李馨 張瑜 倪婷婷 魯亮

貴州省人民醫(yī)院腫瘤科（貴陽550002）

卵巢癌是指起源于卵巢的惡性腫瘤，調查顯示［1］我國近10年來卵巢癌的發(fā)病率已增長30%，且仍呈增長趨勢。另有研究［2-3］顯示，約有70%的卵巢癌患者確診時已處于晚期，5年生存率低于30%。靶向治療［4-5］是指在細胞分子水平上針對明確的致癌位點設計相應的治療藥物，使其能夠特異性與致癌位點結合促使腫瘤細胞凋亡，是一種新型、高效、安全的治療技術，也是目前抗腫瘤治療研究的熱點。但是目前人們對卵巢癌發(fā)病機制仍缺乏深入的認識，對靶向治療的研究也僅僅處于起步階段。

泛素結合酶E2T（UBE2T）是泛素結合酶E2 家族中的重要成員，已有大量研究證實該分子與細胞增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［6-7］。UBE2T 可促使抑癌基因泛素化，降解抑癌基因表達的蛋白，促使惡性腫瘤細胞增殖；UBE2T 還可激活其下游的蛋白激酶B（AKT）、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1），增強二者的表達，促進細胞G1 期到S期的轉化，增強細胞增殖活性［8-9］。有實驗證實［10］采用藥物降低癌細胞UBE2T 的表達有助于抑制細胞增殖。另有研究［11］表明UBE2T 可調控三陰性乳腺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲。據此推測UBE2T基因異常表達可能參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而目前關于UBE2T 基因干擾是否可通過抑制AKT 和Cyclin D1 的表達及其生物學作用從而影響人卵巢癌細胞株SKOV3 的增殖尚未可知。故此本研究進行細胞實驗，旨在為卵巢癌靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 人卵巢癌細胞株SKOV3（北京生命科學研究所，批號：CC19011136）；慢病毒包裝質粒（美國Sigma 公司，批號：1904152A）。

1.1.2 主要試劑 AgeI 酶、EcoRI 酶（美國NEB 公司，批號：1812117、1810145）；puromycin 溶液（上海信帆生物科技有限公司，批號：1811075012）；Trizol試劑盒、蛋白抽提試劑盒（美國Thermo 公司，批號：1901145001、1902183007）；噻唑藍（MTT）試劑盒（美國Sigma公司，批號：1902138C）；鼠抗人UBE2T、AKT、Cyclin D1、p-AKT單克隆抗體、兔抗鼠UBE2T、AKT、Cyclin D1、p-AKT 多克隆抗體（酶標記）（Abcam 中國公司，批號：2018172、2019103、2019015、2019041、2019112、2019045、2019158、2019116）；UBE2T-shRNA 序列、UBE2T、AKT、Cyclin D1 引物序列均委托寶生物（大連）科技有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 EasyCycler 96 聚合酶鏈反應（PCR）儀（德國耶拿公司）；CX23 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；LWD300-38CLFT 型倒置顯微鏡（西安測維光電技術有限公司）；CFM-100A 型熒光顯微鏡（上海長方光學儀器有限公司）；CytoFLEX S 型流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、傳代、分組及干預 取人卵巢癌細胞株SKOV3 將其復蘇后置入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后離心棄去上清液，再次加入適量培養(yǎng)液并將細胞吹打均勻，移液至培養(yǎng)皿中，擰松瓶口，至于37 ℃、5%濃度二氧化碳、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 ～3 d，觀察細胞傳代情況。參照shRNA 的基本設計原則設計shRNA 序列［12］。構建UBE2T-shRNA、攜帶UBE2T、NC-shRNA 基因的慢病毒載體，將其轉染至人卵巢癌細胞株SKOV3，分別記為沉默組、轉染組、陰性對照組；并取未轉染的人卵巢癌細胞株SKOV3，記為空白對照組。每組設置3 個復孔，制成細胞懸液，細胞濃度均調整為1×105個/mL。熒光顯微鏡下觀察各組細胞轉染效率，且均用含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。

