劉立天 王家琦 謝悅陶 張飛飛 黨懿 齊曉勇

1河北省人民醫(yī)院心血管內科（石家莊050051）；2河北北方學院研究生院（河北張家口075000）

心力衰竭（heart failure，HF）是導致死亡的主要原因之一，嚴重增加了社會經濟負擔。心力衰竭是由于心臟結構和/或功能異常導致充盈和/或射血能力受損以致不能滿足機體供血需求的一種臨床綜合征［1-2］。沙庫巴曲纈沙坦作為一種血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑，可阻滯血管緊張素Ⅱ受體和抑制腦啡肽酶，抑制細胞肥大，發(fā)揮擴張血管、利鈉、利尿、改善心肌重構作用［3-5］，以其獨特的作用機制給心衰的治療帶來了新的希望［6］。但其療效觀察的依據(jù)還較為匱乏，急需進一步闡釋其具體機制并評估該藥的安全性及有效性。本研究通過建立慢性心力衰竭兔模型后給予沙庫巴曲纈沙坦干預，通過觀察及測定心臟彩超、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、心肌組織病理、Ⅰ型膠原（collagenⅠ，ColⅠ）、Ⅲ型膠原（collagen Ⅲ，ColⅢ）、基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidases，MMP）及TGFβ/Smad 信號通路表達，探討沙庫巴曲纈沙坦對慢性心衰心室肌重構的影響及其機制，旨在為臨床更好地治療心力衰竭提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔30 只，雌雄不限，體質量約3.0～3.5 kg，實驗動物均購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（冀）2016-002。飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨研中心動物房，室溫條件下分籠飼養(yǎng)。本研究已經過本院動物倫理委員會審查。

1.2 主要儀器和試劑 注射用青霉素鈉160 萬單位/支購自華北制藥有限公司，戊巴比妥鈉，液氮，4%甲醛，沙庫巴曲纈沙坦100 mg/片購自北京諾華制藥有限公司，兔N 末端腦鈉肽前體（N-terminal proBNP，NT-proBNP）試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技有限公司，抗TGF-β 抗體購自博士德生物工程有限公司，抗α-SMA 抗體購自萊恩生物科技有限公司，抗Col-1 及抗Col-3 抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，二抗為山羊抗兔抗體購自易瑞生物技術有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立慢性心力衰竭動物模型 用3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）通過耳緣靜脈注射，充分麻醉后，將兔固定于動物手術臺，備皮并消毒后于胸骨左緣肋間區(qū)打開胸腔，充分暴露心臟，在升主動脈根部遠端1 cm 處游離約3～5 mm，于游離處環(huán)扎升主動脈使其為原周長60%，關閉胸腔。術后3 d均給予注射用青霉素鈉1.6 × 106U 肌肉注射。以術后12 周出現(xiàn)進食減少、精神差等心衰癥狀同時行心臟彩超示左室射血分數(shù)≤40%視為慢性心力衰竭模型制作成功。

1.3.2 實驗分組及干預 30 只新西蘭大白兔隨機分為3 組：假手術組開胸但未行升主動脈環(huán)扎術；心衰組開胸并環(huán)扎升主動脈；沙庫巴曲纈沙坦組行開胸、環(huán)扎升主動脈并于慢性心衰模型制作成功后給予8 周的沙庫巴曲纈沙坦治療。假手術組因出血死亡1 只，心衰組因急性左心衰竭死亡1 只，沙庫巴曲纈沙坦組實驗動物因麻醉意外死亡2 只。最終假手術組、心衰組存活9 只，沙庫巴曲纈沙坦組存活8 只。心衰組、沙庫巴曲纈沙坦組實驗動物均滿足心衰標準，并于術后12 周模型制作成功后，予以沙庫巴曲纈沙坦組以每天10 mg/kg沙庫巴曲纈沙坦（北京諾華制藥有限公司，國藥準字J20171054，規(guī)格：100 mg×14 片），進行8 周灌胃干預。心衰組及假手術組均給予8 周生理鹽水灌胃。

