王印寶，吳 帆，肖劉華，彭文文，陳 明，陳金印，2，向妙蓮*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西 南昌 330045；2.萍鄉(xiāng)學(xué)院，江西 萍鄉(xiāng) 337055）

【研究意義】柑橘是世界上重要的栽培果樹，我國是柑橘生產(chǎn)大國[1]，但柑橘果實采后腐爛嚴(yán)重，每年采后腐爛率高達(dá)30%左右[2]。贛南臍橙是江西贛州國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，年產(chǎn)量達(dá)百萬噸。由意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病是贛南臍橙果實采后腐爛的主要原因，給贛南臍橙產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前主要通過化學(xué)殺菌劑控制該病害，但長期使用殺菌劑導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和果品農(nóng)藥殘留，進(jìn)而帶來危及人體健康和環(huán)境污染等潛在問題。因此尋求安全高效、綠色環(huán)保的防治方法成為研究贛南臍橙采后貯藏保鮮的熱點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物誘導(dǎo)抗病性（induced resistance）因其抗病周期長、不污染環(huán)境等優(yōu)點，為果蔬采后病害防治提供了一條新途徑[3]。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）廣泛存在于多種高等植物中，外源應(yīng)用能夠激發(fā)植物防御相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性，已成為果蔬采后病害防治研究的重要研究對象。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，MeJA 處理可以有效控制采后柑橘果實綠霉病[4]以及番茄[5]和葡萄灰霉病[6-7]，誘導(dǎo)檸檬[8]和蘋果[9]果實防御酶活性的增加。同時，MeJA 通過緩解活性氧積累，有效減輕葡萄[10]和甜瓜[11]等果實貯藏病害的發(fā)生，提高果實貯藏品質(zhì)。此外，Cao 等[12]表明MeJA 可減少枇杷炭疽病的發(fā)生，與其提高枇杷果實中β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性緊密相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關(guān)MeJA 誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病的報道較少。本課題組在前期預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)MeJA 在調(diào)控臍橙果實抗青霉病中發(fā)揮重要作用，但MeJA 誘導(dǎo)抗病與臍橙果實防御酶活性關(guān)系需進(jìn)一步探索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以‘紐荷爾’臍橙為試驗材料，采用MeJA 熏蒸處理后接種P.italicum，測定臍橙果實病斑直徑及其過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和病程相關(guān)蛋白酶活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量變化，探討MeJA 誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病的效應(yīng)及生理機(jī)制，為臍橙果實采后病害控制提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗用果‘紐荷爾’臍橙果實，于2020 年11 月12 日采自江西省贛州市南康縣龍回鎮(zhèn)，次日運(yùn)回實驗室。選出大小均勻、成熟度一致并無病蟲害和機(jī)械損傷的果實作為試驗用果。先用自來水清洗，再用0.05%次氯酸鈉溶液浸洗5 min，最后自來水沖洗干凈。室溫下晾干后保鮮袋單果套袋，入庫備用（冷庫溫度5～6 ℃）。

1.1.2 病原菌 意大利青霉（P.italicum）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室提供。P.italicum從典型臍橙發(fā)病果實中分離，用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行單孢純化培養(yǎng)。試驗前于恒溫箱（25±1 ℃）培養(yǎng)5～7 d，用無菌水洗脫孢子，經(jīng)滅菌脫脂棉過濾后，配置濃度為1.25×106spores/mL孢子懸浮液，備用。

1.1.3 MeJA和水楊苷異羥肟酸 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate）95%，購自Sigma公司。稱量224.3 mg茉莉酸甲酯，先用少許二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，再逐滴加入0.1% Tween-80 使其混合均勻，最后溶解在無菌蒸餾水中，定容至100 mL，配制濃度10 mmol/L，于4 ℃保存，使用時稀釋至所需濃度。水楊苷異羥肟酸（salicyhydroxamic acid，SHAM，茉莉酸生物合成抑制劑）購自Sigma 公司。稱取1.516 mg純度99%的SHAM，加入無菌蒸餾水并定容至100 mL，配制濃度為100 μmol/L，待用。

1.2 抑菌活性測定

采用牛津杯法測定MeJA 對青霉病菌（P.italicum）的抑制作用。取1.1.2中濃度為1.25×106spores/mL青霉孢子懸浮液6 mL，加入到54 mL溫度約45 ℃左右PDA培養(yǎng)基中搖勻，均勻倒入3個無菌培養(yǎng)皿制成含青霉菌平板。待平板凝固后，在培養(yǎng)皿中心放置直徑為7 mm的無菌牛津杯，依次取100 μL濃度為25，50，100，500，1 000 μmol/L、經(jīng)0.22 μm細(xì)菌微孔濾膜過濾的MeJA溶液注入牛津杯中，每個處理重復(fù)3次，置于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱。采用十字交叉法逐日測量抑菌圈直徑，對照組用含0.1%Tween-80等量無菌水。

