黃珊,王國(guó)振,蔡雙明,張文雍,金思一,寧佐偉

肝纖維化是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。每年有數(shù)百萬(wàn)病人由自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝病等疾病發(fā)展為肝纖維化，肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展，可進(jìn)展為肝硬化、肝癌[1-3]。目前肝纖維化的發(fā)病機(jī)制不明，并且缺乏特異性治療方法。因此，進(jìn)一步研究并明確肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，尋找有效治療方法，有著重要的臨床意義。

醛固酮是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)重要成分，既往被認(rèn)為是經(jīng)典的血壓以及容量調(diào)節(jié)激素，在調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡方面有著重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其參與了器官纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4-6]。NLRP3炎癥小體由Nod-like receptor3(NLRP3)，apoptosis-associated speck-like protein(ASC)以及caspase-1(Casp1)組成，當(dāng)炎癥、缺氧等因素刺激NLRP3活化后，可與ASC、Casp1前體pro-Casp1結(jié)合，剪切Casp1前體pro-Casp1形成有活性的Casp1。 NLRP3、ASC、Casp1進(jìn)一步組成活化的NLRP3炎癥小體復(fù)合物，剪切IL-1β的前體pro-IL-1β，生成IL-1β[7-9]。本課題組既往的研究中證實(shí)醛固酮可以促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化，IL-1β生成導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[10]。但醛固酮是如何引起NLRP3炎癥小體活化，以及IL-1β如何促進(jìn)肝纖維化發(fā)生等機(jī)制仍未完全闡明[11-13]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)活化堆積導(dǎo)致氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)，這一過(guò)程與肝纖維化[14-16]以及NLRP3炎癥小體[17-19]活化密切相關(guān)。Smad通路是肝纖維化中經(jīng)典通路，Smad2、3活化后與Smad4結(jié)合，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生[20]。為進(jìn)一步明確醛固酮引起NLRP3炎癥小體通路活化及明確其下游通路，本課題使用了敲除NLRP3基因的小鼠建立四氯化碳(CCl4)模型，并且通過(guò)分離野生型及NLRP3基因敲除小鼠肝原代星狀細(xì)胞，擬證明：醛固酮通過(guò)ROS活化NLRP3炎癥小體，引起IL-1β生成，并通過(guò)Smad2、3通路活化促進(jìn)肝纖維化發(fā)生這一結(jié)論。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

醛固酮(aldosterone)、依普利酮(醛固酮拮抗劑，eplerenone)、螺內(nèi)酯(醛固酮拮抗劑，spironolactone)、DPI(ROS拮抗劑，diphenyleneiodonium)、NAC(ROS拮抗劑，N-acetylcysteine)、IL-1β抑制劑、四氯化碳由Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)公司提供，IL-1β由ProSpec(Protein Specialists, Rehovot, Israel)公司提供。

1.2 動(dòng)物模型

南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了小鼠實(shí)驗(yàn)方案。南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供野生型雄性C57小鼠(6～8周齡，18～22 g)，Jackson實(shí)驗(yàn)室(B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/J)提供NLRP3敲除小鼠(雄性，6～8周齡，18～22 g)。動(dòng)物在南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。18只野生型小鼠隨機(jī)分為兩組：野生型對(duì)照組、野生型模型組。野生型對(duì)照組小鼠每隔5 d皮下注射5 mL/kg橄欖油1次，連續(xù)3個(gè)月；野生型四氯化碳模型組小鼠每隔5 d注射5 mL/kg 20%四氯化碳1次，連續(xù)3個(gè)月。同樣，將18只NLRP3基因敲除小鼠隨機(jī)分為NLRP3基因敲對(duì)照組和NLRP3基因敲除四氯化碳模型組，NLRP3基因敲除對(duì)照組小鼠每隔5 d皮下注射5 mL/kg橄欖油1次，連續(xù)3個(gè)月；NLRP3基因敲除四氯化碳模型組小鼠每隔5 d注射5 mL/kg 20%四氯化碳1次，連續(xù)3個(gè)月。3個(gè)月后分離肝星狀細(xì)胞，并留取肝組織石蠟、冰凍標(biāo)本。

1.3 原代肝星狀細(xì)胞分離與細(xì)胞培養(yǎng)