1.3.3 心臟彩超檢測 藥物干預8 周末，使用IU22彩色超聲儀檢查心臟彩超，于M 型圖像測定各組左室舒張末內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室縮短率（fractional shortening，LVFS）和左室收縮末內徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）。以上各測量值連續(xù)測量3 次取平均值。

1.3.4 血清NT-proBNP檢測 藥物干預8周末，經兔耳緣靜脈取血5 mL，使用離心機以3 000 r/min 離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）檢測各組血清NT-proBNP水平。

1.3.5 HE 染色及Masson 染色 藥物干預8 周末完成心臟彩超檢查后，處死同時留取各組實驗動物心肌組織標本，使用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋心肌組織后切取5 μm 厚切片，并進行Masson 染色及HE 染色，在光鏡下觀察各組心肌組織病理形態(tài)及纖維化程度。在Masson 染色后膠原纖維呈現(xiàn)綠色，采用Image Pluse6.0 軟件分析檢測各組心肌組織膠原纖維。

1.3.6 Western blot 采用Western blot 法檢測α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、MMP2、MMP9、TIMP1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7 蛋白表達水平。將蛋白樣品加入凝膠孔中，根據(jù)蛋白定量結果，加入5 ×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液與20 μg 相應體積的總蛋白樣品并混合，應用SDS-PAGE 凝膠于95 ℃變性10 min 后進行電泳。電泳結束后，采用轉移電泳將分離得到的蛋白條帶轉印至PVDF 膜上，并分別使用非標記一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育并檢測。將轉移膜放入室溫搖床上的封閉液中封閉緩慢搖動1 h，將封閉的轉移膜放入一抗工作液中在4 ℃反應過夜，之后取出反應膜放入平皿并充分洗去游離二抗，曝光洗片后，使用Image J 軟件分析各樣本的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用統(tǒng)計軟件SPSS 26.0 進行各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。采用均數(shù)±標準差表示各組計量數(shù)據(jù)，采用方差分析及SNK-q檢驗比較各組組間均數(shù)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心臟彩超檢測結果 藥物干預8 周后，與心衰組相比，沙庫巴曲纈沙坦組的LVFS、LVESD 及LVEF 指標明顯改善（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組心臟超聲圖像Fig.1 Echocardiographicindifferentgroup

2.2 各組血清NT-proBNP 檢測結果 藥物治療8 周后，與心衰組相比，沙庫巴曲纈沙坦組血清NT-proBNP 水平明顯降低，但仍明顯高于假手術組（P＜0.05）。見表1。

表1 藥物干預后心臟彩超及NT-proBNP 檢測結果Tab.1 Echocardiography paramaters and NT-proBNP after drug intervention ±s

表1 藥物干預后心臟彩超及NT-proBNP 檢測結果Tab.1 Echocardiography paramaters and NT-proBNP after drug intervention ±s

注：LVESD 為左心室收縮末期內徑、LVEDD 為左心室舒張末期內徑、LVEF 為左心室射血分數(shù)、LVFS 為左心室短軸縮短率；NT-proBNP為N 末端B 型利鈉肽原；與假手術組相比，aP ＜0.05；與心衰組相比，bP ＜0.05

指標LVESD（mm）LVEDD（mm）LVEF（%）LVFS（%）NT-proBNP（ng/mL）假手術組（n=9）6.78±0.833 11.06±0.73 57.56±5.41 34.56±2.59 296.36±18.05心衰組（n=9）12.44±1.01a 12.50±0.61a 35.56±2.70a 17.17±1.85a 391.59±28.35a沙庫巴曲纈沙坦組（n=8）10.38±0.92ab 12.00±2.00 45.00±2.51ab 25.69±1.51ab 343.71±11.35ab F 值86.447 3.155 74.904 161.021 47.229 P 值＜0.001 0.062＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 各組心肌組織病理檢查結果 藥物干預8 周后，心肌組織HE 染色示心衰組心肌組織肌纖維排列紊亂，細胞肥大。沙庫巴曲纈沙坦組較心衰組改善。Masson 染色示與假手術組相比，心衰組膠原纖維含量明顯增加（P＜0.05），沙庫巴曲纈沙坦組心肌組織膠原纖維沉積較心衰組明顯下降（P＜0.05）。Masson 染色后心肌組織中的膠原纖維呈綠色，肌纖維及纖維素則呈紅色。Masson 染色結果顯示，與假手術組相比，心衰組心肌組織中膠原纖維含量明顯增加［（10.01 ± 1.74）%vs.（4.36 ±0.93）%，P＜0.05］，沙庫巴曲纈沙坦組心肌組織膠原纖維沉積較心衰組明顯下降［（10.01 ± 1.74）%vs.（5.43±1.12）%，P＜0.05］。見圖2。