1.3 MeJA誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病的效應(yīng)

1.3.1 最佳誘導(dǎo)濃度篩選 取1.1.1 中臍橙果實于6 L 熏蒸盒中，中央放置滅菌培養(yǎng)皿，分別滴加95%MeJA原液34.4，68.8，137.6，688.0，1 376.0 μL，使熏蒸盒內(nèi)MeJA濃度依次為25，50，100，500，1 000 μmol/L，20 ℃下熏蒸處理果實。另設(shè)100 μmol/L 的SHAM 噴施，對照用無菌蒸餾水，24 h后于超凈工作臺上通風(fēng)1 h 后接種。用接種針在果實赤道部等距離刺傷，傷口大小為直徑1 mm，深度3 mm。注入濃度為1.25×106spores/mL的P.italicum孢子懸浮液20 μL，逐日記錄果實發(fā)病情況，每處理10個果實，3次重復(fù)。采用十字交叉法測量病斑直徑，按以下公式計算誘導(dǎo)效果：

1.3.2 有效持續(xù)時間篩選 采用1.3.1中最佳濃度MeJA在20 ℃下分別熏蒸0，12，24，36，48 h，其它步驟同上。

1.4 酶活性測定

1.4.1 果實取樣 接種前24 h 用50 μmol/L MeJA 于密閉熏蒸盒中熏蒸臍橙果實，另設(shè)100 μmol/L 的SHAM 噴施和無菌蒸餾水熏蒸。每處理20 個果實，3 次重復(fù)，方法同1.3.1。接種后0，12，24，36，48，60 h取病健交界處組織5 g，磨碎后液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存待用。

1.4.2 過氧化物酶（POD）活性的測定 根據(jù)曹建康等[13]方法稍加改進(jìn)，其活性單位為每克樣品每分鐘在吸光度470 nm處吸光度增加0.01。按該計算公式計算POD活性：U=（OD470*V）（/Vs*m）。

1.4.3 多酚氧化酶（PPO）活性的測定測定 PPO 采用鄰苯二酚法其活性單位為在吸光度420 nm 條件下每克樣品每分鐘增加0.01。按該計算公式計算PPO活性：U=（ΔOD420*V）（/Vs*m）。

1.4.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 SOD 活性采用試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司，南京，中國）測定；每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位（U）。

1.4.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定 APX活性采用紫外比色法測定[13]。每克樣品（FW）APX酶促反應(yīng)體系在290 nm 處OD 值降低0.01 為1 個APX 活性單位，單位是ΔOD290/min·g。計算公式：U=（ΔOD290*V）（/0.01*Vs*W）。

1.4.6 過氧化氫酶（CAT）活性測定 CAT 活性參考李合生方法[14]稍加改進(jìn)，在吸光度240 nm 處每30 秒記錄一次數(shù)據(jù)，其活性單位為每克樣品每分鐘吸光度變化0.01。按該計算公式計算CAT 活性：U=（ΔOD240*V）（/0.01*Vs*W）。

1.4.7 丙二醛（MDA）含量的測定 MDA含量用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[15]測定，計算公式為：MDA濃度（μmol/L）=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450，求樣品的MDA 濃度，MDA 含量=MDA 濃度×提取液體積/植物組織FW，MDA單位為μmol/g。

1.4.8 幾丁質(zhì)酶（CHI）的活性測定 CHI活性測定采用試劑盒（Solarbio，北京，中國）測定。

1.4.9 β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性測定 GLU活性測定采用試劑盒（Solarbio，北京，中國）測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2018軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計整理，并用SPSS 20.0和DPS 9.50軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，用Duncan’s新復(fù)極差法來比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對P.italicum的抑菌活性

接種5 d后觀察比較培養(yǎng)皿中央牛津杯周圍抑菌圈大小。如圖1所示，與對照相比，25，50，100，500，1 000 μmol/L MeJA處理對P.italicum生長均無直接抑制作用。

圖1 不同濃度MeJA對P.italicum的抑菌效果Fig.1 Inhibition effect of different concentrations of MeJA on P.italicum

