廖桂彬,唐舒婷,廖曉意,蘭紹陽,胡玲,陳斌,樊冬梅,李培武,陳昫

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣東 廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405;3.廣州中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心,廣東 廣州 510405)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)相關性胃病是現(xiàn)代醫(yī)學對于Hp感染所引起胃黏膜病變的簡稱,包括慢性非萎縮性胃炎(Chronic non-atrophic gastritis,CNAG)、慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)以及胃癌(Gastric cancer,GC)[1-2]。近年來，許多中醫(yī)學者對Hp相關性胃病“病-證”關系進行了相關研究[3]，李京堯、陳瑤等多項研究提示Hp相關性胃病實證常見脾胃濕熱證及肝胃不和證,以脾胃濕熱證為主，熱、濕是其主要病理因素,而脾氣虛證是Hp相關性胃病中出現(xiàn)頻率較高的虛證證型,提示脾胃濕熱、脾氣虛與Hp相關性胃病的發(fā)病具有一定相關性[4-5]。

胃內微生態(tài)可直觀地顯示胃內菌群的組成及結構特征,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),胃內微生態(tài)失衡可能是Hp相關性胃病的重要致病因素之一[6-8]。課題組前期研究顯示,慢性胃炎脾胃濕熱證組Hp感染率與脾氣虛證組相當,但感染程度高于脾氣虛證組[9],此外,前期研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證組白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-8(Interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等mRNA及蛋白均處于高表達狀態(tài)[10-11],而IL-1β的強效抑酸作用可升高胃內pH值,有利于胃內細菌繁殖,提示Hp相關性胃病脾胃濕熱證的發(fā)生可能與胃內微生態(tài)失衡存在一定聯(lián)系。但目前鮮有關于Hp相關性胃病中醫(yī)證型胃內微生態(tài)的研究,因此，本研究擬通過探究Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證患者與健康受試者之間胃黏膜菌群特征以及炎癥因子的表達差異,為Hp相關性胃病中醫(yī)證型形成的機制研究提供思路。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2019年11月至2020年10月在廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃病科內窺鏡室和胃腸外科就診,且病理確診為Hp相關性胃病的患者107例(包含CNAG患者49例,CAG患者45例,GC患者13例),其中脾胃濕熱證患者70例,脾氣虛證患者37例,同時招募平和體質健康受試者10例作為正常對照組。3組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),3組性別比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。脾胃濕熱證組和脾氣虛證組的Hp相關性胃病不同病種比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表2,具有可比性。本研究經廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過(倫理批號:ZYYECK〔2019〕095)。

表1 Hp相關性胃病不同證候患者性別、年齡比較Table 1 Comparison of sex and age of different evidence of

表2 Hp相關性胃病不同證候患者病種比較Table 2 Comparison of disease types between different evidence of Hp-related gastropathy

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照2017年中華醫(yī)學會消化病分會發(fā)布的《中國慢性胃炎共識意見》[12]中CNAG和CAG的診斷標準:取4塊標本(胃竇距幽門2～3 cm大彎、小彎、前壁和后壁各1塊),CNAG內鏡下可見黏膜紅斑、黏膜出血點或斑塊、黏膜粗糙伴或不伴水腫、充血滲出等基本表現(xiàn)。CAG內鏡下可見黏膜紅白相間,以白相為主,皺襞變平甚至消失,部分黏膜血管顯露;可伴有黏膜顆?；蚪Y節(jié)狀等表現(xiàn)。慢性胃炎患者胃鏡病理活檢若提示固有腺體有萎縮即可診斷為CAG,若無則為CNAG。胃癌的診斷通過內鏡下胃黏膜組織活檢病理結果或手術室標本病理結果確定最終診斷。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 脾胃濕熱證和脾氣虛證的診斷標準均參照2002年《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[13]。

脾胃濕熱證：主癥包括胃脘痛或脹痛，大便黏滯不爽，納呆食少，舌苔黃膩;次癥包括脘痞惡心，口苦而黏，肢體困重，渴而少飲。具備舌苔黃膩并同時具備其余主癥2項，或主癥1項及次癥2項，或次癥3項,即可診斷。

脾氣虛證：主癥包括食少納呆，體倦乏力，食后腹脹，大便異常(溏、爛、先硬后溏、時溏時硬);次癥包括神疲懶言，口淡不渴，腹痛綿綿，惡心嘔吐，脘悶，腸鳴，面色萎黃，浮腫，排便無力，舌質淡，舌體胖或有齒印，苔薄白，脈細弱或沉弱。具備主癥2項和次癥1項,即可診斷。