圖2 HE、Masson 染色下的心肌組織病理（×200）Fig.2 Pathological of myocardial tissue in HE and Masson staining（×200）

2.4 心肌組織蛋白表達水平 各組心肌組織蛋白表達水平比較，與假手術組比較，心衰組α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Mmp2、Mmp9、TIMP1、TGF-β、Smad2、Smad3 蛋白表達水平顯著升高，Smad6、Smad7 蛋白表達下降；與心衰組相比，沙庫巴曲纈沙坦組心肌組織中α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Mmp2、Mmp9、TGFβ、Smad2 及Smad3 蛋白表達水平顯著降低，Smad6及Smad7 蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3 及表2。

表2 心肌組織的蛋白表達水平Tab.2 Protein expression levels in myocardial tissues ±s

表2 心肌組織的蛋白表達水平Tab.2 Protein expression levels in myocardial tissues ±s

注：與假手術組相比，aP ＜0.05；與心衰組相比，bP ＜0.05

指標α-SMA ColⅠColⅢMMP2 MMP9 TIMP1 TGF-β Smad2 Smad3 Smad6 Smad7假手術組（n=9）7 980.67±1 155.52 18 619.00±869.36 9 052.89±586.32 15 379.78±1 000.08 19 689.44±1 346.57 20 513.00±1 232.67 11 815.56±1 253.84 16 343.78±1 754.83 15 388.00±2 026.15 19 552.22±2 272.11 20 549.89±3 306.26心衰組（n=9）21 553.00±2 858.89a 23 448.56±867.52a 13 908.11±923.44a 18 976.33±1 741.46a 26 976.11±1 877.52a 26 031.89±3 309.79a 18 552.56±1 104.66a 21 439.44±962.25a 22 107.78±5 133.34a 14 366.56±696.02a 13 504.89±1 751.67a沙庫巴曲纈沙坦組（n=8）17 779.25±2 993.95ab 20 893.38±603.69ab 10 732.38±835.77ab 16 862.13.33±984.47ab 24 287.75±1 328.96ab 24 261.25±3 788.78 15 044.88±2 910.96ab 20 113.50±750.32ab 16 922.38±1 029.54ab 16 655.13±2 066.66ab 16 713.88±2 175.02ab F 值72.837 82.658 86.820 17.306 50.950 8.181 28.780 39.986 10.153 18.615 17.743 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001 0.002＜0.001＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

圖3 心肌組織蛋白Western blot 圖Fig.3 Western blot map of myocardial tissues Protein

3 討論

心肌重構是慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）發(fā)生發(fā)展的重要機制，是以神經內分泌及血液動力學共同介導，可引起膠原纖維增加以及心肌細胞肥大、凋亡、壞死，出現(xiàn)瘢痕形成及心肌纖維化，進而發(fā)生心室壁肥厚。室腔形態(tài)改變及順應性降低，心功能逐漸進入失代償期，最終導致心力衰竭發(fā)生［7］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活在HF 心室重構中發(fā)揮著重要作用，可激活成纖維細胞使膠原纖維合成增多，并可作用于基質金屬蛋白，影響心肌組織細胞外基質的降解，進而影響心肌細胞凋亡及蛋白合成。研究表明，利鈉肽系統(tǒng)對RAAS 具有抑制作用，具有利鈉及擴張血管作用，可改善心室組織纖維化及重構［8-9］。

