羅萍 王效惠 向軍英 劉哲

成都大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（成都610081）

作為革蘭氏陰性菌的幽門螺桿菌（H.pylori）是第一個被正式認(rèn)可的細(xì)菌致癌物，感染了世界上大約44 億（59%）的人口［1］。慢性感染產(chǎn)生炎癥狀態(tài)，但在大多數(shù)受試者中是無癥狀的［2］。然而，在一部分幽門螺桿菌感染人群中，胃部炎癥可能演變?yōu)槁晕秆?、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌［3-5］。簡而言之，幽門螺桿菌定植的階段如下：穿過胃黏液層，黏附到胃上皮，然后在避免被宿主免疫反應(yīng)擊敗的同時獲得營養(yǎng)。對于一些幽門螺桿菌定植/毒力因子，已經(jīng)提出其在炎癥發(fā)展和對宿主免疫系統(tǒng)的影響中的特定作用［6］。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些宿主因素與幽門螺桿菌感染的起源（慢性胃炎癥）和隨后的病理結(jié)果有關(guān)［7］。因此，細(xì)菌作用和宿主反應(yīng)都參與發(fā)病機(jī)制。宿主-病原體共同適應(yīng)導(dǎo)致幽門螺桿菌定植，在大多數(shù)情況下可能保持無害；然而，病原體和宿主的特定基因型的同時發(fā)生可能會導(dǎo)致嚴(yán)重病理的發(fā)展［8］。盡管自發(fā)現(xiàn)H. pylori以來已經(jīng)提供了大量的臨床和實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，但仍需要進(jìn)一步了解宿主-病原體相互作用的機(jī)制以及導(dǎo)致對這種病原體獲得保護(hù)性免疫的機(jī)制的證據(jù)，以指導(dǎo)和制定有效對抗幽門螺桿菌。宿主-微生物相互作用是健康和疾病的基本組成部分［9］。維持人類與微生物組之間健康共生狀態(tài)的一個關(guān)鍵參數(shù)是微生物群產(chǎn)生獨(dú)特的代謝物，這些代謝物既為宿主提供營養(yǎng)，也參與免疫發(fā)育的調(diào)節(jié)［10］。然而，關(guān)于H. pylori代謝物是否調(diào)控宿主炎癥因子的分泌尚不清晰?；诖耍狙芯恐荚谔接慔.pylori代謝產(chǎn)物參與調(diào)控宿主炎癥因子的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 幽門螺桿菌菌株H. pyloriSS1 獲贈于中科院微生物所。大腸桿菌E.Coli購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司（貨號：BC102-03）。C57BL/6小鼠購自廣州銳格生物科技有限公司（貨號：C570005）。布魯氏菌肉湯購自ELITE-MEDIA 公司（貨號：M1070-01）。RPMI1640 培養(yǎng)基購自維森特生物技術(shù)（南京）有限公司（貨號：350-000-CL*10）。人胃癌細(xì)胞AGS 購自北京欣盛百泰科技有限公司（貨號：CL0031）。廣州一科生物科技有限公司購自（貨號：BS7772）。腺苷檢測試劑盒購自上海群己生物科技有限公司（貨號：KA4547）?？褂拈T螺桿菌免疫球蛋白（IgG）檢測試劑盒購自北京科瑞美科技有限公司（貨號：QS440220-48T）。人IL-33檢測試劑盒購自深圳市文樂生物科技有限公司（貨號：JL19282）。人TNF-α檢測試劑盒購自北京江晨文軒生物科技有限責(zé)任公司（貨號：JL10208-1）。人IFN-γ 檢測試劑盒購自北京江晨文軒生物科技有限責(zé)任公司（貨號：JL28106-1）。鼠IL-33 檢測試劑盒購自廣州徠智生物科技有限公司（貨號：2MKMLJM219447m）。鼠TNF-α 檢測試劑盒購自昆明皇寶商貿(mào)有限公司（貨號：ml002098-96T（JK））。鼠IFN-γ 檢測試劑盒購自Elabscience 公司（貨號：E-EL-SR001）。SiGFP、siA2AR 由南京金斯瑞設(shè)計(jì)和合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與感染 幽門螺桿菌菌株SS1是一種適應(yīng)小鼠的人類分離物，用于所有實(shí)驗(yàn)。H. pyloriSS1 的甘油原液首先在5%羊血瓊脂平板上在微需氧條件下生長2 d。平板培養(yǎng)后，H.pyloriSS1 在5%FCS 的布魯氏菌肉湯中在37 ℃微需氧條件下溫和攪拌培養(yǎng)14 ～16 h。人胃癌細(xì)胞AGS 維持在補(bǔ)充有10%滅活FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基中。AGS 細(xì)胞血清饑餓16 h，然后以200∶1 的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染幽門螺桿菌。當(dāng)AGS 細(xì)胞感染H.pylori或E.Coli時，它們的融合水平為60% ～70%。感染后幾乎細(xì)胞附著在細(xì)胞培養(yǎng)皿上，并且與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)量也沒有減少，因此判斷MOI 為200∶1 的H.pylori感染后的對AGS 細(xì)胞的增殖無顯著影響。本研究均使用lipo3000 進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)染。

