劉 玲，王 紅，朱星宇，郭志花，崔永偉**

1 南京市溧水區(qū)中醫(yī)院，南京 211200；2 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，南京 211200；3 江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，淮安223003

血必凈注射液是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等5 味中藥經(jīng)提取后，輔以葡萄糖和聚山梨酯80制備而成。主要功效是化瘀解毒，用于溫?zé)犷惣膊　⒁蚋腥菊T發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征；還可配合治療多器官功能失常綜合征的臟器功能受損。然而其說明書和文獻(xiàn)中都提及血必凈注射液有皮膚潮紅、皮疹、瘙癢、呼吸困難、心悸、甚至過敏性休克等副反應(yīng)，還有心血管系統(tǒng)[1]、呼吸系統(tǒng)[2]、消化系統(tǒng)[3]等方面的不良反應(yīng)，且多發(fā)生在注射后30 分鐘內(nèi)[4]。

有研究表明，中藥注射劑危及生命的嚴(yán)重不良反應(yīng)主要是以肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺為主的過敏及類過敏反應(yīng)[5]，因此研究血必凈注射液中的功能性成分致敏的意義顯得尤為重要。現(xiàn)結(jié)合《中國(guó)藥典》及文獻(xiàn)中的有效成分和可能致敏成分，研究血必凈注射液及其含有的10 種化合物（結(jié)構(gòu)見圖1）對(duì)P815 細(xì)胞脫顆粒、氨基己糖苷酶和組胺釋放的影響，為評(píng)價(jià)該注射液的致類過敏性提供參考。

圖1 血必凈注射液中10 種化合物結(jié)構(gòu)式

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

生物倒置顯微鏡（日本Olympus IX51）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek ELx800）；超凈工作臺(tái)（中國(guó)蘇州凈化SW-CJ-1FD）；臺(tái)式恒溫振蕩器（中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司THZ-312）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：羥基紅花黃色素A（批號(hào)R17D10F106127），芍藥苷（批號(hào)L07M9Q60533），丹酚酸A（批號(hào)Z23D10X106625），丹酚酸B（批號(hào)P20J10F93457），咖啡酸（批號(hào)W16O10B100366），阿魏酸（批號(hào)L03A9D57744），洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)P16A10F85918），藁本內(nèi)酯（批號(hào)R19D10F106243），綠原酸（批號(hào)Y22M8K36544），原兒茶醛（批號(hào)TO1013FB14），以上對(duì)照品純度均≥98%，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；血必凈注射液購(gòu)自天津紅日藥業(yè)（規(guī)格：10 mL/支，批號(hào)2002211）。

12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning Incorporated 3599）；組胺ELISA檢測(cè)試劑盒（英國(guó)Abcam ab213975）。

CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)公司，KGA317）；中性紅（中國(guó) Aladdin N108712-25g）；氨基己糖（美國(guó)Sigma N9376）；生物活性化合物C48/80（美國(guó)Sigma 088M4120V）；Dulbecco's modifiedeagle medium（DEME）培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)公司KGM12800-500）；胎牛血清（FBS）（美國(guó)GIBCO 10100147）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 細(xì)胞株

P815 細(xì)胞購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

含藥培養(yǎng)基：各單體化合物用DMSO 配制成1 mol·L-1的母液，用時(shí)以培養(yǎng)基1∶1000 稀釋成工作液（1 mmol·L-1），血必凈注射液用時(shí)以培養(yǎng)基1∶10 稀釋成工作液（10%，設(shè)定其對(duì)應(yīng)濃度為1 mmol·L-1），再依據(jù)各個(gè)試驗(yàn)濃度用培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度。

氨基己糖溶液：稱取5 mg 氨基己糖溶解于1 mL的0.1mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中，配制成14mmol·L-1的氨基己糖儲(chǔ)備液。使用時(shí)，加入13 mL 的0.1 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液稀釋成1 mmol·L-1氨基己糖工作液?；靹蚝笫褂?.22 μmol·L-1微孔過濾膜除菌，1.5 mL EP 管分裝，保存于-20 ℃低溫冰箱中。

0.1mol·L-1Na2CO3/NaHCO3溶液：分別稱取0.8401 g NaHCO3及1.0599 g Na2CO3溶于超純水中，混勻后定容至100 mL。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將P815 細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入適當(dāng)?shù)?.25%胰蛋白酶，使胰酶溶液均勻鋪在細(xì)胞表面，置于恒溫培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化，用移液器將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁吹下，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基吹打混勻，按1∶2 的比例傳代。

2.3 10%抑制濃度（IC10）測(cè)定

細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，將該培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μL 相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，每組重復(fù)3 個(gè)（n=3），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，搖床輕輕混勻10 min，酶標(biāo)儀于λ=450 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度A 值，計(jì)算抑制率。