LEE等［10］研究發(fā)現(xiàn)，非缺血性心肌病患者經沙庫巴曲纈沙坦治療后，LVEF明顯改善。沙庫巴曲纈沙坦可改善HF 患者NT-proBNP、LVEF、LVEDD［11-12］，并可降低HF 患者再次住院率及死亡率［4］。本研究通過升主動脈根部套扎法成功建立CHF 動物模型，并根據(jù)既往相關研究中以10 mg/kg 沙庫巴曲纈沙坦給予HF 新西蘭兔可平衡利鈉肽系統(tǒng)與RAAS 為基礎給予干預［13］，研究結果與既往研究一致，給予CHF 兔8 周沙庫巴曲纈沙坦治療可改善LVFS、LVESD 及LVEF，降低血清NT-proBNP 水平，明顯改善心功能。

研究發(fā)現(xiàn)影響心臟纖維化和心肌重塑的信號蛋白，主要包括TGFβ/smad 家族成員2/3、ColⅢ、磷脂酰肌醇3-激酶、細胞外信號調節(jié)激酶、MMP2、MMP9 及TIMP1，其中Smad 信號級聯(lián)在心臟纖維化反應中起著關鍵作用［14-15］。BURKE 等［16］研究表明沙庫巴曲纈沙坦對HF 大鼠心肌組織中成纖維細胞有明顯抑制作用，可明顯改善因心臟后負荷增加而引起的心肌組織纖維化。本研究結果與既往研究一致，HE 染色結果表明，沙庫巴曲纈沙坦可降低心肌細胞變形壞死及炎細胞浸潤程度，并可改善HF 心肌組織中心肌纖維排列。膠原纖維蛋白沉積增加是心肌纖維化的重要評價指標，Masson 染色結果顯示HF 心肌組織膠原纖維增生，且呈網(wǎng)狀分布于心肌纖維束之間，沙庫巴曲纈沙坦可改善CHF 兔心肌纖維化程度。正常心肌組織中膠原纖維主要由成纖維細胞分泌，在CHF 等病理狀態(tài)下，成纖維細胞可增生并轉化為肌成纖維細胞，其合成細胞外基質的能力明顯提高，在心肌組織纖維化過程中發(fā)揮重要作用，α-SMA 是區(qū)分纖維細胞與肌成纖維細胞的重要分子［17］。有研究表明，應用腹主動脈環(huán)扎法建立的慢性心力衰竭大鼠模型，檢測MMP2、MMP9、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達明顯增加，并可出現(xiàn)心功能不全及心臟結構改變，提示其導致心室肌重構的機制為促進成纖維細胞增殖及膠原纖維沉積［18］。研究表明沙庫巴曲纈沙坦可改善心肌重構，降低死亡率，改善臨床預后［19］。本研究采用Western blot 技術發(fā)現(xiàn)慢性心衰兔心肌組織中MMP2、MMP9、TIMP1、TGF-β、Smad3 及Smad2 蛋白表達明顯增加，而Smad6、Smad7 蛋白表達降低；沙庫巴曲纈沙坦可明顯降低MMP2、MMP9、TGF-β、Smad3 及Smad2 蛋白表達水平，并可明顯提高Smad6 及Smad7 蛋白的表達水平。

在生理狀態(tài)下，TGF-β可提高Smad7表達水平，TGFβ/Smad 信號轉導受Smad7 負反饋調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)Smad7 蛋白表達增加，可減少由TGF-β 誘導的肌成纖維細胞分化，并可減少成纖維細胞合成膠原纖維［20］。本研究證實，在心衰組心肌組織中，TGF-β、Smad2 及Smad3 表達較假手術組明顯升高，Smad6、Smad7 表達減少，提示慢性心衰心肌組織中TGF-β/Smad 信號轉導增強，Smad7 對纖維化抑制作用減弱。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)沙庫巴曲纈沙坦可通過調節(jié)HF 心肌組織TGFβ/Smad 信號通路影響膠原纖維的沉積、降解，降低心肌纖維化，改善慢性心衰兔心室肌重構。