張玉媛， 羋靜， 魯靜

鎘是一種應(yīng)用廣泛的有毒重金屬元素，它有多種暴露途徑，如職業(yè)性暴露、生活性暴露(飲水、吸煙、食物)等[1]，這種環(huán)境污染物在生物體內(nèi)的半衰期超過(guò)了20年[2]，一旦進(jìn)入機(jī)體，鎘能夠在體內(nèi)很多器官蓄積進(jìn)而發(fā)揮其毒性損傷作用，如神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等[3]。肝臟是機(jī)體新陳代謝的重要器官，也是這種環(huán)境污染物的主要靶器官，鎘能夠?qū)Ω闻K造成毒性損傷[4],但是肝毒性機(jī)制至今都還沒(méi)有分析透徹，仍需繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[5]。脾是與造血、免疫功能調(diào)節(jié)相關(guān)的器官，也是鎘毒作用的主要靶器官之一，鎘能夠引起胸腺萎縮和脾腫大，進(jìn)而損傷免疫系統(tǒng)[6-7]，其損傷機(jī)制可能與金屬硫蛋白、炎癥等有關(guān)，有待于進(jìn)一步探討[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔連續(xù)注射染毒方式，通過(guò)對(duì)成年小鼠連續(xù)染毒14 d，觀察不同劑量的CdCl2(0.5、1.0、2.0 mg/kg)對(duì)成年小鼠的影響，通過(guò)臟器系數(shù)的改變觀察氯化鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和脾臟的影響，通過(guò)病理學(xué)檢查觀察小鼠肝臟和脾臟的病理學(xué)變化，同時(shí)通過(guò)對(duì)血清中CAT、GSH的檢測(cè)了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氧化應(yīng)激水平，通過(guò)氯化鎘對(duì)小鼠肝臟、脾臟的變化和氧化應(yīng)激水平的改變，初步探討氯化鎘對(duì)小鼠肝脾毒性及作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供思路和方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 氯化鎘(CdCl2)分析純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，本實(shí)驗(yàn)所用試劑盒(過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH))均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠24只，體質(zhì)量24～26 g，雌雄各半，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2011-0003，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周[標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，正常飲食，每天循環(huán)8:00起照明12 h, 20:00起黑暗12 h，溫度20～25 ℃，濕度(50±5)%]。本實(shí)驗(yàn)遵循“NIH實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物管理和使用指南”，禁止虐待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所有操作程序按照蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)要求進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及分組 24只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組6只，分別是氯化鎘染毒組和對(duì)照組，CdCl2溶解于0.9%的生理鹽水中，4組分別是CdCl20.5、1.0、2.0 mg/kg和NS對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天稱量后經(jīng)腹腔注射(10 mL/kg)相應(yīng)劑量的CdCl2。

1.4 體質(zhì)量及臟器質(zhì)量 每次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理前均嚴(yán)格稱量體質(zhì)量，分別在染毒14 d后取材，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸椎脫臼處死后冰上取出肝臟和脾臟稱量計(jì)算肝臟和脾臟系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)×100/體質(zhì)量(g)。

1.5 血清中CAT及GSH檢測(cè) 末次染毒后小鼠經(jīng)眼球采血，全血室溫靜置1 h后經(jīng)4 000 r/min、離心10 min，收集上清后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)操作流程嚴(yán)格遵循試劑盒要求進(jìn)行，其中GSH含量的測(cè)定采用分光光度法，CAT活力的測(cè)定采用可見(jiàn)光法。

1.6 組織病理學(xué)檢查 末次染毒后，取部分肝臟和脾臟稱重后置于4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)脫水進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切、展片、脫蠟、HE染色，Olympus DP73熒光顯微鏡鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較 染毒期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒部位無(wú)明顯炎癥性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CdCl22.0 mg/kg組小鼠活動(dòng)度稍低，精神較萎靡，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，連續(xù)染毒14 d后，各處理組體質(zhì)量增加程度不同(F=4.096，P<0.05)，CdCl22.0 mg/kg組增加(0.23±1.1)g，低于NS對(duì)照組(1.7±0.7)g和CdCl20.5 mg/kg組(1.7±0.9)g。