1.2.2 幽門螺桿菌菌株SS1感染小鼠H.pyloriSS1由平板和液體培養(yǎng)物制備。每周3 次，在400 μL 5% FCS/布魯氏菌肉湯中給C57BL/6 小鼠口服3 ×108CFU 的H.pyloriSS1，持續(xù)4 周。

1.2.3 液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜鑒定幽門螺桿菌菌株SS1 的代謝物 對H.pyloriSS1 感染AGS 細(xì)胞后的上清進(jìn)行3 KDa 過濾器的過濾，收集濾液液進(jìn)行LC/MS 分析。LC/MS 測量使用配備兩個LC-30AD泵、DGU-20A5 脫氣機(jī)、SIL-30AC 自動進(jìn)樣器、CTO-20AC 柱溫箱和 一個CBM-20A 控制模塊，連接到LCMS-8040 三重四極桿質(zhì)譜儀。ChromaTOF 2.32版用于數(shù)據(jù)預(yù)處理，無需平滑、3 s 峰寬、略高于噪聲水平的基線減法，以及在整個色譜圖中以5∶1的信號/噪聲水平進(jìn)行自動質(zhì)譜去卷積和峰檢測。定點(diǎn)質(zhì)量被報告用于BinBase 算法。結(jié)果以txt 文件形式導(dǎo)出到數(shù)據(jù)服務(wù)器，并由代謝組學(xué)BinBase數(shù)據(jù)庫中實(shí)施的過濾算法進(jìn)一步處理。BinBase算法（rtx5）使用以下設(shè)置：色譜圖的有效性（＜10 個峰，強(qiáng)度＞107 個計(jì)數(shù)s-1），無偏保留指數(shù)標(biāo)記檢測（MS 相似性＞800，高m/z 標(biāo)記離子強(qiáng)度范圍的有效性），并通過5 階多項(xiàng)式回歸計(jì)算保留指數(shù)。使用以下匹配過濾器將光譜切割至5%的基峰豐度并從最高到最低豐度光譜與數(shù)據(jù)庫條目匹配：保留指數(shù)窗口，±2 000 單位（相當(dāng)于約±2 s 保留時間）；驗(yàn)證獨(dú)特的離子和頂點(diǎn)質(zhì)量（獨(dú)特的離子必須包含在頂點(diǎn)質(zhì)量中，并且以＞3% 的基峰豐度存在）；和質(zhì)譜相似性必須符合取決于峰純度和信噪比以及最終異構(gòu)體過濾器的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 抽取處理后小鼠尾靜脈血清或者細(xì)胞上清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測腺苷、抗幽門螺桿菌免疫球蛋白（IgG）、IL-33、TNF-α、IFN-γ 的水平。

