袁敏 王素潔 李茜 張志月

唐山市工人醫(yī)院（河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山臨床醫(yī)學(xué)院）（河北唐山063000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種可致命的卒中亞型，由自發(fā)性非創(chuàng)傷性出血進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)引起［1］。目前，腦出血尚無(wú)有效的治療策略，迫切需要確定針對(duì)腦出血的精確機(jī)制。自噬被認(rèn)為是細(xì)胞克服外部刺激損傷的自我保護(hù)機(jī)制，其促進(jìn)細(xì)胞在各種病理過(guò)程中的存活［2-4］。全基因組測(cè)序技術(shù)表明，腦出血影響了各種非編碼RNA（ncRNA）的表達(dá)［5］。作為調(diào)節(jié)性ncRNA，lncRNA（＞200 nt）通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)育和疾病相關(guān)基因參與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展和病理過(guò)程［6-7］。有證據(jù)表明，lncRNA H19（以下簡(jiǎn)稱H19）是在人腦灰質(zhì)和白質(zhì)中表達(dá)穩(wěn)定性最高的10 種lncRNA 之一［8］。H19 在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，例如H19通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病理生理過(guò)程［9］。最近，KIM 等［10］揭示H19 在腦出血后高表達(dá)，表明H19 可能作為腦出血的生物標(biāo)志物。還有文獻(xiàn)表明，H19 與自噬相關(guān)的miRNA 或蛋白質(zhì)相互作用［11-12］。然而，H19 是否參與腦出血損傷病理過(guò)程中自噬調(diào)節(jié)的機(jī)制需要進(jìn)一步探索。因此，本研究通過(guò)體內(nèi)建立腦出血小鼠模型和體外將SH-SY5Y 細(xì)胞暴露于氧血紅蛋白（OxyHb）模擬腦出血，共同探討H19 在腦出血損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 84 只成年C57BL/6J（B6）小鼠（8 ～10 周，25 ～30 g，雌性各半）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008）。小鼠在特定的無(wú)病原體條件下，允許隨意獲取食物和水。

1.1.2 試劑 膠原酶Ⅳ、MTT 溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；抗LC3、Beclin、p62、Sirt3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTORβ-actin 和HRP 偶聯(lián)的二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔Ig G 購(gòu)自 上 海Beyotime 公司；OxyHb 購(gòu)自德國(guó)Ruibio 公司；Lipo2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京Solarbio 公司；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 購(gòu)自日本Takara 公司；ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。含有sh-H19 或sh-NC 的慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.1.3 細(xì)胞 SH-SY5Y 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，接種在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 腦出血模型建立 參照文獻(xiàn)方法通過(guò)注射膠原酶Ⅳ誘導(dǎo)腦出血模型［13］。具體操作為：小鼠麻醉后固定在立體定向框架中，并在頭部前囟點(diǎn)（前0.5 mm 和左側(cè)紋狀體部分外側(cè)2 mm）鉆一個(gè)孔。將溶解在0.5 μL 生理鹽水中的總共0.06 單位膠原酶Ⅳ以0.18 μL/min 的速度注射到左側(cè)紋狀體中。輸注后將針頭保持原位10 min 以防止回流。

1.2.2 小鼠分組 將小鼠分為6 組：假手術(shù)（Sham）組、腦出血（ICH）組、Sham+shRNA 陰性對(duì)照（sh-NC）組，Sham+shRNA-H19（sh-H19）組，ICH+sh-NC組和ICH+sh-H19 組。Sham 組（n= 18）：除了不注射膠原酶Ⅳ，其余同1.2.1 方法；ICH 組（n=18）：按照1.2.1 方法建立腦出血模型；Sham+sh-NC 組、Sham+sh-H19 組：在假手術(shù)前72 h，分別將含有sh-NC（1 × 108TU/mL）和sh-H19（1 × 108TU/mL）的慢病毒顆粒10 min內(nèi)緩慢注射到小鼠腦室中（10 μL，速率為0.5 μL/min）；ICH+sh-NC 組、ICH+sh-H19組：在腦出血建模（同ICH 組）前72 h，分別將含有sh-NC（1×108TU/mL）和sh-H19（1×108TU/mL）的慢病毒顆粒10 min 內(nèi)緩慢注射到小鼠腦室中（10 μL，速率為0.5 μL/min）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為兩部分：（1）腦出血后小鼠腦組織中H19 表達(dá)的時(shí)程分析：觀察Sham 組和ICH 組腦出血建模術(shù)后24、48 和72 h H19 表達(dá)水平。（2）確定H19 在腦出血中的作用及其潛在機(jī)制：腦出血后48 h，Sham+sh-NC 組、Sham+sh-H19 組、ICH+sh-NC 組和ICH+sh-H19 組每組6 只小鼠被處死并分離病灶腦組織用于后續(xù)分析，其余6 只小鼠用于神經(jīng)行為分析。

