李 靜，王 書，張 穎

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(合肥市第一人民醫(yī)院) 老年醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230000)

0 引言

肺炎鏈球菌是一種人類共生細菌和主要的機會性呼吸道病原體，它不僅會導(dǎo)致嚴重的侵襲性疾病，甚至每年在全世界造成數(shù)百萬人死亡[1]。鼻咽分泌物的吸入可使肺炎鏈球菌在肺實質(zhì)中侵襲和傳播，從而導(dǎo)致肺部感染[2]。肺炎球菌肺炎的高發(fā)病率和高死亡率給個人和社會帶來了沉重的醫(yī)療負擔(dān)[3]。因此，探究機體對肺炎鏈球菌感染的反應(yīng)機制對防治肺炎鏈球菌感染至關(guān)重要。近年來，運用生物信息學(xué)方法在分子水平上進行數(shù)據(jù)挖掘，為研究各種疾病的分子機制提供了新的思路。本研究通過對肺炎鏈球菌感染小鼠的肺關(guān)鍵基因的分析及鑒定，以期了解機體抵制肺炎鏈球菌感染背后的分子機制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和處理

GSE83612數(shù)據(jù)集來自GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，共納入4例肺炎鏈球菌(SP)感染小鼠和4例磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)對照的小鼠基因表達信息，其檢測平臺為GPL6887。對從 GEO 數(shù)據(jù)庫下載的探針表達矩陣文件進行歸一化和log2轉(zhuǎn)換，將平臺注釋文件與每個探針表達矩陣進行匹配，并保留注釋良好的探針。對于對應(yīng)一個基因的多個探針，取平均表達值用于進一步分析。

1.2 DEG 的鑒定

基于對照(HC)樣本和SP樣本表達值的比較，通過RStudio軟件(版本：1.3.1056)的limma包[4]篩選出差異表達基因(DEGs)。DEG 的篩選標準如下：log2 倍數(shù)變化 (FC) 應(yīng)大于 2 或小于-2，調(diào)整后P<0.05。

1.3 功能富集分析

應(yīng)用colorspace，stringi，colorspace包對差異表達基因進行 GO (Gene Ontology)分析和 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，P<0.05且Q<0.05為篩選條件。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析

為了探索不同基因編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，將DEGs導(dǎo)入STRING網(wǎng)站(https://www.string-db.org/)進行進一步分析。最低交互分數(shù)應(yīng)大于 0.9，并刪除網(wǎng)絡(luò)中的孤立節(jié)點。接下來，將分析結(jié)果輸出一個TSV格式的文件中，并使用Cytoscape軟件(版本：3.8.2)進行細節(jié)處理和模塊分析。MCODE是從 Cytoscape App Store下載的插件，可以根據(jù)拓撲結(jié)構(gòu)在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中找到緊密相連的節(jié)點。因此，應(yīng)用此插件，以degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2和max.depth=100為標準[5]，來檢測PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵模塊，并應(yīng)用Cytohubba插件，按degree算法計算出評分位于前10位的樞紐基因。

2 結(jié)果

2.1 DEG 的鑒定

通過使用limma包分析整合數(shù)據(jù)集的差異表達，獲得了325個DEG由281個上調(diào)基因和44個下調(diào)基因組成(表1列出部分)，以及按調(diào)整后的P值排序的前 20 個基因的表達(見表2)。

表1 部分差異表達基因

表2 按調(diào)整后的P值排序的前20個基因的表達

2.2 GO 和 KEGG 富集分析

Cluster Profiler包進行的富集分析揭示了與DEG相關(guān)的生物學(xué)功能和途徑。如表3所示，DEG的GO注釋由3部分(BP，CC，MF)組成(每部分列出前10項)。發(fā)現(xiàn)主要細胞成分(CC)位于血漿脂蛋白粒子、液泡、溶酶體等；主要分子功能(MF)與細胞因子活性、趨化因子活性、G蛋白偶聯(lián)受體等相關(guān)；主要涉及白細胞及各種粒細胞遷移、γ-干擾素反應(yīng)等生物過程。KEGG分析的前10條路徑(見表4)表明DEGs參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，如腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和IL-17信號通路等。

表3 差異表達基因的GO富集分析結(jié)果(列出了每個類別的前10項)

表3(續(xù))

表4 差異表達基因的KEGG富集分析結(jié)果(列出前10項)

2.3 PPI2.3網(wǎng)絡(luò)搭建與MCODE插件分析

STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)Cytoscape調(diào)整可視化。為了找出復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的核心模塊，進行了MCODE插件分析，確定了得分最高的2個重要模塊(其一：Ccl4，Il1b，Il1a，Csf2，Ccl7，Tnf，Cxcl13，Cxcr3，Cxcl1，Il6，Cxcl10。其二：Ifi44，Oas2，Rsad2，Isg15，MX1，Oasl1，Oasl2，Rtp4，Usp18)，得分均為5分，顯示主要與趨化因子及干擾素反應(yīng)相關(guān)。運用cytoHubba插件，利用MCC法篩選出排名前10的樞紐基因依次為Irf7，Ifit1，Rsad2，Usp18，Oas12，Mx1，Ifi44，Cxcl10，Il1b，Isg15。