2.2 各組小鼠肝臟的比較

2.2.1 各組小鼠肝臟系數(shù)比較 經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，暴露14 d后，各暴露組肝臟系數(shù)均顯著增加，高于對(duì)照組，但各暴露組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 氯化鎘對(duì)小鼠肝臟系數(shù)的影響

2.2.2 各組小鼠肝臟組織形態(tài)的光鏡觀察 鎘暴露組小鼠肝臟腫大，經(jīng)HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組肝小葉均結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列規(guī)整，但是鎘暴露能夠引起部分肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞脂肪變性。CdCl22.0 mg/kg組鏡下白色箭頭所指處可見(jiàn)小灶性肝細(xì)胞壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見(jiàn)肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀壞死(黑色箭頭)，高倍鏡下，可見(jiàn)肝細(xì)胞有不同程度的水腫(白虛圈)，部分肝細(xì)胞核稍大(白圈)，同時(shí)部分肝細(xì)胞內(nèi)有脂肪變性(黑圈)。見(jiàn)圖1。

1A CdCl2 2.0 mg/kg(HE染色×200) 1B CdCl2 2.0 mg/kg(HE染色×400)

2.3 各組小鼠脾臟的比較

2.3.1 各組小鼠脾臟系數(shù)比較 鎘暴露組脾臟明顯增大、水腫、臟器增重明顯，CdCl20.5 mg/kg、1.0 mg/kg和2.0 mg/kg組脾臟系數(shù)均高于對(duì)照組，同時(shí)2.0 mg/kg組高于0.5 mg/kg組。見(jiàn)表2。

表2 氯化鎘對(duì)小鼠脾臟系數(shù)的影響

2.3.2 各組小鼠脾臟組織形態(tài)的光鏡觀察 各鎘暴露組小鼠脾臟均明顯增重，脾臟出現(xiàn)不同程度的代償性增生，以CdCl22.0 mg/kg組脾臟增重最為明顯。鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組小鼠脾臟紅髓、白髓邊界清楚，淋巴細(xì)胞排列緊密；2.0 mg/kg劑量組巨核細(xì)胞增大、數(shù)量增多。組織形態(tài)學(xué)變化如圖2所示。

2A CdCl2 2.0 mg/kg(HE染色×200) 2B CdCl2 2.0 mg/kg(HE染色×400)

2.4 各組小鼠血清GSH及CAT水平比較 與對(duì)照組比較，2.0 mg/kg組GSH和CAT水平均下降(P<0.05)；與0.5 mg/kg組比較，2.0 mg/kg組CAT表達(dá)水平下降(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 氯化鎘對(duì)小鼠血清中GSH、CAT的影響

3 討論

鎘是一種重要的環(huán)境污染物之一，其暴露途徑廣泛，既有職業(yè)性暴露，也有生活性的接觸，這種重金屬進(jìn)入機(jī)體后可引起機(jī)體多個(gè)部位和臟器發(fā)生損傷，鎘暴露是人群不良健康結(jié)局的一個(gè)危險(xiǎn)因素[1]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)性氯化鎘腹腔注射染毒14 d，觀察不同劑量氯化鎘對(duì)小鼠肝臟和脾臟系數(shù)的影響，同時(shí)觀察其對(duì)小鼠肝脾的病理學(xué)改變，通過(guò)檢測(cè)血清中抗氧化酶GSH和CAT的活性了解機(jī)體氧化應(yīng)激水平。

