劉 靨，林志昊，丁 黎*

1 中國藥科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析系，南京 210009；2 南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司，南京210009

慢性阻塞性肺?。–OPD）是一種慢性炎癥性氣道疾病[1，2]。噻托溴銨是具有特異選擇性的抗膽堿藥物，可以治療COPD。該藥物與人體呼吸道中的M1、M2、M3 毒蕈堿受體具有相似的親和力，一次性吸人對支氣管的擴(kuò)張作用可持續(xù)24 h，可作為長效藥[3]。噻托溴銨作用于人體呼吸道，被制成粉劑通過吸入給藥，由于給藥劑量低至18 μg，故需要開發(fā)一種高靈敏度的分析方法以評價(jià)其人體藥動(dòng)學(xué)特征。目前報(bào)道的幾種血漿中噻托溴銨LC-MS/MS 檢測法中，有取400 μL 血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀后再檢測的方法，其定量下限可以達(dá)到0.5 pg·mL-1[4]；有取2 mL 血漿樣品經(jīng)固相萃取再檢測的方法，其定量下限可以達(dá)到1.5 pg·mL-1[5]；有取0.5 mL 血漿樣品經(jīng)2 步液-液萃取再采用二維UPLC-MS/MS 檢測的方法，其定量下限可以達(dá)到0.2 pg·mL-1[6]。以上幾種方法，操作繁瑣且樣品用量較大，不適合使用96 孔板進(jìn)行高通量樣品處理，且靈敏度也有一定的局限性。噻托溴銨粉吸入劑人體生物等效性研究和單次給藥藥動(dòng)學(xué)研究的給藥劑量均為18 μg，在該給藥劑量條件下，某些志愿者服藥后血漿中噻托溴銨的峰濃度不足2 pg·mL-1，根據(jù)《化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，其定量下限應(yīng)能滿足測定3～5 個(gè)消除半衰期時(shí)、樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20 時(shí)的藥物濃度，0.2 pg·mL-1的定量下限不足以滿足測定要求，故有必要將檢測的定量下限設(shè)定在0.1 pg·mL-1。本實(shí)驗(yàn)建立了采用96 孔板高通量處理噻托溴銨血漿樣品LCMS/MS 檢測血藥濃度新方法，該法定量下限可以達(dá)到0.1 pg·mL-1，并且可以應(yīng)用于噻托溴銨粉吸入劑的人體生物等效性評價(jià)及低劑量單次給藥的人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

噻托溴銨對照品（加拿大ECO Research Chemicals 公司，純度：98.9%，批號：CT-11210-08）；噻托溴銨-d6（加拿大Toronto Research Chemicals 公司，純度：98.84%，批號：28-JHY-165-1）；噻托溴銨粉吸入劑（18 μg，Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &Co.KG，批號：001643）；甲醇、乙腈為色譜純；甲酸、醋酸銨為分析純；水為超純水。

1.2 儀器

ExionLC AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple QuadTM6500+質(zhì)譜儀（Applied Biosystems/Sciex 公司）；十萬分之一電子天平（中國梅特勒托利多公司）。

1.3 液質(zhì)條件

色譜條件：ACE Excel 3 AQ 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，ACE）；流動(dòng)相A 為含0.1%甲酸和10.0 mmol·L-1醋酸銨水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇，線性梯度（A∶B）洗脫：0 min→0.4 min（75∶25）→0.5 min→3.0 min（65∶35）→3.1 min→4.6 min（0∶100）→4.7 min（75∶25）；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），裂解電壓為5000 V，氣簾氣壓力為241 kPa，霧化氣壓力為207 kPa，輔助氣壓力為241 kPa，干燥氣溫度600 ℃,檢測反應(yīng)離子對：噻托溴銨m/z392.1→152.1，噻托溴銨-d6 m/z 398.1→158.1。

1.4 溶液的配制

精密稱取噻托溴銨與噻托溴銨-d6 對照品適量，經(jīng)質(zhì)量校正后，以甲醇溶解分別得到噻托溴銨與噻托溴銨-d6 儲備液各1.00 mg·mL-1。將噻托溴銨的儲備液以50%的甲醇水溶液稀釋為一系列濃度分別為2、4、12、40、120、200、320 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以及濃度為2、5、20、100、240 pg·mL-1的質(zhì)控工作液；以50%甲醇水溶液稀釋噻托溴銨-d6 儲備液，配制成濃度為20.0 pg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制

采用空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品。取380 μL 空白血漿，加入20 μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，配成濃度分別0.1、0.2、0.6、2、6、10、16 pg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，以及濃度分別為0.1 pg·mL-1（LLOQ QC，定量下限質(zhì)控樣品）、0.25 pg·mL-1（LQC）、1 pg·mL-1（GMQC，幾何均值中濃度質(zhì)控樣品）、5 pg·mL-1（MQC，中濃度質(zhì)控樣品）、12 pg·mL-1（HQC，高濃度質(zhì)控樣品）的質(zhì)控樣品。