1.2.3 病灶體積評(píng)估 在神經(jīng)學(xué)評(píng)估后，處死模型小鼠并將大腦切成2 mm 厚的冠狀切片，參照文獻(xiàn)方法評(píng)估病變體積（n=3）［13］?？偛≡铙w積=4×每個(gè)腦切片的病灶體積×2 mm。

1.2.4 行為分析 采用量化改良神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）評(píng)估每只小鼠的神經(jīng)功能缺損。

1.2.5 免疫熒光 給予腦切片以回收抗原，然后脫水，透化并與0.2%牛血清白蛋白孵育，將腦切片與抗LC3（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日，在室溫下將Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔Ig G（1∶200）添加到切片中孵育1 h。然后將切片用DAPI 染色。使用倒置熒光顯微鏡捕獲圖像。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞分組 將SH-SY5Y 細(xì)胞以約1.2 × 106的密度接種至6 孔板中，為了模擬腦出血，將SHSY5Y 細(xì)胞暴露于10 μmol/L 濃度下OxyHb［14］。將細(xì)胞分為對(duì)照（Control）組、H19 敲低組（sh-H19）、OxyHb 組、OxyHb+sh-NC 組、OxyHb+sh-H19 組、OxyHb+sh-Sirt3 組 和OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3 組。Control 組：SH-SY5Y 細(xì)胞中加入空白溶劑；sh-H19組：采用sh-H19轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h；OxyHb組：SH-SY5Y細(xì)胞中加入10 μmol/L濃度OxyHb；OxyHb+sh-NC組、OxyHb+sh-H19組和OxyHb+sh-Sirt3組：將sh-NC、sh-H19或sh-Sirt3轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h，然后加入10 μmol/L OxyHb處理細(xì)胞；OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3 組：將sh-H19 和sh-Sirt3 轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞48 h，然后，加入10 μmol/L OxyHb 處理細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)分為4 部分：（1）暴露于10 μmol/L 濃度OxyHb的SH-SY5Y 細(xì)胞中H19 表達(dá)的時(shí)程分析：觀察Control 組和OxyHb 組暴露OxyHb 后24、48 和72 h的H19 表達(dá)水平。（2）確定H19 敲低對(duì)OxyHb 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響：OxyHb 處理48 h，測(cè)定Control 組、OxyHb 組、OxyHb+sh-NC 組和OxyHb+sh-H19 組的細(xì)胞凋亡。（3）測(cè)定H19 敲低后的SHSY5Y 細(xì)胞RNA 序列：Control 組和sh-H19 組在轉(zhuǎn)染48 h 進(jìn)行RNA 測(cè)序。（4）觀察H19 敲低對(duì)Sirt3 介導(dǎo)AMPK/mTOR 信號(hào)通路影響：OxyHb 處理48 h，Oxy-Hb組，收集OxyHb+sh-H19組，OxyHb+sh-Sirt3 組和OxyHb+sh-H19+sh-Sirt3組細(xì)胞用于信號(hào)通路分析。

1.3.2 細(xì)胞活力測(cè)量 SH-SY5Y 細(xì)胞加入MTT 溶液（0.5 mg/mL）并在37 ℃下孵育4 h。然后在黑暗中將紫色晶體溶解在150 μL DMSO 中10 min。在酶標(biāo)儀上獲得570 nm 處的光密度。

1.3.3 RNA 提取和RT-qPCR 分析 使用總RNA提取試劑盒從腦組織和SH-SY5Y 細(xì)胞中提取總RNA。然后使用PrimeScript RT 試劑盒對(duì)2 μg RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并在CFX96 實(shí)時(shí)系統(tǒng)（Bio-Rad）上使用SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。H19的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算倍數(shù)變化。本研究中使用的引物如下：H19，F(xiàn)：5'-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3'和R：5'-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3'；β-actin，F(xiàn)：5'-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3'和R：5'-TGGACTCCACGACGTACTC-3'。