采用SPSS 軟件計(jì)算血必凈注射液及各化合物的IC10值。

2.4 對(duì)P815 細(xì)胞脫顆粒及生物活性介質(zhì)釋放的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P815 細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×104個(gè)/mL接種于12 孔板中，接種體積為1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基。試驗(yàn)組加入1 mL IC10濃度的各單體化合物及血必凈注射液，空白對(duì)照組加入1 mL 完全培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入1 mL C48/80（60 μg·mL-1）刺激，每組重復(fù)3 個(gè)（n=3），于2 h 終止反應(yīng)，收集反應(yīng)液。

2.4.1 細(xì)胞脫顆粒百分率測(cè)定 以PBS 小心沖洗2次后，每孔加入500 μL 的1 中性紅染液，輕輕拍打培養(yǎng)板側(cè)面，于37 ℃染色3 min。隨機(jī)計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，記錄其中脫顆粒細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算其百分率。

2.4.2 組胺釋放量測(cè)定 以各成分的IC10為刺激濃度，通過ELISA 法測(cè)定組胺釋放量，取上清液，按Histamine ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)上清液中組胺的釋放量。

2.4.3 氨基己糖苷酶釋放量測(cè)定 按“2.4”項(xiàng)下方法操作，收集上清液，加入0.1% Triton-100 細(xì)胞裂解液，將全部膜裂解，釋放細(xì)胞內(nèi)的氨基己糖苷酶，得到細(xì)胞裂解液。取各組離心后的細(xì)胞上清液和裂解液100 μL 加入到96 孔酶標(biāo)板中，同時(shí)再加入1 mmol·L-1氨基己糖溶液。置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)45min。反應(yīng)完畢加入150 μL 終止液（0.1 mol·L-1Na2CO3/NaHCO3）終止反應(yīng)，15min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定λ=405nm處各孔反應(yīng)液的吸光度A 值，結(jié)果減去陰性對(duì)照后，以上清液中氨基己糖苷酶釋放量與氨基己糖苷酶釋放總量之比，衡量試驗(yàn)組刺激后氨基己糖苷酶的凈釋放量。

2.5 數(shù)據(jù)處理

以SPSS 20.0 計(jì)算各濃度組分的吸光度均數(shù)，并計(jì)算每一組分的IC10。組胺、氨基己糖苷酶釋放率及脫顆粒率結(jié)果均采用單因素方差分析，對(duì)比各試驗(yàn)組與空白組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05 為顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 10%抑制濃度（IC10）測(cè)定

由表1 可知，在最大給藥濃度下（1000μmol·L-1），阿魏酸對(duì)P815 細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)到30.92%，其他各成分均低于20.0%。表明血必凈注射液及其10種化合物并不會(huì)顯著抑制P815 細(xì)胞增殖。運(yùn)用軟件計(jì)算各組的IC10值，由圖2 可知，化合物中阿魏酸的IC10值最小，為81 μmol·L-1；丹酚酸B 的IC10值最大，為847 μmol·L-1，兩者相差近10 倍。本品為含有多種組分以及各種輔料的混合溶液，其對(duì)P815 細(xì)胞的IC10值為331 μmol·L-1，與部分化合物相近。

表1 血必凈及其主要組分對(duì)P815 細(xì)胞的抑制作用（n=3）

3.2 細(xì)胞脫顆粒百分率測(cè)定

由圖3 可知，各組細(xì)胞的脫顆粒百分率與空白組相比，C48/80、綠原酸、蒿本內(nèi)酯、咖啡酸、丹酚酸B 和血必凈注射液組細(xì)胞的脫顆粒百分率存在極顯著差異（P＜0.001）；原兒茶醛（P＜0.01）、羥基紅花黃色素A 和丹酚酸A（P＜0.05）組有顯著性差異；其余各組與空白組相比，無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 本品主要組分對(duì)P815 細(xì)胞脫顆粒百分率（%）的影響（n=3）

3.3 組胺釋放量測(cè)定

由圖4 可知，各試驗(yàn)組上清液中組胺釋放量與空白組相比，除羥基紅花黃色素A 組以外，其余各成分組及血必凈注射液組均存在顯著性差異（P＜0.05），其中綠原酸、咖啡酸對(duì)組胺釋放的影響最大，組胺釋放量達(dá)6 ng·mL-1以上，高于陽性藥C48/80 組。