2.2 MeJA誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病的效應(yīng)

2.2.1 MeJA 不同熏蒸濃度處理誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病效應(yīng) 由圖2可知，與對照相比，50 μmol/L MeJA熏蒸處理臍橙果實，接種后第8天病斑直徑顯著降低，誘導(dǎo)效果最佳，達(dá)20.87%。其它濃度100，25，200，500和1 000 μmol/L MeJA誘導(dǎo)效果依次為11.53%、8.20%、6.10%、4.60%和4.10%。

圖2 MeJA不同熏蒸濃度處理下誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病效應(yīng)Fig.2 Effect of MeJA under different fumigation concentration treatments inducing resistance to blue mold in navel orange fruits

2.2.2 50 μmol/L MeJA 不同熏蒸時間處理誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病效應(yīng) 由圖3可知，與對照相比，接種前臍橙果實經(jīng)MeJA熏蒸處理24 h和36 h誘導(dǎo)效果較好。接種后第4～10天均高于熏蒸12 h和48 h，其中接種后第4 天，熏蒸24 h 和36 h 誘導(dǎo)效果最佳，為27.11%和26.68%，高于熏蒸12 h 和48 h 誘導(dǎo)效果11.52%和3.66%（P＜0.05）。

圖3 MeJA不同熏蒸時間處理誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病效應(yīng)Fig.3 Effects of MeJA under different fumigation concentrations inducing navel orange against blue mold

2.3 MeJA處理對臍橙果實防御酶活性和MDA含量的影響

2.3.1 MeJA 處理后臍橙果實防御酶活性的動態(tài)變化 如圖4A 所示，MeJA 處理臍橙果實POD 活性隨時間增加先升高后下降，且始終高于對照組。接種24 h后，MeJA 處理組POD活性開始達(dá)到峰值，依次高于對照組和SHAM處理組12.58%和45.3%（P＜0.05）。PPO活性如圖4B所示，接種36 h內(nèi)MeJA處理組活性始終高于對照組和SHAM 處理組，接種后0～12 h，MeJA 處理組活性顯著高于對照組和SHAM 處理組，分別為對照組和SHAM 處理組的2.64和2.09倍（P＜0.05）。MeJA 處理后臍橙果實SOD 活性變化見圖4C，接種24 h 后SOD 活性最強(qiáng)，顯著高于對照組和處理組，在48 h，MeJA 處理組SOD 活性依次高于對照組和SHAM 處理組22.86%和87.25%。APX活性如圖4D所示，MeJA 處理組始終高于對照組和SHAM 處理組，在接種60 h，MeJA 處理組APX 活性達(dá)到峰值，分別高于對照組和SHAM 處理組44.03%和58.03%，差異顯著（P＜0.05）。從圖4E中可知，MeJA處理組的CAT酶活性始終高于對照組和SHAM處理組，接種后36 h達(dá)到峰值，分別為對照組和SHAM處理組CAT酶活性的1.13和1.22倍。

圖4 MeJA處理對臍橙果實POD、PPO、SOD、APX和CAT活性的影響Fig.4 Effect of MeJA treatment on POD，PPO，SOD，APX and CAT activities in navel orange fruits

2.3.2 MeJA處理后臍橙果實MDA含量的動態(tài)變化 MDA含量如圖5 所示，MeJA 處理組MDA 含量在0～36 h 高于處理組；接種后60 h，MeJA組MDA含量依次低于SHAM組和對照組29.3%和35.1%。

圖5 MeJA處理對臍橙果實MDA含量的影響Fig.5 Effect of MeJA treatment on MDA contents of navel orange fruits

2.3.3 MeJA處理后臍橙果實病程相關(guān)蛋白活性的動態(tài)變化如圖6A 所示，接種60 h內(nèi)臍橙果實MeJA 處理組CHI活性高于對照組和SHAM 處理組。接種后0～48 h后MeJA處理組CHI活性均顯著高于對照組和SHAM 處理組，其中接種后12 h CHI活性最高為0.89 U/g（P＜0.05）。GLU 活性變化如圖6B 所示，MeJA 處理組GLU 活性在24～60 h 內(nèi)始終維持較高水平，接種后48 h 達(dá)到峰值，分別為對照組和SHAM處理組的1.28和1.53倍，差異顯著（P＜0.05）。

圖6 MeJA處理對臍橙果實CHI和GLU活性的影響Fig.6 Effect of MeJA treatment on CHI（A）and GLU（B）activities in navel orange fruits