1.2.3 健康受試者納入標準 ①內鏡下提示僅慢性淺表性胃炎,無活動性炎癥;②Hp檢測結果陰性;③無呼吸、循環(huán)、消化、泌尿、神經系統(tǒng)等疾病,無臨床其他不適癥狀；④由2位主任醫(yī)師對其體質辨識為平和體質者；⑤所有受試對象均簽署試驗知情文件。

1.3 Hp相關性胃病納入標準

①符合CNAG、CAG或GC的病理診斷,且中醫(yī)證候符合脾胃濕熱證或脾氣虛證辨證標準;②年齡在18～70歲之間;③Hp感染史，且近1個月未行Hp根除療法，未使用抗生素、益生菌、鉍劑、H2受體拮抗劑和質子泵抑制劑(Proton pump inhibitor,PPI)者;④所有受試對象均簽署試驗知情文件。

1.4 排除標準

①合并有嚴重心、腦、肺、肝、腎及神經系統(tǒng)疾病者;②近期有消化道出血病史者;③孕婦、哺乳期婦女。

2 方法

2.1 胃黏膜樣本采集

所有Hp相關性胃病受試者及健康受試者均行電子胃鏡檢查,并于胃竇距幽門口2～3 cm處的大、小彎或前、后壁鉗取4塊直徑約0.2～0.3 cm的胃黏膜組織進行檢測,其中1塊行病理學組織檢測；1塊行免疫組化蛋白檢測；1塊放入裝有RNA保存液的凍存管中,隨后立即投入液氮瓶并轉移至-80 ℃低溫冰箱保存以備16S rDNA測序；另留取1塊樣本備用。胃癌標本則剪取手術切除的腫物組織、距離腫物2～3 cm的組織、遠癌組織各4塊直徑約0.2～0.3 cm胃黏膜組織,處理同前。將-80 ℃低溫冰箱保存的樣本送至廣州華銀健康科技有限公司行16S rDNA測序。

2.2 胃黏膜菌群檢測

提取胃黏膜樣本中的總DNA,利用16S rDNA技術對V3～V4區(qū)的DNA序列進行PCR擴增,然后通過Illumina Miseq測序平臺進行測序,構建DNA文庫,測序獲得的原始數據(Raw reads)進行數據過濾和優(yōu)化后進行下游分析,使用VSEARCH(v2.3.4)軟件按照相似度>97%的原則將原始數據進行聚類,得到OTU代表序列。使用RDP classifer(v2.2)軟件將OTU代表序列與Silva數據庫比對進行物種注釋分析[14]。主要采用R軟件(v3.5.1)、QIIME(v1.80)軟件和mothur(v1.39.5)軟件進行菌群生物信息分析,包括α多樣性分析和線性判別分析(LDA Effect size分析,LEfSe分析)等。

2.3 胃黏膜NLRP3和IL-1β蛋白表達水平檢測

采用二步免疫組織化學標記法檢測胃黏膜NLRP3和IL-1β蛋白表達水平,試劑盒購自Servicebio公司,貨號分別為:GB11086、GB23303,具體操作步驟按試劑盒說明進行。顯微鏡(型號:XSP-C204)進行鏡檢、圖像采集分析。根據細胞的染色程度進行評分:細胞不染色計為0分;染色程度為淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為1分、2分、3分。另根據染色細胞占據視野細胞總數的百分比來進行評分,隨機選取5個高倍視野(200×)。陽性細胞百分比<1%計0分；1%≤，<25%記1分；25%≤，<50%記2分；50%≤，<75%記3分；75%≤，≤100%記4分。陽性細胞染色程度得分與陽性細胞所占百分比得分的乘積即為免疫組織化學法總分,其中0分為陰性，記(-)；1～4分為輕度，記(+)；5～8分為中度，記(++)；9分及以上為重度，記(+++)。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 胃黏膜菌群α多樣性分析

所有樣本共計得到5 350 839條序列,平均每個樣本45 733條。物種累積曲線圖中可見曲線先迅速上升,后趨于平緩,說明樣本量已足夠滿足檢測需求,詳見圖1。

圖1 物種累計曲線Fig.1 Species accumulation curves

非參數檢驗分析胃黏膜菌群α多樣性指數,結果提示，與正常對照組比較,脾胃濕熱證組菌群多樣性指數(Shannon指數和Simpson指數)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),Chao指數和Ace指數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表3。與正常對照組比較,脾氣虛證組Simpson指數差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Shannon指數、Chao指數和Ace指數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表4。

表3 Hp相關性胃病脾胃濕熱證胃黏膜菌群的α多樣性分析[M(P25,P75)]Table 3 α diversity analysis of gastric mucosa microflora in Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome [M(P25, P75)]