依據(jù)既往發(fā)表的文章中方法分離野生型及NLRP3基因敲除對(duì)照組C57小鼠原代肝星狀細(xì)胞[21]。使用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至75%后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，分別使用螺內(nèi)酯(10-5M)、依普利酮(10-5M)、DPI(5 μM)、NAC(10-3M)、IL-1β (2 ng/mL)或IL-1β 抑制劑(10 ng/mL)刺激60 min后，加入醛固酮(10-7M)刺激24 h。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)

肝組織經(jīng)福爾馬林溶液固定后，分別使用75%、80%、85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇脫水30 min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡15 min。然后，將組織進(jìn)行石蠟包埋，并切成4 μm石蠟切片。在60 ℃烘箱中烤片2 h。

切片按以下順序進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min，100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%、75%乙醇和去離子水各5 min。

使用檸檬酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)。封閉液進(jìn)行封閉后，使用一抗(1∶100)4 ℃孵育切片過(guò)夜。洗片后使用二抗室溫孵育1 h，洗片后進(jìn)行DAB染色，封片。

1.4.2 過(guò)氧化氫含量測(cè)量

5～10 mg肝組織與100 μL裂解液(S0051，Beyotime，中國(guó))混合，12 000 g離心5 min，收集上清。用裂解液稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品。然后，50 μL上清液或標(biāo)準(zhǔn)樣品與100 μL過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑混合。在環(huán)境溫度下放置30 min后，使用酶標(biāo)儀560 nm波長(zhǎng)檢測(cè)樣品。肝原代細(xì)胞過(guò)氧化氫檢測(cè)同上。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡分析

用裂解液(89900，Thermo Fisher Scientific)將肝組織研磨均勻，并在4 ℃離心以收集上清。使用Pierce BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(23225，Thermo Fisher Scientific)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并將上清液與5倍上樣緩沖液混合，煮沸變性。電泳后，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。封閉液封閉1 h，使用Ⅰ型膠原、Smad2/3、NLRP3、IL-1β, ASC、caspase-1和α-SMA的一抗(1∶1000；Cell Signaling Technology)或β-actin一抗(1∶700；Santa Cruz Biotechnology)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗(1∶7 500)室溫孵育1 h后，用熒光分析儀定量熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 CCl4模型組小鼠肝組織中H2O2含量增加

與野生型對(duì)照組相比，野生型 CCl4模型組中小鼠肝臟組織中H2O2含量明顯增加(圖 1A)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。提示ROS可能參與肝纖維化過(guò)程。

2.2 NLRP3炎癥小體活化后促進(jìn)IL-1β及 Smad2/3表達(dá)

免疫組化提示，與野生型對(duì)照組相比野生型CCl4模型組小鼠肝組織中IL-1β以及Smad2/3蛋白表達(dá)明顯增高(圖1B)。NLRP3基因敲除CCl4模型組與野生型CCl4模型組相比，IL-1β以及Smad2/3的蛋白表達(dá)降低(圖1B)。上述蛋白含量改變差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示NLRP3通過(guò)IL-1β以及Smad2/3作用于肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。

圖1 野生型CCl4模型小鼠中ROS、IL-1β、Smad2/3含量升高，抑制NLRP3炎癥小體后IL-1β、Smad2/3含量降低 A:野生型CCl4模型組中肝組織ROS含量; B:野生型及NLRP3敲除小鼠對(duì)照組及CCl4模型組肝組織中IL-1β、Smad2/3含量改變。*與野生型對(duì)照組相比，P<0.05，#與野生型CCl4模型組相比，P<0.05

2.3 醛固酮促進(jìn)原代肝星狀細(xì)胞活化以及Ⅰ型膠原生成

為了進(jìn)一步研究醛固酮對(duì)肝纖維化的影響，我們用醛固酮及其抑制劑(螺內(nèi)酯以及依普利酮)刺激由野生型小鼠肝臟分離的原代肝星狀細(xì)胞,使用螺內(nèi)酯及依普利酮刺激1 h后加入醛固酮培養(yǎng)24 h。與對(duì)照組相比，醛固酮刺激組中α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白含量增加，抑制醛固酮后可以抑制上述蛋白含量增加(圖2A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示醛固酮可以促進(jìn)星狀細(xì)胞活化，肝纖維化發(fā)生。

