duì)桑實(shí)杯盤(pán)菌的MIC值，結(jié)合兩者各自的最小抑菌濃度計(jì)算FIC值。由表可知，丁香油和八角茴香油復(fù)配后對(duì)核盤(pán)菌的最小抑菌濃度為1/2 MICB∶1/2 MICA，質(zhì)量比為2∶1，聯(lián)合使用后對(duì)核盤(pán)菌的抑菌效果為相加作用(FIC=1)。

表2 八角茴香油和丁香油復(fù)配物對(duì)桑實(shí)杯盤(pán)菌的抑制效果

2.3 田間藥效試驗(yàn)

從表3可以看出，所有處理組均出現(xiàn)了發(fā)病現(xiàn)象，說(shuō)明菌核病對(duì)桑椹危害十分普遍；同一生物制劑不同處理對(duì)桑椹菌核病的防效存在差異，濃度越大，防效越好。單一精油微乳處理組中，8%丁香微乳200倍液防治效果最差，矯正防效只有48.83%，八角微乳劑防治效果明顯優(yōu)于丁香微乳劑。混合微乳劑的效果因?yàn)闈舛鹊脑?，矯正防效最高，達(dá)85.38%，但在相同使用倍數(shù)下，與八角微乳無(wú)顯著性差異。

表3 不同藥劑組合對(duì)桑椹菌核病的防治效果

2.4 農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)

桑椹成熟期(藥后40 d)，采摘成熟桑果檢驗(yàn)常規(guī)農(nóng)藥處理區(qū)內(nèi)農(nóng)藥成分的殘留量，并將檢驗(yàn)結(jié)果與國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥最大殘留限量[8]進(jìn)行比對(duì) (參照水果農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn))。結(jié)果顯示，50%多菌靈殘留量2.19 mg/kg，比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.5 mg/kg超標(biāo)4.38倍。70%甲基托布津殘留量0.12 mg/kg，其殘留量應(yīng)綜合考慮其降解產(chǎn)物多菌靈的殘留[9]，所以遠(yuǎn)大于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.5 mg/kg。

3 小結(jié)與討論

本文探究了植物精油——八角茴香油和丁香油對(duì)桑椹菌核病病原菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)兩種精油均有很強(qiáng)的抑菌能力，其最小抑菌濃度八角茴香油為0.25 mg/mL，丁香油為0.5 mg/mL。當(dāng)丁香油和八角茴香油以2∶1的質(zhì)量比復(fù)配時(shí)，對(duì)桑實(shí)杯盤(pán)菌的抑制表現(xiàn)出相加作用。

以實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果為參考，兩種植物精油為原料制成的植物源殺菌劑在田間防效試驗(yàn)中也取得了良好的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，8%八角ME 100倍液和6%丁·八ME 100倍液對(duì)菌核病的防治效果明顯高于70%甲基托布津WP+50%多菌靈WP 1 000倍液，對(duì)菌核病具有良好的防治效果。農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)結(jié)果表明，此區(qū)域常用農(nóng)藥50%多菌靈和70%甲基托布津的殘留量(參考水果農(nóng)藥最大殘留限量)高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。雖然目前還沒(méi)有桑椹相關(guān)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)且未見(jiàn)列入農(nóng)業(yè)監(jiān)管檢測(cè)對(duì)象，考慮到生產(chǎn)中存在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，篩選新型的防治藥劑十分必要。