1.2.5 腺苷合成酶敲除株H.pyloriΔAdA菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證 使用Red/ET方法［11］在H.pyloriSS1菌株中構(gòu)建AdA缺失編碼的菌株H.pyloriΔAdA。H.pyloriSS1通過電轉(zhuǎn)染PSQ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，攜帶PSQ 的H. pyloriSS1 細(xì)胞能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化靶向目標(biāo)基因組基因座的重組DNA 片段。通過PCR 后瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)AdA 被敲除，引物序列：AdA-F：5'-GGAGACCAGCGATATCCACG-3'、AdA-R：5'-ATGCGAGTCAGACCGTTGTT-3'、GAPDH-F：5'-CTGCCGCTAACGCAGAAATC-3'、GAPDH-R：5'-CCATAGACAAAGGTGGGCGT-3'。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Student'st檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺旋桿菌代謝物抑制炎癥因子分泌E.Coli或H. pylori感染后，人胃癌細(xì)胞AGS 中IL-33、TNFα、IFN-γ 的分泌水平上升。相比于感染E.Coli，感染H. pylori的AGS 細(xì)胞分泌的IL-33、TNF-α、IFN-γ的水平較低，見圖1A-C。H. pylori感染AGS 細(xì)胞24 h后，將收取細(xì)胞上清進(jìn)行3 kDa過濾器過濾，濾液為＜3 kDa 的分子（一般為代謝物），未過完3 kDa過濾器的液體為＞3 kDa的分子（一般為蛋白，圖1D），將這些組分處理E.Coli刺激過的AGS 細(xì)胞16 h后，發(fā)現(xiàn)小于3 kDa的分子能夠降低IL-33、TNF-α、IFN-γ的分泌水平，見圖1E-G。

圖1 幽門螺旋桿菌代謝物抑制炎癥因子分泌Fig.1 Helicobacter pylori metabolites inhibit the secretion of inflammatory factors

2.2 腺苷抑制炎癥因子分泌E.Coli或H. pylori感染AGS 細(xì)胞24 h 后，將收取細(xì)胞上清進(jìn)行液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜鑒定H.pylori的代謝物，發(fā)現(xiàn)多種代謝物的表達(dá)水平存在差異，見圖2A。將上述代謝物小分子以5 μmol/L 的濃度進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)腺苷能夠影響IL-33 的分泌水平，見圖2B。此外，腺苷降低IL-33、TNF-α、IFN-γ 的分泌水平存在梯度依賴效應(yīng)，見圖2C-E。

圖2 腺苷抑制炎癥因子分泌Fig.2 Adenosine inhibits the secretion of inflammatory cytokines

2.3 腺苷合成酶/腺苷/A2A 受體軸調(diào)控炎癥因子分泌 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫blast 功能發(fā)現(xiàn)H. pylori存在腺苷合成酶（NCBI Reference Sequence：WP_078247416.1），見圖3A。構(gòu)建腺苷合成酶敲除株H. pyloriΔAdA菌株，見圖3B。H.pyloriΔAdA感染后，AGS細(xì)胞的腺苷水平無顯著改變，見圖3C。此外，H.pyloriΔAdA感染后，AGS細(xì)胞中IL-33、TNF-α、IFN-γ的分泌水平均比H. pyloriWT感染的AGS 細(xì)胞高，見圖3D-F。A2A 受體是腺苷調(diào)控下游分子的關(guān)鍵［12］，敲低A2A 受體后，H. pylori感染的AGS 細(xì)胞IL-33、TNF-α、IFN-γ的分泌水平上升，見圖3G-I。

圖3 腺苷合成酶/腺苷/A2A 受體軸調(diào)控炎癥因子分泌Fig.3 Adenosine synthase/adenosine/A2A receptor axis regulates the secretion of inflammatory cytokines

2.4 幽門螺旋桿菌腺苷合成酶調(diào)控小鼠免疫反應(yīng)H.pyloriΔAdA或H.pyloriWT感染小鼠4周后，與Mock組比較，H. pyloriWT感染和H. pyloriΔAdA感染胃組織出現(xiàn)囊性擴(kuò)張，排列不規(guī)則和炎癥細(xì)胞浸潤，說明感染后胃組織有炎癥發(fā)生見圖4A。另外，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中的IL-33、TNF-α、IFN-γ 的水平均上升。相比于H.pyloriWT感染，H.pyloriΔAdA感染后小鼠血清中的IL-33、TNF-α、IFN-γ 的水平上升更明顯，見圖4B-D。此外，相比于H.pyloriWT感染，H.pyloriΔAdA感染后小鼠產(chǎn)生的抗幽門螺旋桿菌抗體的滴度上升，見圖4E。