1.3.4 免疫印跡分析 通過(guò)使用RIPA 裂解緩沖液從組織和細(xì)胞中分離總蛋白。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉后，將膜與靶向β-actin（1∶2 000），Beclin（1∶1 000），LC3（1∶1 000），p62（1∶1 000），Sirt3（1∶500），p-AMPK（1∶500）、AMPK（1∶500）、p-mTOR（1∶500）和mTOR（1∶1 000）的一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后將膜與HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）一起溫育1 h，并用ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察條帶。

1.3.5 Tunel 染色 冷凍切片和細(xì)胞使用0.25%Triton X-100 透化15 min。每個(gè)切片在室溫下用100 μL 平衡緩沖液孵育20 min，然后用50 μL 重組末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（RTdT）孵育緩沖液覆蓋并在37 ℃下黑暗中孵育1 h，再用DAPI 染色15 min。使用倒置熒光顯微鏡捕獲圖像，并對(duì)腦出血部位周?chē)年?yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.6 RNA測(cè)序 從SH-SY5Y中提取的RNA（4 μg）用DNase 處理，去除核糖體RNA 后，制備RNA 文庫(kù)。在HiSeq 2000 系統(tǒng)（美國(guó)Illumina 公司）上進(jìn)行RNA 測(cè)序。使用Bioconductor R 程序中的EBSeq程序包評(píng)估差異基因表達(dá)。運(yùn)用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的mRNA 進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組之間比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H19 在體內(nèi)和體外腦出血時(shí)高度表達(dá) 與Sham 組相比，ICH 組在模型建立后第2 天病灶體積顯著增加（P＜0.001），并且mNSS 得分顯著較高（P＜0.001，圖1A-C）。腦出血后H19 的表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)（均P＜0.05，圖1D），并且H19 表達(dá)也在OxyHb 處理細(xì)胞中以時(shí)間依賴性方式增強(qiáng)（均P＜0.05，圖1E）。

圖1 H19 在體內(nèi)和體外腦出血時(shí)高度表達(dá)Fig.1 H19 was highly expressed during ICH in vivo and in vitro

2.2 H19敲低減輕腦出血引起的神經(jīng)損傷 sh-H19顯著降低損傷區(qū)域的H19 表達(dá)（圖2A）。與ICH+sh-NC 組相比，ICH+sh-H19 組在模型建立后第2 天病灶體積和mNSS 評(píng)分均顯著降低（P＜0.01），并且神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著減少（P＜0.01，圖2B-E）。

圖2 H19 敲低減輕腦出血引起的神經(jīng)損傷Fig.2 H19 knockdown attenuated ICH-induced nerve damage

2.3 H19 敲低增強(qiáng)腦出血小鼠腦內(nèi)自噬 損傷區(qū)域LC3 的強(qiáng)度因腦出血而增加，而H19 敲低進(jìn)一步增強(qiáng)了LC3 的強(qiáng)度。見(jiàn)圖3。

圖3 H19 敲低增強(qiáng)腦出血小鼠腦內(nèi)自噬Fig.3 H19 knockdown enhanced autophagy in the brain of ICH mice

2.4 H19敲低減輕OxyHb誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷誘導(dǎo)腦出血后，細(xì)胞中H19 表達(dá)升高，并且細(xì)胞活力降低（圖4A-B）。由腦出血誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞增加被H19 敲低所緩解（圖4C-D）。此外，H19 敲低可增加LC3II/LC3I 和Beclin 水平，降低p62 蛋白水平（圖4E）。

圖4 H19 敲低減輕OxyHb 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷Fig.4 H19 knockdown attenuated OxyHb-induced neuronal injury

2.5 H19 敲低通過(guò)增強(qiáng)Sirt3 介導(dǎo)AMPK/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬水平 與對(duì)照組相比，H19 敲低組中有1 120 個(gè)mRNA 差異表達(dá)，其中429 個(gè)上調(diào)mRNA 和691 個(gè)下調(diào)mRNA。mRNAs 的差異表達(dá)水平通過(guò)火山圖直觀表達(dá)（圖5A）。KEGG 通路分析顯示，差異表達(dá)的mRNA 在AMPK/mTOR 信號(hào)通路中富集，這與自噬調(diào)節(jié)有關(guān)（圖5B）。Sirt3 通過(guò)AMPK/mTOR 途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞防御和介導(dǎo)細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。OxyHb 誘導(dǎo)Sirt3水平升高，H19敲低進(jìn)一步提高Sirt3水平。在OxyHb 誘導(dǎo)后，p-AMPK/AMPK 比率升高，而p-mTOR/mTOR 比率下降。H19 敲低大大加劇了上述變化（圖5C）。H19敲低細(xì)胞中的Sirt3 敲低逆轉(zhuǎn)了升高的p-AMPK/AMPK 比率和降低的p-mTOR/mTOR 比率（圖5D）。