結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)小鼠在染毒前、染毒14 d體質(zhì)量均無(wú)顯著差別，但是也發(fā)現(xiàn)CdCl22.0 mg/kg組小鼠精神狀態(tài)較差，活動(dòng)度減少，同時(shí)各組在染毒期間體質(zhì)量增加程度不同，CdCl22.0 mg/kg組體質(zhì)量增加低于NS對(duì)照組和CdCl20.5 mg/kg組，這些現(xiàn)象提示鎘對(duì)機(jī)體的正常的生命活動(dòng)產(chǎn)生了一定的影響[9]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在染毒后肝臟、脾臟的臟器系數(shù)有了一定的改變，但是改變的程度不同。臟器系數(shù)能夠反映化學(xué)毒物對(duì)臟器的毒害作用，臟器系數(shù)的改變可以間接指示機(jī)體的損傷情況，機(jī)體在正常時(shí)臟器系數(shù)比較穩(wěn)定，因此，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器系數(shù)的改變可以觀察外源性化學(xué)物對(duì)機(jī)體的損傷程度[10]。肝臟對(duì)于化學(xué)毒物具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，也是鎘毒作用的靶器官之一，本實(shí)驗(yàn)劑量下，暴露組小鼠肝臟在染毒14 d后變大、水腫，肝臟系數(shù)高于對(duì)照組，結(jié)合肝臟HE鏡下觀察，肝臟組織中發(fā)生細(xì)胞壞死、炎癥反應(yīng)、水腫甚至脂肪變性，提示本實(shí)驗(yàn)劑量下持續(xù)性鎘暴露對(duì)小鼠造成肝臟損傷，肝臟質(zhì)量增加，出現(xiàn)肝細(xì)胞炎癥、壞死等損傷表現(xiàn)，有文獻(xiàn)指出，肝臟持續(xù)的的炎癥反應(yīng)可以造成肝臟的慢性炎癥性改變，繼而加重肝臟組織的損傷[11]。目前關(guān)于鎘誘導(dǎo)肝損傷機(jī)制包括了氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等等，但是其確切的損傷機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討和研究[5]。

免疫系統(tǒng)具有重要的防御能力，脾臟是重要的外周免疫器官，是免疫系統(tǒng)中不可缺少的一部分。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠的脾臟作為觀察對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染毒小鼠脾臟發(fā)生水腫、增生肥大等一系列的反應(yīng)，各染毒組脾臟系數(shù)均顯著增高，這些結(jié)果提示氯化鎘暴露對(duì)小鼠的脾臟有一定的毒性損傷作用。脾臟是與造血、免疫功能調(diào)節(jié)相關(guān)的器官，也是鎘毒作用的靶器官之一[6]，脾臟的結(jié)構(gòu)和脾臟系數(shù)的變化反映了機(jī)體的免疫功能[12]，也是衡量機(jī)體免疫功能的一個(gè)初步指標(biāo)[13]。正常情況下，骨髓以外的組織出生后不再參與造血，但是在某些病理狀態(tài)下，譬如當(dāng)小鼠骨髓造血機(jī)能損傷后，脾臟可代償性髓外造血，并造成器官的相應(yīng)腫大，所以通過(guò)脾臟系數(shù)的變化可間接了解小鼠的造血能力[14-15]，在本實(shí)驗(yàn)中，各暴露組脾臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)劑量下，鎘可致小鼠脾質(zhì)量顯著增加，誘發(fā)小鼠脾臟腫大；同時(shí)病理檢查也發(fā)現(xiàn)各染毒組脾臟出現(xiàn)不同程度代償性病變，這些現(xiàn)象提示在本實(shí)驗(yàn)劑量下，氯化鎘對(duì)小鼠脾臟產(chǎn)生了一定的影響。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示鎘暴露組抗氧化體系如GSH和CAT的表達(dá)有一定水平的下降，GSH和CAT主要發(fā)揮抗氧化作用[16]，鎘的毒性損傷與氧化損傷有關(guān)[17]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示鎘能夠影響機(jī)體氧化還原平衡，打破了機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激能力下降，造成機(jī)體的毒性損傷。

綜上所述，鎘損傷了肝臟和脾臟的基本結(jié)構(gòu)和功能，其對(duì)肝臟和脾臟等臟器的損傷可能通過(guò)多種途徑，譬如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，本研究?jī)?nèi)容比較膚淺，至于這種環(huán)境污染物引起臟器損傷的分子機(jī)制及其相關(guān)作用關(guān)系還有待于進(jìn)一步探討。