1.2.2 UBE2T 基因干擾效率鑒定 （1）采用RTqPCR 檢 測UBE2T mRNA 表達，UBE2T 引物上游：5'-TGATCGATATGCGGCGAATTAGCTAG-3'，下游：5'-CGATTAGCGGCGAGAGAGTAGCTAGC-3'，擴增片段長度：278 bp；內參β-actin 引物上游：5'-TAGCTTGGCTAGAGCTGAGC-3'，下游：5'-AGGCTAGAGCTATAGCTATG-3'，擴增片段長度：202 bp。采用Trizol 法提取細胞總RNA，提純定量，逆轉錄為cDNA。配置反應體系，包括去離子水10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，預混液（GoTaq?qPCR Master Mix）7.2 μL，共20 μL。PCR反應流程：94 ℃（2 min），40個循環(huán)：94 ℃（15 s），60 ℃（1 min），最后95 ℃（1 min）、冷卻至55 ℃。計算2-△△Ct。（2）采用Western blot 檢測UBE2T 蛋白表達：加入裂解液，提取細胞總蛋白。取40 μg 總蛋白及蛋白標志物3 μL上樣，將電泳槽置于冰上電泳。根據預染的標志物分子量在分離膠上確定目的蛋白的位置，將多余的凝膠去除，100 V 轉膜1 h。轉膜，并將一抗按照相應倍數(shù)稀釋，將轉膜后的樣品置于一抗工作液，4 ℃過夜；洗膜后置入二抗工作液中搖床孵育2 h，室溫。洗膜、化學發(fā)光，顯影、定影和分析。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察及增殖抑制率檢測 （1）各組細胞培養(yǎng)72 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化；（2）MTT 法檢測細胞增殖抑制率。向每孔中加入MTT 試劑（5 g/L）共10 μL，連續(xù)培養(yǎng)4 h后向其中加入十二烷基硫酸鈉100 μL，采用多功能微孔板測試系統(tǒng)檢測570 nm 波長處的光密度（OD）值，計算增殖抑制率=（OD對照-OD觀察）/OD對照×100.00%。

1.2.4 細胞周期檢測 采用流式細胞儀檢測細胞周期。各組細胞培養(yǎng)72 h 后收集細胞，制成單細胞懸液，取70%冰乙醇（4 ℃）固定，以滅菌的磷酸鹽緩沖液清洗、離心，撇去上清液后加入RNAase 150 μL 和碘化丙啶（PI）染液150 μL，室溫下避光染色30 min。離心，撇去上清液，以磷酸鹽緩沖液重懸后上機檢測。

1.2.5 AKT、Cyclin D1 mRNA和蛋白表達及p-AKT水平檢測 AKT、Cyclin D1 mRNA 表達檢測參照1.2.3 中RT-qPCR 步驟，其中AKT 引物上游：5'-TAGCATAGCGGCGGATAGCA-3'，下游：5'-CTAGAGCGGCGCGATACTAG-3'，擴增片段長度：246 bp，Cyclin D1 引物上游：5'-ATAGCGGCGGATAGCGGCGAGAGATC-3'，下游：5'-AAAGAGGCGGAGAGCTGCGAGAGGAG-3'，擴增片段長度：310 bp。AKT、Cyclin D1 蛋白表達及p-AKT 水平檢測參照1.2.3 中Western blot 步驟。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，比較采用方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 puromycin 最優(yōu)濃度篩選結果 將puromycin 2.0 μg/mL 作為人卵巢癌SKOV3 細胞加壓篩選的最優(yōu)濃度，見表1。

表1 人卵巢癌細胞株SKOV3 細胞對puromycin 的藥敏實驗結果Tab.1 Results of drug sensitivity test of human ovarian cancer cell line SKOV3 to puromycin ±s

表1 人卵巢癌細胞株SKOV3 細胞對puromycin 的藥敏實驗結果Tab.1 Results of drug sensitivity test of human ovarian cancer cell line SKOV3 to puromycin ±s

puromycin濃度0 μg/mL 0.5 μg/mL 1.0 μg/mL 1.5 μg/mL 2.0 μg/mL 2.5 μg/mL例數(shù)3 3 3 3 3 3 48 h細胞凋亡率（%）0 14.25±2.18 22.74±4.06 31.82±5.97 58.76±6.13 71.22±7.34 72 h細胞凋亡率（%）0 23.57±4.15 30.35±5.19 51.28±6.90 100 100