圖5 H19 敲低通過(guò)增強(qiáng)Sirt3 介導(dǎo)AMPK/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)自噬水平Fig.5 H19 knockdown promoted autophagy levels by enhancing Sirt3-mediated AMPK/mTOR signaling pathway

2.6 H19 敲低通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3 誘導(dǎo)的自噬減輕腦出血損傷 H19 敲低細(xì)胞中提高的細(xì)胞活力在Sirt3 敲低后得到降低，并且減少的細(xì)胞凋亡在Sirt3 敲低后得到增強(qiáng)（圖6A-C）。此外，Sirt3 敲低降低了H19 敲低細(xì)胞中增加的細(xì)胞自噬（圖6D）。

圖6 H19 敲低通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3 誘導(dǎo)的自噬減輕腦出血損傷Fig.6 H19 knockdown attenuated ICH injury by regulating Sirt3-induced autophagy

3 討論

研究表明，H19 在腦出血發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［15］。H19 可以通過(guò)促進(jìn)miR-675 的表達(dá)和靶向VEGF 來(lái)增加與腦血管痙攣有關(guān)的HIF-1α mRNA 和蛋白質(zhì)水平。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是腦出血的主要原因，H19 通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病理生理過(guò)程［9］。此外，H19 也是腹主動(dòng)脈瘤形成的誘發(fā)因素，并通過(guò)將SP1 募集到缺氧誘導(dǎo)的因子1α 啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡［16］。同樣，ZHANG 等［17］發(fā)現(xiàn)H19可以通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路充當(dāng)miR-148b 的分子海綿，從而調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。基于以上證據(jù)，本研究通過(guò)體內(nèi)外構(gòu)建腦出血模型證實(shí)了H19 在腦出血小鼠模型中的表達(dá)升高，和H19 敲低可以減輕腦出血引起的神經(jīng)損傷，并在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)其損傷機(jī)制可能與抑制自噬有關(guān)。

大量證據(jù)表明，腦出血細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度受自噬的影響，激活自噬可以通過(guò)降解受損蛋白質(zhì)誘導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成［18-19］。一些研究者報(bào)道，自噬可以減少腦出血后的梗死體積、神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能障礙［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血損傷期間自噬被激活，并且H19 敲低進(jìn)一步增加自噬水平。通過(guò)mRNA 測(cè)序，對(duì)照組和H19 敲低組差異表達(dá)的mRNA 在AMPK/mTOR 信號(hào)通路中富集。AMPK/mTOR 信號(hào)通路是自噬過(guò)程的經(jīng)典調(diào)控通路，先前研究證實(shí)Sirt3 通過(guò)AMPK-mTOR 途徑誘導(dǎo)自噬［21-22］。Sirt3 屬于人類(lèi)sirtuin 家族最保守和最具特征的一個(gè)成員，在調(diào)節(jié)系統(tǒng)大腦中能量穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞壽命方面起著至關(guān)重要的作用［23］。本研究發(fā)現(xiàn)H19 敲低增加了Sirt3 水平，并且H19 敲低通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3 誘導(dǎo)的自噬減輕了OxyHb 處理后SH-SY5Y 細(xì)胞損傷。因此，筆者認(rèn)為H19 可能在腦出血模型中通過(guò)抑制Sirt3 介導(dǎo)的AMPK-mTOR信號(hào)通路來(lái)抑制自噬激活。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)H19 在體內(nèi)外腦出血模型中以時(shí)間依賴性方式增強(qiáng)，H19 敲低可以減少腦出血病灶體積，減輕神經(jīng)損傷和減少神經(jīng)元凋亡。此外，H19 敲低促進(jìn)了Sirt3 的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)激活A(yù)MPK-mTOR 信號(hào)通路增強(qiáng)自噬。這些結(jié)果揭示了H19 有可能成為腦出血治療的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，這也為開(kāi)發(fā)新的腦出血治療方法提供了基礎(chǔ)。然而，腦出血是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控體系，本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步闡明H19 是否通過(guò)其他途徑介導(dǎo)腦出血進(jìn)展，并在臨床大樣本中驗(yàn)證。