表4 Hp相關性胃病脾氣虛證胃黏膜菌群的α多樣性分析[M(P25,P75)]Table 4 α diversity analysis of gastric mucosa microflora in Hp-related gastropathy with spleen-qi deficiency syndrome [M(P25, P75)]

3.2 胃黏膜菌群β多樣性分析

基于Unweighted UniFrac距離,不考慮序列豐度,只考慮序列數量,采用主坐標分析(Principal coordinates analysis,PCoA)的方法研究各組樣品間差異。研究發(fā)現(xiàn)3組樣本均呈現(xiàn)不同程度的重疊,組間差異不顯著,詳見圖2。

圖2 脾胃濕熱證組、脾氣虛證組和正常對照組胃黏膜菌群的多樣性PCoA圖Fig.2 PCoA diagram of diversity of gastric mucosa microflora in spleen and stomach damp-heat syndrome group, spleen-qi deficiency syndrome group and normal control group

3.3 胃黏膜菌群結構及組成分析

通過分析各組優(yōu)勢菌門(相對豐度>1%)結果發(fā)現(xiàn):門水平,與正常對照組比較,脾胃濕熱證患者胃黏膜的放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著減少(P<0.05,P<0.01),脾氣虛證組患者未見明顯優(yōu)勢菌群。屬水平,與正常對照組比較,脾胃濕熱證組胃黏膜的幽門螺桿菌屬(Helicobacter)相對豐度顯著增加(P<0.01),奈瑟氏菌屬(Neisseria)相對豐度減少(P<0.05),脾氣虛證組幽門螺桿菌屬相對豐度顯著增加(P<0.01)，詳見圖3，表5～6。

圖3 脾胃濕熱證組、脾氣虛證組和正常對照組在門(A)、屬(B)水平的物種豐度組成Fig.3 Species abundance at phylum (A) and genus (B) level in spleen and stomach damp-heat syndrome group, spleen-qi deficiency group and normal control group

表5 Hp相關性胃病脾胃濕熱證門、屬水平差異菌群Table 5 Differential flora in Hp-related gastropathy with spleen and stomach damp-heat syndrome at the phylum and genus level

表6 Hp相關性胃病脾氣虛證屬水平差異菌群Table 6 Differential flora in Hp-related gastropathy with spleen-qi deficiency syndrome at the genus level

3.4 Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證患者胃黏膜的標志菌群

為進一步探索Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證組的胃黏膜標志菌群,本研究采用LEfSe分析[15],標志菌群需滿足閾值P<0.05且LDA score值≥3.0(或≤-3.0)。脾胃濕熱證組和正常對照組比較，在屬水平，脾胃濕熱證組的胃黏膜優(yōu)勢菌群為幽門螺桿菌屬(Helicobacter)，正常對照組的胃黏膜優(yōu)勢菌群為奈瑟氏菌屬(Neisseria)，詳見圖4。脾氣虛證組與正常對照組比較，在屬水平，脾氣虛證組胃黏膜優(yōu)勢菌群為幽門螺桿菌屬(Helicobacter)，正常對照組無優(yōu)勢菌群，詳見圖5。

圖4 Hp相關性胃病脾胃濕熱證優(yōu)勢菌群Fig.4 The dominant flora of Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome

圖5 Hp相關性胃病脾氣虛證組優(yōu)勢菌群Fig.5 The dominant flora of Hp-related gastropathy with spleen-qi deficiency syndrome

3.5 胃黏膜組織NLRP3、IL-1β蛋白表達水平

與正常對照組比較,脾胃濕熱證組、脾氣虛證組NLRP3、IL-1β蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05),詳見表7～8、圖6～7。

表7 Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證的NLRP3蛋白表達Table 7 NLRP3 protein expression in Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome and spleen-qi deficiency syndrome

表8 Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證的IL-1β蛋白表達Table 8 IL-1β protein expression in Hp-related gastropathy with spleen-stomach damp-heat syndrome and spleen-qi deficiency syndrome

4 討論

Hp相關性胃病在我國發(fā)病率較高,其發(fā)病機制主要與Hp感染相關,若遷延不愈,Hp等菌群作為腫瘤微環(huán)境的重要因素之一,可通過影響機體免疫狀態(tài)促進慢性胃炎向胃癌發(fā)生發(fā)展[16]。

注:A.脾胃濕熱證組;B.脾氣虛證組;C.正常對照組圖6 胃黏膜組織中NLRP3蛋白表達水平(×200)Fig.6 Expression of NLRP3 in gastric mucosa tissue(×200)

注:A.脾胃濕熱證組;B.脾氣虛證組;C.正常對照組圖7 胃黏膜組織中IL-1β蛋白表達水平(×200)Fig.7 Expression of IL-1β in gastric mucosa tissue(×200)