圖4 本品主要組分上清液中組胺釋放量（ng·mL-1）（n=3）

3.4 氨基己糖苷酶釋放量測(cè)定

由圖5 可知，空白組上清液中氨基己糖苷酶的釋放度最低，各試驗(yàn)組與空白組相比，阿魏酸、芍藥苷組與丹酚酸A 組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，原兒茶醛、蒿本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B 組和血必凈注射液組的氨基己糖苷酶釋放量顯著高于空白組（P＜0.05），而陽性藥、綠原酸、咖啡酸組與空白組相比存在極顯著性差異（P＜0.001），3 組上清液中氨基己糖苷酶的釋放度均高于50%。

圖5 本品主要組分上清液中氨基己糖苷酶釋放度（%，n=3）

4 討論

4.1 化學(xué)成分選取

選取的10 個(gè)化合物是基于血必凈注射液的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合《中國(guó)藥典》[6]中規(guī)定的相關(guān)中藥材的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道有顯著藥理活性或有潛在致敏性的化學(xué)成分。羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和丹酚酸B 是各中藥材在藥典中規(guī)定的含量測(cè)定成分，原兒茶醛、迷迭香酸、綠原酸、咖啡酸、丹酚酸A 和藁本內(nèi)酯既是血必凈注射液的成分[7]，也是藥理作用顯著的有效成分。藁本內(nèi)酯、咖啡酸、原兒茶醛和洋川芎內(nèi)酯Ⅰ[8-10]具有抗炎功效，原兒茶醛還可以促進(jìn)血管舒張[11]；綠原酸能抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫[12]；丹酚酸A 可抗心肌缺血損傷[13]。

其中咖啡酸是綠原酸的主要代謝產(chǎn)物，而綠原酸一方面有很好的藥理活性，另一方面臨床使用中含綠原酸的中藥注射劑不良反應(yīng)較多，且過敏反應(yīng)最為常見[14]。丹酚酸A 和丹酚酸B 可能與黃疸等相關(guān)不良反應(yīng)有關(guān)[15]。藁本內(nèi)酯可能通過孕烷X 受體途徑引發(fā)藥物代謝酶的誘導(dǎo)效應(yīng)，導(dǎo)致代謝性藥物相互作用的發(fā)生[16]。因此，選取10 種化合物考察其對(duì)P815 細(xì)胞脫顆粒、氨基己糖苷酶和組胺釋放的影響，為評(píng)價(jià)血必凈注射液的致類過敏性提供參考。

4.2 試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约敖o藥濃度的選取

近年來，常用于研究體外過敏的細(xì)胞模型有P815、RBL-2H3 和Ku812 細(xì)胞。有文獻(xiàn)研究表明，同RBL-2H3 相比，在相同刺激條件下，P815 細(xì)胞活化后脫顆粒時(shí)間出現(xiàn)更早、程度更高[17]；相對(duì)于RBL-2H3 和Ku812 細(xì)胞，P815 細(xì)胞更適合作為一種早期、穩(wěn)定、敏感的肥大細(xì)胞脫顆粒體外檢測(cè)模型[18]。故本試驗(yàn)選取P815 細(xì)胞作為體外過敏模型。

由于10 種化學(xué)成分理化性質(zhì)不同，對(duì)P815 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響也不盡相同，因此采用CCK-8 法測(cè)定各化合物不同濃度下對(duì)P815 細(xì)胞的抑制率，通過軟件算出各化合物相應(yīng)的10%抑制濃度作為給藥濃度。各化合物在該濃度條件下，在一定時(shí)間內(nèi)，對(duì)P815 細(xì)胞的生長(zhǎng)影響一致，最大程度保證在試驗(yàn)過程中各組細(xì)胞狀態(tài)一致，對(duì)后續(xù)脫顆粒、組胺和氨基己糖苷酶的測(cè)定影響最小。

4.3 對(duì)P815 細(xì)胞的影響

由試驗(yàn)結(jié)果看出，與空白組相比，血必凈注射液中含有的綠原酸和咖啡酸能極顯著地引起P815細(xì)胞脫顆粒、釋放組胺及氨基己糖苷酶；原兒茶醛、蒿本內(nèi)酯和丹酚酸B 對(duì)P815 細(xì)胞的脫顆粒及組胺釋放有較大影響，也能一定程度上影響氨基己糖苷酶的釋放，與所引文獻(xiàn)中可能導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)或相互作用的化合物基本一致。此外，血必凈注射液本身也會(huì)顯著引起P815 細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺，并一定程度上增加氨基己糖苷酶的釋放。

綜上，本次試驗(yàn)結(jié)果可一定程度上為評(píng)價(jià)血必凈注射液的致類過敏性提供初步參考；但本試驗(yàn)僅采用了體外P815 細(xì)胞模型，且樣品也是未經(jīng)人體吸收代謝的原型成分，其過敏機(jī)制以及引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)還需要結(jié)合生物體內(nèi)分布代謝的過程，并運(yùn)用體內(nèi)外模型進(jìn)行深入研究。