2.4 醛固酮通過(guò)ROS調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活化，α-SMA以及Ⅰ型膠原合成

用醛固酮抑制劑(螺內(nèi)酯以及依普利酮)刺激由野生型小鼠肝臟分離的原代肝星狀細(xì)胞1 h后，加入醛固酮。與對(duì)照組相比，醛固酮刺激組中的H2O2含量上調(diào)。抑制醛固酮后可以抑制H2O2含量上調(diào)(圖2B)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示醛固酮促進(jìn)ROS生成。

在野生型肝原代星狀細(xì)胞中，使用NAC以及DPI抑制ROS合成后，加入醛固酮。NAC、DPI可以抑制醛固酮引起的ASC、caspase-1、IL-1β、Ⅰ型膠原、α-SMA蛋白含量增加(圖2C)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示醛固酮通過(guò)ROS引起NLRP3炎癥小體激活，星狀細(xì)胞活化，肝纖維化發(fā)生。

圖2 醛固酮通過(guò)ROS調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體/IL-1β活化，α-SMA以及Ⅰ型膠原合成 A:醛固酮及其抑制劑刺激野生型肝原代星狀細(xì)胞后，α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白含量改變; B:醛固酮及其抑制劑刺激野生型肝原代星狀細(xì)胞后H2O2含量改變; C:醛固酮及ROS抑制劑刺激野生型肝原代星狀細(xì)胞后， ASC、caspase-1、IL-1β、Ⅰ型膠原、α-SMA蛋白含量改變。*與對(duì)照組相比，P<0.05。&與醛固酮刺激組相比，P<0.05

2.5 IL-1β通過(guò)Smad2/3信號(hào)通路促進(jìn)α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá)

通過(guò)醛固酮刺激野生型原代肝星狀細(xì)胞后，使用IL-1β阻斷劑抑制IL-1β表達(dá)。與醛固酮刺激組相比，抑制IL-1β表達(dá)后，使NLRP3炎癥小體組分、Ⅰ型膠原、磷酸化Smad2/3以及α-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)(圖3A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示醛固酮通過(guò)IL-1β刺激Smad2、3活化，星狀細(xì)胞活化、肝纖維化發(fā)生。

使用IL-1β分別刺激野生型以及NLRP3敲除小鼠分離的肝原代星狀細(xì)胞。與野生型對(duì)照組相比，野生型IL-1β刺激組中NLRP3、ASC、Caspase1、α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白含量上調(diào)(圖3B)。與野生型IL-1β刺激組相比，NLRP3敲除IL-1β刺激組中上述蛋白表達(dá)降低(圖3B)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示IL-1β刺激Smad2、3活化，星狀細(xì)胞活化、肝纖維化發(fā)生。IL-1β可能會(huì)反作用于NLRP3炎癥小體活化，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。

圖3 IL-1β通過(guò)Smad2/3信號(hào)通路促進(jìn)α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá) A:醛固酮及IL-1β抑制劑刺激野生型肝原代星狀細(xì)胞后，相關(guān)蛋白含量改變; B:IL-1β刺激野生型以及NLRP3敲除肝原代星狀細(xì)胞后相關(guān)蛋白含量改變。*與野生型對(duì)照組相比，P<0.05。#與野生型醛固酮刺激組相比，P<0.05

3 討論

本文利用NLRP3敲除小鼠構(gòu)建CCl4肝纖維化模型，通過(guò)分離野生型及NLRP3基因敲除小鼠肝原代星狀細(xì)胞證明：醛固酮通過(guò)ROS導(dǎo)致NLRP3炎癥小體活化，通過(guò)IL-1β/Smad2、3通路促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。

非病毒性肝纖維化多是由脂肪肝、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等多種疾病發(fā)展而形成。肝纖維化最終可發(fā)展成為肝硬化、肝癌[22-23]，嚴(yán)重威脅人類生命健康。我國(guó)是肝病大國(guó)，肝纖維化發(fā)病率較高。肝纖維化病情隱匿，多無(wú)明顯臨床癥狀，多發(fā)展為失代償期肝硬化等疾病后可出現(xiàn)臨床癥狀。但目前肝纖維化的確切發(fā)病機(jī)制不明，缺乏有效的特異治療方法，因此進(jìn)一步研究闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步尋找潛在治療靶點(diǎn)，尋找有效治療方法有著非常重要的臨床意義[24]。