目前中醫(yī)藥對于Hp相關性胃病的臨床癥狀改善甚至逆轉取得了顯著的療效。脾胃濕熱證、脾氣虛證分別是Hp相關胃病實證及虛證的常見證型,然而目前關于Hp相關性胃病的研究多集中于腸道菌群或舌苔菌群特征的研究[10,17-21],不同中醫(yī)證型的胃內微生態(tài)及炎癥水平變化的研究較少。因此，本文系統(tǒng)分析了Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證患者胃黏膜的菌群特征及胃黏膜炎癥因子的表達,研究發(fā)現(xiàn)Hp相關性胃病脾胃濕熱證患者幽門螺桿菌屬相對豐度顯著升高,奈瑟氏菌屬相對豐度顯著降低,幽門螺桿菌屬是脾胃濕熱證患者的胃黏膜優(yōu)勢菌屬。同時,脾氣虛證患者幽門螺桿菌屬相對豐度亦顯著升高，提示二者均為幽門螺桿菌屬的易感證型。與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證和脾氣虛證均有較高的Hp感染率結果相一致。

菌群失衡可影響宿主免疫系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮[9,22],IL-1β等炎癥因子作為先天宿主防御介質直接受其影響[23],Fan等[24]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的增加可抑制IL-1β的表達,從而緩解腸道炎癥。而炎癥作為機體免疫的重要環(huán)節(jié),亦可影響胃內微生態(tài)的組成和結構,從而破壞胃黏膜菌群的動態(tài)平衡[16,25],Ling等發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤微環(huán)境中的調節(jié)性T細胞和漿細胞樣樹突細胞表達改變與胃微生物群失調相關[26]。本研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證組的胃黏膜菌群多樣性低于正常對照組,而NLRP3和IL-1β蛋白表達水平高于正常對照組,提示胃黏膜菌群多樣性減少、物種豐度下降等菌群失調現(xiàn)象可能與炎癥反應相互作用,影響機體免疫,從而促進了Hp相關性胃病脾胃濕熱證的形成。奈瑟氏菌屬等為正常對照組的優(yōu)勢菌，齊城成等[27]發(fā)現(xiàn)健康薄白苔和病理黃膩苔(濕熱證的主要征象之一)中奈瑟氏菌屬的豐度存在差異,認為奈瑟氏菌屬可能是區(qū)別健康薄白苔和病理黃膩苔的菌群之一。

幽門螺桿菌屬導致Hp相關性胃病的發(fā)病可能與其導致胃黏膜長期處于炎癥狀態(tài)有關。IL-1β作為經典的促炎細胞因子,多項研究表明IL-1β在Hp感染患者胃黏膜的表達高低與Hp感染的相關炎癥反應密切相關[28-30]。細胞毒素相關基因A蛋白(Cytotoxin associated gene A protein,CagA)是Hp的主要毒力因子之一,可通過激活NF-κB信號通路,活化NLRP3炎癥體,促進IL-1β、IL-18的釋放,激活細胞焦亡,進而加重炎癥反應[22]。課題組前期發(fā)現(xiàn)Hp感染可激活NF-κB信號,促進其下游的相關因子IL-1β的高表達[11],隨后對IL-1β基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)IL-1β-511 TT基因型在脾胃濕熱證中的表達量有所升高,進一步采用二代測序法篩查發(fā)現(xiàn)Hp感染患者體內NODs通路被激活,NLRP3炎癥體處于高表達狀態(tài)[11]。本研究結果顯示Hp相關性胃病中脾胃濕熱證組和脾氣虛證組的NLRP3和IL-1β蛋白表達水平均顯著高于正常對照組,說明脾胃濕熱證、脾氣虛證的形成和NLRP3及IL-1β蛋白表達密切相關，但脾胃濕熱證的NLRP3和IL-1β感染以中、重度表達為多,而脾氣虛證中NLRP3和IL-1β的表達以輕、中度為主。提示NLRP3及IL-1β表達水平的升高可能是“濕熱”“脾氣虛”的重要致病機制之一。

綜上所述,胃黏膜菌群多樣性減少、炎癥程度升高可能是Hp相關性胃病脾胃濕熱證、脾氣虛證發(fā)病的內在致病機理。脾胃濕熱證、脾氣虛證和正常對照組的差異優(yōu)勢菌群可能是其菌群標志。本次研究尚未對不同證型之間菌群及相關機制進行比較研究，課題組后續(xù)將進一步擴大樣本,并納入Hp相關性胃病不同病種及不同證候,基于炎癥與菌群改變進一步深入系統(tǒng)研究。