2.2 轉染率結果 陰性對照組、沉默組、轉染組熒光視野均見轉染細胞，轉染率分別為（91.06 ±8.71）%、（94.61 ± 10.55）%、（93.25 ± 11.36）%，見圖1。

圖1 各組細胞熒光圖（×200）Fig.1 Cell fluorescence diagram of each group（×200）

2.3 UBE2T 基因干擾效率鑒定結果 轉染組UBE2T mRNA 及蛋白表達均高于其余3 組（P＜0.05），沉默組UBE2T mRNA 及蛋白表達均低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05），見表2。

表2 各組UBE2T mRNA 及蛋白表達對比Tab.2 Comparison of UBE2T mRNA and protein expressions in each group ±s

表2 各組UBE2T mRNA 及蛋白表達對比Tab.2 Comparison of UBE2T mRNA and protein expressions in each group ±s

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與陰性對照組比較，bP ＜0.05；與沉默組比較，cP ＜0.05

組別空白對照組陰性對照組沉默組轉染組F 值P 值例數(shù)3 3 3 3 UBE2T mRNA 表達1.43±0.21 1.40±0.20 0.55±0.07ab 1.69±0.31abc 32.506＜0.001 UBE2T 蛋白表達1.02±0.15 0.98±0.16 0.27±0.05ab 1.73±0.33abc 21.228＜0.001

2.4 各組細胞形態(tài)學變化 空白對照組、陰性對照組、轉染組均可見細胞連接緊密，聚集片狀生長，透光性良好；沉默組可見細胞呈圓形或類圓形，排列紊亂，形態(tài)多變，相對分散，細胞內顆粒感增強，透光性差，細胞間界限模糊且存活細胞少，見圖2。

圖2 各組細胞形態(tài)學變化（倒置相差顯微鏡，×200）Fig.2 Morphological changes of cells in each group（inverted phase contrast microscope，×200）

2.5 各組細胞增殖抑制率對比 空白對照組、陰性對照組、沉默組、轉染組細胞增殖抑制率分別為0、（0±0.01）%、（38.71±9.15）%、（-32.56±6.13）%，沉默組均高于其余3 組（P＜0.05），轉染組低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。

2.6 各組細胞周期觀察對比 沉默組G1 期高于其余3 組（P＜0.05），S 期和G2 期均低于其余3 組（P＜0.05），轉染組G1 期低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），S 期和G2 期均高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），見圖3、表3。

圖3 各組細胞周期流式細胞儀檢測Fig.3 Cell cycle detection by flow cytometry in each group

表3 各組細胞周期對比Tab.3 Comparison of cell cycle in each group±s

表3 各組細胞周期對比Tab.3 Comparison of cell cycle in each group±s

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與陰性對照組比較，bP ＜0.05；與沉默組比較，cP ＜0.05

組別空白對照組陰性對照組沉默組轉染組F 值P 值例數(shù)3 3 3 3 G1 37.63±6.82 39.85±5.71 69.65±7.88ab 28.45±4.68abc 49.173＜0.001 S 49.63±8.51 51.88±9.02 24.69±4.51ab 54.68±10.12abc 41.205＜0.001 G2 13.50±2.41 12.75±2.57 6.05±1.08ab 16.87±3.05abc 8.195 0.001

2.7 各組細胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表達和AKT、Cyclin D1 蛋白表達及p-AKT 對比 沉默組細胞AKT、Cyclin D1 mRNA 及蛋白表達，p-AKT水平均低于其余3 組（P＜0.05），轉染組AKT、Cyclin D1 mRNA 及蛋白表達，p-AKT 水平均高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），見表4。

表4 各組細胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表達、AKT、Cyclin D1 蛋白表達及p-AKT 對比Tab.4 Comparison of Akt and cyclin D1 mRNA expressions，Akt，cyclin D1 proteins and p-Akt levels in cells of each group±s

表4 各組細胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表達、AKT、Cyclin D1 蛋白表達及p-AKT 對比Tab.4 Comparison of Akt and cyclin D1 mRNA expressions，Akt，cyclin D1 proteins and p-Akt levels in cells of each group±s

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與陰性對照組比較，bP ＜0.05；與沉默組比較，cP ＜0.05