醛固酮是經(jīng)典的水鈉調(diào)節(jié)激素，既往認(rèn)為醛固酮有著保水、保鈉、排鉀等作用，醛固酮抑制劑多在高血壓等疾病中應(yīng)用。但近年來(lái)證據(jù)證明，醛固酮與器官纖維化密切相關(guān)。醛固酮可以通過(guò)NLRP3炎癥小體活化導(dǎo)致器官損傷。Bai等[25]證明醛固酮引起的NLRP3炎癥小體活化，活化的NLRP3炎癥小體可以進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟損傷;Xiao B等[26]證實(shí)MnTBAP治療可以通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活化，從而減輕醛固酮引起的腎臟損傷;Bruder-Nascimento等[27]證明醛固酮引起的NLRP3炎癥小體活化在血管損傷方面有著重要的作用。在既往實(shí)驗(yàn)中，本課題組證明醛固酮可以通過(guò)NLRP3炎癥小體活化促進(jìn)肝纖維化發(fā)生[10]。然而，醛固酮如何引起NLRP3炎癥小體活化的呢，目前仍為具體闡明。

氧化應(yīng)激是由于活性氧(ROS)以及抗氧化物(antioxidant)失衡，導(dǎo)致活性氧堆積，從而造成組織器官損害。機(jī)體生成活化ROS后，其可以通過(guò)多種機(jī)制引起器官損傷，如炎癥小體通路活化機(jī)制、自噬機(jī)制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷機(jī)制等等[28-29]。那么，醛固酮導(dǎo)致的NLRP3炎癥小體活化是否是由ROS引起的呢？在本文體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與野生型對(duì)照組相比，野生型CCl4刺激組中，ROS含量明顯增加。初步提示ROS與肝纖維化相關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中，醛固酮刺激野生型肝原代星狀細(xì)胞后，與野生型對(duì)照組肝星狀細(xì)胞相比ROS含量增加。抑制醛固酮可以抑制ROS生成。這些結(jié)果提示醛固酮促進(jìn)ROS生成。醛固酮刺激野生型肝原代星狀細(xì)胞后，抑制ROS可以抑制NLRP3炎癥小體活化，抑制IL-1β生成，抑制肝纖維化發(fā)生，提示醛固酮通過(guò)ROS促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。

NLRP3炎癥小體活化可以導(dǎo)致pro-IL-1β生成增多，并剪切pro-IL-1β形成IL-1β，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。但是IL-1β如何促進(jìn)肝纖維化發(fā)生，目前相關(guān)機(jī)制仍未完全闡明。Smad通路是TGF-β信號(hào)通路經(jīng)典的下游通路，Smad通路蛋白可以分為2類，刺激性Smad(R-Smad)以及抑制性Smad(I-Smad)。R-Smad包括Smad2、Smad3、Smad4等。在磷酸化后，Smad2，Smad3蛋白與Smad4蛋白結(jié)合，形成Smad蛋白復(fù)合物，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化[30]，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。在本文中，我們驗(yàn)證了IL-1β通過(guò)Smad通路促進(jìn)星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)野生型模型組中IL-1β，Smad2/3蛋白表達(dá)升高，初步提示IL-1β，Smad2/3與肝纖維化相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，醛固酮刺激野生型肝臟原代星狀細(xì)胞后，阻斷IL-1β可導(dǎo)致Ⅰ型膠原，P-Smad2/3，α-SMA表達(dá)降低，提示IL-1β通過(guò)Smad2/3通路促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。有趣的是，當(dāng)IL-1β被阻斷后，NLRP3炎癥小體通路蛋白表達(dá)也降低了，利用IL-1β刺激肝原代星狀細(xì)胞可以導(dǎo)致NLRP3炎癥小體活化，提示IL-1β可能對(duì)NLRP3炎癥小體有反作用，可以促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化。IL-1β以及NLRP3炎癥小體的相關(guān)作用需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，醛固酮通過(guò)ROS導(dǎo)致NLRP3炎癥小體/IL-1β/Smad2、3通路活化，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。