許丹菡，張捷，叢山日，張名，馮昌增，黃小琴，孫浩，楊昭慶，馬紹輝

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明 650118

手足口?。╤and，food and mouth disease，HFMD）是一種常見的病毒性兒童疾病。腸道病毒A 組71 型（enterovirus A71，EV-A71）和柯薩奇病毒A 組16 型（Coxsackie virus A16，CV-A16）是其主要的病原體。但近年來，柯薩奇病毒A 組10 型（CV-A10）已逐漸演變?yōu)镠FMD 的主要病原體之一［1-13］。目前尚無針對HFMD 病原體的特異性藥物，上市的EV-A71 疫苗對CV-A10 感染無交叉保護作用［11，14-15］。

CV-A10 屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬A群腸道病毒（enterovirus A，EV-A），其基因組為單股正鏈RNA，全長約7 500 nt。病毒編碼的RNA 依賴的RNA 聚合酶缺乏校正功能，因此RNA 病毒復制具有突變率高的特性［16］。此外，對EV-A-D 基因組的分析顯示，CV-A10 不如EV-A71、CV-A16、CV-A6基因穩(wěn)定，重組頻率更高［17］。《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定疫苗生產需建立種子批系統(tǒng)，力求生產使用的毒種能保持良好的遺傳穩(wěn)定性。人胚肺二倍體細胞（KMB17）是中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所自主開發(fā)建立的人源性細胞株，已經成功應用于多種上市疫苗的生產［18］。目前，針對KMB17 細胞CVA10 適應株的報道較少，相關研究不夠深入。本研究對KMB17 細胞適應株K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017連續(xù)傳代培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性進行分析，為CV-A10 疫苗的研發(fā)奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞及病毒 KMB17 細胞、人橫紋肌肉瘤細胞（RD）及CV-A10 病毒株V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017［19］均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所遺傳室保存，毒株V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 為非洲綠猴腎細胞（Vero）的第23 代適應株。

1.2主要試劑 Axygen Body Fluid Viral DNA ／ RNA Miniprep Kit 試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3KMB17 細胞適應株的連續(xù)傳代培養(yǎng) 將V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 病毒液以1 MOI 感染KMB17細胞，至80%細胞出現病變效應（cytopathic effect，CPE）后，收獲病毒液，反復凍融3 次，4 ℃，5 000 ×g離心30 min，取上清標記為新一代病毒，于-20 ℃儲存。將病毒株第1 次接種KMB17 細胞后收獲的病毒液記為第1 代，連續(xù)傳至第15 代。檢測各代次病毒滴度。

1.4病毒血清型鑒定 用Axygen Body Fluid Viral DNA ／ RNA Miniprep Kit 試劑盒提取病毒RNA，用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒并選擇腸道病毒通用引物224 和222（引物序列見表1）對病毒的部分VP1 序列進行RT-PCR 擴增。反應體系：2×1 Step buffer 10 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8 μL，上下游引物各1 μL，RNA 模板3 μL，無酶水4.2 μL。反應條件：50 ℃逆轉錄30 min；94 ℃預變性2 min；94 ℃變性0.5 min，52 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保溫10 min。陽性結果送北京擎科生物技術有限公司（昆明）測序，利用NCBI BLAST 比對測序結果，鑒定病毒血清型。

1.5病毒滴度檢測 將病毒液10 倍梯度稀釋（10-1～10-10），接種至96 孔微量培養(yǎng)板，100 μL ／ 孔，每個稀釋度重復8 孔；將生長狀態(tài)良好的RD 細胞消化為（1 ～2）× 105個／ mL 的細胞懸液，加至96 孔微量培養(yǎng)板，100 μL ／ 孔，設2 個縱排為正常細胞對照，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；逐日觀察并記錄。孔中出現50% CPE 判定為陽性，7 d 后對結果進行最終統(tǒng)計。按照Reed Muench 法計算細胞培養(yǎng)半數感染量（cell culture infective dose 50%，CCID50）。