組別空白對照組陰性對照組沉默組轉染組F 值P 值例數(shù)3 3 3 3 AKT 1.22±0.24 1.24±0.25 0.83±0.12ab 1.36±0.28abc 27.168＜0.001 Cyclin D1 1.17±0.23 1.14±0.26 0.56±0.09ab 1.42±0.26abc 22.305＜0.001 AKT 蛋白1.28±0.24 1.31±0.26 0.69±0.11ab 1.65±0.3abc 49.865＜0.001 Cyclin D1 蛋白0.72±0.11 0.76±0.13 0.38±0.05ab 1.03±0.22abc 28.763＜0.001 p-AKT 0.32±0.05 0.30±0.04 0.17±0.03ab 1.18±0.24abc 7.502 0.002

3 討論

本研究通過構建UBE2T-shRNA 載體并以慢病毒包裝可整合進入基因組并保持長效轉染，還轉染攜帶UBE2T 基因的質粒介導人卵巢癌細胞株SKOV3 基因轉染從而實現(xiàn)UBE2T 的基因干擾。此外，本研究經不同濃度的puromycin 作用于人卵巢癌細胞株SKOV3，發(fā)現(xiàn)細胞加壓篩選的最優(yōu)濃度為2.0 μg/mL，為后期獲得高轉染率奠定了基礎。本研究陰性對照組、沉默組和轉染組的轉染率均較高，提示獲得了穩(wěn)定表達株；沉默組UBE2T mRNA 與蛋白表達均顯著低于其余3 組，且轉染組UBE2T mRNA 與蛋白表達均顯著高于空白對照組和陰性對照組，表明前期工作已順利完成。

本研究發(fā)現(xiàn)UBE2T 基因沉默可促使人卵巢癌細胞株SKOV3 發(fā)生形態(tài)學改變，抑制其增殖，且主要是通過阻滯細胞從G1 期向S 期分化實現(xiàn)此作用的；而UBE2T 基因轉染則可起反作用。UBE2T 屬于泛素蛋白酶降解系統(tǒng)，可參與細胞信號傳導、細胞周期調控、細胞增殖和凋亡等［13］。有實驗報道顯示［14］，UBE2T 基因轉上調人結直腸癌細胞株中UBE2T 蛋白表達發(fā)現(xiàn)其水平升高，同時細胞的增殖能力增強，本研究結果與其具有一致性；此外，有研究［15］利用si-UBE2T 載體沉默鼻咽癌細胞系5-8F 細胞中UBE2T 蛋白表達可降低OD值，同時還可減弱細胞遷移與侵襲能力，本研究報道與其相符；另有臨床研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中UBE2T 蛋白表達高于癌旁正常組織，且與臨床分期等密切相關［16］。

本研究表明UBE2T 基因沉默很可能是通過下調AKT、Cyclin D1 mRNA 與蛋白表達和p-AKT 水平實現(xiàn)抑制人卵巢癌細胞株SKOV3 增殖，抑制G1 期向S 期分化的；而UBE2T 基因轉染的作用正相反。有研究表明［17］，UBE2T 是泛素傳遞網絡中的關鍵，可通過經典的信號調控通路影響惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。CHEN 等［18］報道顯示，UBE2T 基因高表達與癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關。AKT 和Cyclin D1 均位于UBE2T 的下游，二者在細胞存活、增殖與凋亡過程中均有重要的調控作用［19］。有報道［20］發(fā)現(xiàn)，UBE2T可正向調控AKT的表達，沉默UBE2T基因表達可下調后者的表達，同時還可降低p-AKT 水平，推測可通過此途徑抑制惡性腫瘤細胞增殖。本研究結果與上述報道和分析均一致。

綜上所述，UBE2T 基因沉默可抑制人卵巢癌細胞株SKOV3 增殖和G1 期向S1 期分化，推測是通過抑制UBE2T、AKT、Cyclin D1 mRNA 與蛋白表達和p-AKT 水平實現(xiàn)此作用的。但沉默UBE2T 是否能夠對體內接種SKOV3 腫瘤生長產生抑制作用尚不清楚，且調控UBE2T 基因是如何調控其下游的AKT、Cyclin D1 表達的尚未闡明，后期仍需要進一步探討。