3 討論

肺炎球菌感染可導(dǎo)致人類高死亡率和發(fā)病率[6]。作為鼻咽共生菌群的一部分，肺炎球菌如何從共生狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏顟B(tài)所涉及的宿主反應(yīng)目前尚不清楚。確定宿主感染肺炎鏈球菌后機體的反應(yīng)機制，有利于開發(fā)宿主導(dǎo)向的療法和篩選測試，進行個體化的治療。本研究旨在通過生物信息學(xué)分析來識別肺炎球菌感染的生物標志物并揭示其生物學(xué)功能，為制定相關(guān)的防治靶點提供思路。

在分析中，篩選出281個上調(diào)和44個下調(diào)的 DEG，肺炎鏈球菌感染和對照樣本之間的變化至少為 4 倍。按調(diào)整后的P值排序的前 50 個基因的表達顯示Igsf6，Ccd33，Il1b等基因在肺炎鏈球菌感染的肺轉(zhuǎn)錄組中顯著高表達，表明這些基因可能參與肺炎球菌感染的發(fā)生發(fā)展。接下來，通過功能富集分析對DEGs進行注釋，觀察可知這些基因與細胞反應(yīng)和炎癥信號密切相關(guān)，例如各種炎性細胞遷移、趨化因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路和IL-17 信號通路。使用STRING網(wǎng)站和Cytoscape軟件建立DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)。在MCODE插件的幫助下，篩選出最重要的子網(wǎng)絡(luò)，主要集中在調(diào)控干擾素及趨化因子的基因上，類似地，最后應(yīng)用cytoHubba篩選出的前10位樞紐基因，也主要與這兩種基因有關(guān)。

在樞紐基因及顯著模塊中，干擾素相關(guān)基因的表達顯著上調(diào)。據(jù)報道，I型干擾素(IFN-I)通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達可降低上皮細胞通透性和抑制細菌遷移[7]，防止肺炎鏈球菌局部肺部感染發(fā)展為侵襲性疾病[8]。研究表明，缺乏 IFN-I 受體的小鼠在肺部感染肺炎鏈球菌后顯示出菌血癥風(fēng)險的增加[7]。類似的，II型干擾素(IFN-γ)在肺炎球菌肺炎期間可以控制傳染源和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[9]，增強高親和力細胞表面分子FcγRI(CD64)和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的表達從而參與炎癥反應(yīng)[10]。然而，IFN信號過度活化或沒有及時消除也會引起免疫系統(tǒng)紊亂，有可能會引發(fā)慢性炎癥，因此需要表達免疫負調(diào)控因子準確、適時地調(diào)整胞內(nèi)信號通路的激活，從而保證機體免疫平衡。本研究中Irf7，Ifit1，Rsad2，Usp18，Oas12，Mx1，Ifi44，Isg15作為樞紐基因，協(xié)同調(diào)控干擾素在肺炎鏈球菌感染期間的作用。最顯著模塊中的基因還包括趨化因子及促炎細胞因子，如Cxcl10，Ccl4，Cxcl1，Ccl2等趨化因子顯著上調(diào)，趨化因子可與白細胞上的細胞表面受體結(jié)合，并將它們吸引到宿主感染部位[1]，通過及時和協(xié)調(diào)地招募免疫細胞，在對抗微生物感染和啟動組織修復(fù)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。發(fā)揮重要作用的促炎細胞因子包括IL-6和Tnf等，IL-6可通過促進肺修復(fù)、上皮細胞存活和減少成纖維細胞積累，在氣道細菌和病毒感染期間作為維持屏障完整性的關(guān)鍵免疫介質(zhì)[12]；腫瘤壞死因子(TNF)是免疫的中樞調(diào)節(jié)劑[13]。在實驗?zāi)Ｐ椭?，阻斷TNF-α和IL-6等細胞因子的表達或作用會削弱肺炎球菌肺炎期間的宿主防御能力，并導(dǎo)致細菌清除受損和存活率降低[14]。

綜上，筆者整合了多種生物信息學(xué)工具，確定了10個中樞基因可能作為肺炎鏈球菌感染的潛在治療靶點，在未來可通過嘗試使用化學(xué)誘導(dǎo)物(如趨化因子)將免疫細胞募集到肺部或直接調(diào)節(jié)免疫細胞功能(調(diào)節(jié)相應(yīng)細胞因子活性或信號通路的開放)等手段治療肺炎鏈球菌肺炎。