1.6各代次病毒全基因組測序及分析 取KMB17細胞適應前和適應后第5、10、15 代次的病毒液，提取RNA。根據文獻［10］，利用Primer primer 5.0 軟件設計引物（表1），引物由北京擎科生物技術有限公司（昆明）合成。使用引物EV1F 和CVA10-3R 以及CVA10-2F 和CVA10-8R 分段RT-PCR 擴增（反應體系和反應條件同1.4 項）CV-A10 全基因組序列。采用DNAStar Lasergene 7.1.0 軟件拼接序列，Geneious 9.1.4 軟件比對各代次全基因組序列以及核苷酸和氨基酸序列，Mega 7.0 軟件進行系統(tǒng)進化分析。進化分析采用neighbor-joining 算法（參數：Test of Phylogeny 為Bootstrap method，No.of Bootstrap Replications 為1 000，Mode 為Kimura 2-parameter model），顯示bootstrap 值大于70%。參考BIAN等［17］的分型方式，根據VP1 段核苷酸差異＞15%對CV-A10 毒株進行基因分型。

表1 全基因擴增及測序引物Tab.1 Primers of amplification and sequencing of complete genome

續(xù)表1 全基因擴增及測序引物Tab.1（Continued）Primers of amplification and sequencing of complete genome

2 結 果

2.1病毒在KMB17 細胞上的傳代適應性 V6-19 ／XY ／ CHN ／ 2017 毒株在KMB17 細胞上適應性較好，第1 次適應性培養(yǎng)即出現CPE，見圖1。提取病毒培養(yǎng)液RNA 進行RT-PCR 擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見756 bp 的目的條帶，大小與預期相符，見圖2。經測序、NCBI BLAST 比對為CV-A10，命名該KMB17 細胞適應株為K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017。將該毒株在KMB17 上連續(xù)傳至15 代，V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株與適應后第5、10、15 代毒株的滴度分別為7.62、7.50、7.25 和7.75 lgCCID50／ mL。

圖1 K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 毒株在KMB17 細胞上的適應性（× 100）Fig.1 Adaptation of K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 strain to KMB17 cells（× 100）

圖2 K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株部分VP1 基因RT-PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of RT-PCR product of partial VP1 gene of K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 strain

2.2病毒基因組序列分析 V6-19 ／ XY ／ CHN ／2017 株及KMB17 細胞適應株K6-19 ／ XY ／ CHN ／2017 第5、10、15 代分段擴增、測序和拼接后得到各代次毒株全基因組序列（不包含部分5'UTR 和3'UTR），長度分別為7 318、7 301、7 311 和7 310 nt?；蛐蛄袃Υ嬖贕enBank 數據庫，基因登錄號為MT828546 ~ MT828549。CVA10 毒株的核酸編碼區(qū)全長6 582 nt，編碼1 個含2 193 個氨基酸的多聚蛋白。各代次毒株間全基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.99% ～100.00%和99.95% ～100.00%。見表2。

表2 K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株適應前后各代次全基因組核苷酸和氨基酸序列同源性比較（%）Tab.2 Homologies of nucleotide and amino acid sequences of strain K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 of various passages before and after adaption（%）

2.3系統(tǒng)進化分析 對K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株適應前和適應后第5、10、15 代毒株以及GenBank中獲得的61 株CV-A10 代表株的完整的VP1 序列（894 bp）進行系統(tǒng)進化分析，CV-A10 可分為7 個基因型（A、B、C、D、E 和F 型）。最早分離出的CV-A10原型株Kowalik 單獨構成A 型；B 型由印度2013 年的分離株構成；C 型由法國、俄羅斯、西班牙和印度等國家流行的分離株構成；D 型由中國大陸和中國臺灣地區(qū)2010 年前流行的分離株構成；E 型由非洲大陸的2 個CV-A10 分離株構成；F 型由越南、西班牙和中國26 個省份于2009 — 2017 年分離出的毒株構成。K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株與大部分中國大陸近年流行的分離株同屬F 型。見圖3。

圖3 基于全長VP1 序列（894 bp）的CV-A10 系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CV-A10 based on full-length VP1 nucleotide sequence（894 bp）