圖4 幽門螺旋桿菌腺苷合成酶調(diào)控小鼠免疫反應(yīng)Fig.4 Helicobacter pylori adenosine synthase regulates the immune response in mice

3 討論

H.pylori感染會引起多種胃腸道疾病，如無癥狀慢性胃炎、消化性潰瘍病、胃腺癌和胃淋巴瘤，以及相關(guān)的分子機(jī)制在對宿主和細(xì)菌的研究中開始闡明這些疾病的基礎(chǔ)［13］。然而，很少有研究使用代謝組分析評估幽門螺桿菌感染產(chǎn)生的代謝物。在一項(xiàng)研究中，從已感染幽門螺桿菌（一種已知可在沙鼠中長期適應(yīng)的臨床分離物）的沙鼠中收集尿液，并使用質(zhì)子核磁分析尿液中的代謝物共振光譜法［14］。此外，研究表明，幽門螺桿菌感染會改變腸道微生物群，如微生物相關(guān)代謝物的變化所示［15］。然而，幽門螺桿菌的代謝物如何影響宿主并實(shí)現(xiàn)免疫逃逸尚未明確。本研究通過代謝組學(xué)和遺傳學(xué)操作鑒定了幽門螺桿菌代謝物腺苷對炎癥因子IL-33、TNF-α、IFN-γ 的分泌水平的影響。

此前，有研究基于代謝物譜評估了幾種代謝途徑，包括糖酵解途徑、TCA 循環(huán)、膽堿途徑、尿素循環(huán)、谷胱甘肽循環(huán)、嘌呤途徑、嘧啶途徑和氨基酸代謝，并在一些中觀察到H.pylori感染誘導(dǎo)的改變宿主代謝途徑［16］。本研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染后，AGS 細(xì)胞中腺苷水平顯著上升。腺苷具有免疫抑制特性，并且與癌癥發(fā)展有關(guān)。因此，H. pylori可能通過代謝物腺苷參與宿主免疫逃逸。

本研究鑒定并表征了H.pylori的腺苷合成酶，一種具有5'-核苷酸酶特征序列的H. pylori細(xì)胞壁錨定蛋白。構(gòu)建腺苷合成酶敲除株H. pyloriΔAdA菌株，發(fā)現(xiàn)H. pyloriΔAdA感染后，AGS 細(xì)胞的腺苷水平無顯著改變。此外，H. pyloriΔAdA感染后，AGS 細(xì)胞中IL-33、TNF-α、IFN-γ 的分泌水平均比H. pyloriWT感染的AGS 細(xì)胞高。此外，相比于H.pyloriWT感染，H. pyloriΔAdA感染后小鼠產(chǎn)生的抗幽門螺旋桿菌抗體的滴度上升。因此，腺苷合成酶是感染期間腺苷合成所必需的，并且此蛋白有助于H.pylori在動物體內(nèi)存活。

A2A 受體是腺苷調(diào)控下游分子的關(guān)鍵，敲低A2A 受體后，H. pylori感染的AGS 細(xì)胞IL-33、TNFα、IFN-γ 的分泌水平上升。有研究發(fā)現(xiàn)腺苷能夠與A2A 受體結(jié)合并且調(diào)控NF-κB 通路，抑制細(xì)胞因子的表達(dá)［17］。但是本研究僅檢測了細(xì)胞因子的分泌水平，其表達(dá)水平是否受到了調(diào)控值得進(jìn)一步探討。并且，本研究仍然具有一定的局限性，腺苷合成酶/腺苷/A2A 受體調(diào)控軸是在細(xì)胞水平中鑒定的，其是否在動物水平也發(fā)揮相同的作用值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，H. pylori表達(dá)的腺苷合成酶能夠促進(jìn)腺苷的產(chǎn)生，隨后腺苷通過A2A 受體調(diào)控炎癥因子IL-33、TNF-α、IFN-γ 的分泌，并且降低適應(yīng)性免疫水平。腺苷合成酶/腺苷/A2A 受體可能是對抗幽門螺桿菌的潛在靶點(diǎn)。