1.6 樣品前處理

在冰浴上，分別向兩塊96 孔板加入150 μL 樣品與25 μL 的內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋1 min，再分別加入525 μL 含1%甲酸的乙腈溶液，渦旋10 min，在室溫下4000 r·min-1離心10 min；將兩塊平行處理的96 孔板各取500 μL 上清液轉(zhuǎn)移至一塊干凈的96孔板中，于40 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈?，吹干的固體物以150 μL 超純水復(fù)溶，渦旋，離心3 min 后取20 μL 上清液進(jìn)樣檢測。

1.7 藥代動(dòng)力學(xué)研究

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)長沙市第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，臨床受理號為CYHL2000007。14 名健康志愿者經(jīng)體檢證明心、肝、腎功能正常,肺活量FEV1 實(shí)測值/FEV1 預(yù)計(jì)值＞80%，均符合志愿者入選條件。試驗(yàn)前志愿者均簽署知情同意書，試驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食。

14 名健康志愿者，在前一天晚上禁食10 h 之后，每位志愿者借助于給藥設(shè)備經(jīng)口吸入噻托溴銨粉吸入劑1 粒。于給藥前及給藥后于1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30、45 min，1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96 h 采集靜脈血4.5 mL，將之加入到預(yù)冷的含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑的真空采血管中，在4 ℃下、1700×g 離心10 min，冰浴條件下分離血漿，于-70 ℃冰箱中保存待測。

2 結(jié)果

2.1 選擇性，線性以及定量下限

空白基質(zhì)中待測物或內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間其他因素?zé)o顯著干擾。見圖1。噻托溴銨標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍0.1～16 pg·mL-1線性良好，采用加權(quán)（Y=1/X2）最小二乘法，待測物質(zhì)量濃度C（pg·mL-1）為橫坐標(biāo)X，以待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Ai）為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。通過計(jì)算，噻托溴銨的方程為：Y=1.274×102X+2.483×103，r2=0.998 3?？茖W(xué)計(jì)數(shù)法表示：Y=0.127 4X+2.483×10-3。

圖1 血漿樣品噻托溴銨與噻托溴銨-d6 的LC-MS/MS測定色譜圖

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

6 個(gè)重復(fù)的質(zhì)控樣品（LLOQ QC、LQC、GMQC、MQC 和HQC）按“1.6 樣品前處理”操作，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測濃度，在同一分析批中和連續(xù)3個(gè)分析批中評估批內(nèi)與批間的準(zhǔn)確度（以相對誤差RE 計(jì)）與精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 計(jì)）。見表1。

表1 人血漿中噻托溴銨測定的準(zhǔn)確度與精密度

2.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

考察3 個(gè)濃度水平的樣品（0.25、5、12 pg·mL-1），以經(jīng)過提取所得的待測物色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣所得的待測物色譜圖峰面積之比，來考察樣品的提取回收率，每個(gè)濃度水平樣品進(jìn)行6 樣本分析。結(jié)果所有濃度水平的血漿中噻托溴銨的提取回收率在75.6%～84.8%，精密度RSD＜6.6%。說明該方法的提取回收率良好。

6 個(gè)不同來源含穩(wěn)定劑的空白人血漿，按“1.6”項(xiàng)下方法處理后，加入不同濃度噻托溴銨標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)，作LC-MS/MS 分析，獲得峰面積與相同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣獲得峰面積、比較評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，噻托溴銨基質(zhì)效應(yīng)為100.1%～104.3%。表明該方法的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制兩個(gè)濃度質(zhì)控樣品（LQC、HQC）并將其置于不同存放條件下，考察其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表2。全血樣品在冰浴條件下2 h 穩(wěn)定；處理后的樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中5 天4 h 穩(wěn)定。

表2 噻托溴銨在不同存放條件下的血漿穩(wěn)定性的RE 值（n=3，%）

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

按血漿樣品測定方法進(jìn)行樣品處理與測定，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用Phoenix WinNonlin software（version 6.4）依賴非房室模型計(jì)算，14 名志愿者血漿中噻托溴銨的平均藥時(shí)曲線圖見圖2，其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

表3 噻托溴銨的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖2 14 例健康志愿者空腹經(jīng)口吸入噻托溴銨粉吸入劑噻托溴銨的血藥濃度均值-時(shí)間曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)為達(dá)到0.1 pg·mL-1的定量下限，向兩塊96 孔板中分別加入150 μL 樣品與25 μL 的內(nèi)標(biāo)，經(jīng)蛋白沉淀后，再將兩塊板的上清液合并至一塊96 孔板中吹干，達(dá)到富集待測物的作用，提高了靈敏度。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將兩個(gè)濃度的質(zhì)控樣品（LQC、HQC）放置室溫下18 h 后，待測物的含量與新鮮配制的質(zhì)控樣品相比，其含量降至45%（LQC）、48%（HQC），而噻托溴銨工作溶液在室溫下19 h 穩(wěn)定性良好，可排除工作溶液降解的可能。經(jīng)分析，噻托溴銨結(jié)構(gòu)中含有酯鍵，易被血漿中的酯酶水解。由于低溫可以降低酶促反應(yīng)速率[7]，故考察將質(zhì)控樣品放置于冰浴條件下待測物的降解情況，結(jié)果表明，冰浴16 h 人血漿中噻托溴銨的相對含量為98.0%（LQC）、99.1%（HQC），故實(shí)驗(yàn)在冰浴條件下操作。