2.4病毒核苷酸與氨基酸序列變異分析 該毒株各代次核苷酸序列比對結果顯示，適應前與適應后第5、10 代毒株全基因組（不包含部分5'UTR 和3'UTR）均無堿基突變，編碼區(qū)均無氨基酸突變。僅適應后第15 代毒株在核苷酸序列VP4 區(qū)域的第172 位發(fā)生1 個堿基替換，由A 突變成G，導致1 個氨基酸由異亮氨酸（Ile）突變成纈氨酸（Val），氨基酸突變位點位于VP4 氨基酸序列第58 位。

3 討 論

CV-A10 病毒顆粒的結構呈二十面體對稱球形，直徑約為30 nm。病毒衣殼由4 種結構蛋白（VP1 ~4）組成，VP1、VP2 和VP3 暴露在病毒表面，由69 個氨基酸組成的較小的VP4 則位于病毒內部［20］。有研究表明，VP4 N-末端豆蔻?；盘栁稽c（MGXXXS）是腸道病毒極為保守的特征［21］。在生理溫度條件下，VP4 蛋白N-末端氨基酸殘基能發(fā)生可逆性變構，暴露中和表位［22-23］。對EV-A71 嵌合病毒樣顆粒的研究表明，VP4 中和表位由N-末端前20 個氨基酸構成［22，24］。本研究中，適應后第15 代毒株突變的氨基酸位于VP4 氨基酸序列第58 位（Ile→Val），未發(fā)生在可能影響EV-A71 中和表位的同源位置，也未發(fā)生在腸道病毒N-末端豆蔻酰化信號位點，但該氨基酸位點的替換是否會對毒株的免疫原性和衣殼穩(wěn)定性造成影響有待進一步研究。

與VP1、VP2、VP3 基因相比，EV-A71 VP4 基因保守性更強［22］，但與本研究中對該CV-A10 毒株的各代次基因組分析結果不相符。在前期Vero 細胞適應株的遺傳穩(wěn)定性研究中，該毒株從RD 細胞適應至Vero 細胞后發(fā)生了4 個VP1 區(qū)域和1 個VP4區(qū)域的氨基酸突變，其VP4 區(qū)域突變的位置同樣位于VP4 氨基酸序列第58 位，編碼該氨基酸的堿基突變位點也同樣位于VP4 核苷酸序列第172 位［19］。提示該位點極易突變，但其突變原因有待進一步研究。其他相關研究顯示，VP1 較其他區(qū)域更頻繁出現位點突變［25］。此外，K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株在從Vero 細胞適應至KMB17 細胞后，病毒的核苷酸和氨基酸序列未發(fā)生變化，表明CV-A10 對Vero和KMB17 細胞的感染可能存在相似的機制。

V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株可在KMB17 細胞中適應，連續(xù)傳代培養(yǎng)后，4 個代次的病毒滴度維持在7.25 ～7.75 lgCCID50／ mL，差異在0.5 lgCCID50／ mL之內。雖然與該毒株在Vero 細胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)時的滴度（7.85 ～8.17 lgCCID50／ mL）［19］相比有所下降，但仍能滿足《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定的毒種檢定中對病毒滴度的要求，即不低于6.5 lgCCID50／ mL。本實驗中病毒較高的滴度水平也反應出KMB17 細胞有良好的病毒敏感性。

人源性細胞基質是一種無外源基因引入、無外源因子污染且細胞性狀比較穩(wěn)定的病毒性疫苗細胞基質，可使疫苗生產的純化工藝較動物源性細胞基質更加簡化，在節(jié)約生產成本的同時提高疫苗安全性，因此成為疫苗生產廠家的首選［16］。比較前期Vero 細胞適應株的遺傳穩(wěn)定性研究結果［19］，本研究中堿基的突變從8 個位點減少至1 個，氨基酸的替換從5 個位點減少至1 個，表明CV-A10 毒株在KMB17細胞中的遺傳穩(wěn)定性優(yōu)于Vero 細胞。

綜合安全性和毒株適應后遺傳穩(wěn)定性研究結果，KMB17 細胞具有良好的病毒敏感性，K6-19 ／XY ／ CHN ／ 2017 株在KMB17 細胞上連續(xù)傳代后保持了較高的病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性，KMB17 細胞可能比Vero 細胞更加適于作為CV-A10 疫苗的生產基質。為后續(xù)疫苗的研發(fā)奠定了實驗基礎。