3 討論與結(jié)論

誘導(dǎo)抗病是植物在自然生長環(huán)境中受到外界誘導(dǎo)因子刺激后，抵御病原侵染及逆境脅迫時自身發(fā)展出的一種抗病機(jī)制[16]。MeJA廣泛存在于植物體中，作為誘導(dǎo)植物抗病性的重要外源信號物質(zhì)，其作用可將植物信號傳遞到逆境環(huán)境中，提高植物抗逆反應(yīng)[17]。本試驗抑菌活性測定發(fā)現(xiàn)25～1 000 μmol/L Me-JA對青霉病菌（P.italicum）均無直接抑制作用，而在接種前采用MeJA熏蒸處理臍橙果實12～48 h后可減小青霉病斑直徑。說明外源MeJA 減輕臍橙果實釆后青霉病可能是通過誘導(dǎo)提高果實自身的免疫反應(yīng)而非直接抑菌作用。其中，50 μmol/L MeJA 熏蒸處理臍橙果實24 h能顯著抑制青霉病斑擴(kuò)展，誘導(dǎo)效果最佳為27.11%。該結(jié)果與MeJA 誘導(dǎo)辣椒抗青枯病[18]、水稻抗細(xì)菌條斑病[19]以及紅小豆抗銹病[20]等研究結(jié)果類似。而盤柳依等[21]發(fā)現(xiàn)用10.0 mmol/L MeJA 對采后獼猴桃軟腐病菌的抑菌率達(dá)100%，且在果實接種前用0.1 mmol/L MeJA熏蒸處理24 h誘導(dǎo)效果達(dá)26.85%；王英珍等[22]研究表明梨黑斑病菌在5 mmol/L和7 mmol/LMeJA 的PDA 培養(yǎng)基中菌落直徑相比對照分別減少了62.9%和91.0%。由此推測MeJA 對病原菌的抑菌活性可能因處理濃度、處理方法和病原物種類不同而各異。

當(dāng)病原菌侵染寄主植物時，其寄主體內(nèi)POD可催化木質(zhì)素前體的生成，促進(jìn)木質(zhì)素積累。而PPO則可將植物體內(nèi)的酚氧化成醌，直接抑制病原菌生長。另有研究表明，SOD 活性變化可作為果實成熟衰老的重要指標(biāo)，能有效清除植物體內(nèi)的活性氧、維持活性氧平衡[23]；APX 通過AsA-GSH 循環(huán)分解并清除細(xì)胞中產(chǎn)生的過量H2O2[24]；CAT 是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，可將H2O2分解為H2O 和O2[25]。外源MeJA可誘導(dǎo)上述防御酶活性提高，增強(qiáng)寄主植物防御病原菌侵染的能力[26]。本試驗結(jié)果表明，MeJA處理提高了臍橙果實防御酶POD、PPO、APX 和CAT 的活性，該結(jié)論與MeJA 誘導(dǎo)辣椒抗青枯病[21]、水稻抗白葉枯病[27]和藍(lán)莓抗灰霉病[28]結(jié)果類似。本試驗中MeJA 處理組PPO 活性變化整體呈先上升后下降的趨勢，其結(jié)果印證了許晴晴等[29]用MeJA處理藍(lán)莓后PPO活性的變化規(guī)律。這可能因臍橙細(xì)胞遭到活性氧的攻擊，PPO與作用底物接觸發(fā)生反應(yīng)活性開始升高，隨著病原菌進(jìn)一步侵染使果實衰老而活性下降；而MeJA處理組SOD 活性則先降后上升再下降，與余朝閣等[30]發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)番茄抗灰霉病試驗SOD 活性變化類似。上述酶活性變化趨勢各異可能與SHAM 和MeJA 預(yù)處理后接種柑橘青霉病菌，外源物質(zhì)-寄主-病原三者之間互作關(guān)系錯綜復(fù)雜，在部分時間點上不同防御酶對誘導(dǎo)效應(yīng)的作用不同有關(guān)。

MDA是膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其含量可以直接反映對植物細(xì)胞膜的破壞程度，是寄主抗病能力的重要指標(biāo)[31]。本試驗MeJA 處理后臍橙果實中MDA 含量在0～36 h 高于對照組，48～60 h 其積累受到了抑制，該結(jié)果與王瀚博[32]用MeJA 處理藍(lán)莓試驗中MDA 含量變化趨勢類似，其可能原因為SHAM、MeJA和柑橘果實以及青霉病菌互作過程中MDA等物質(zhì)積累，MeJA對柑橘果實的正調(diào)控效應(yīng)在后期表現(xiàn)更明顯。當(dāng)寄主遭受病原物或不良環(huán)境脅迫時，可產(chǎn)生一類特異性蛋白GLU 和CHI，這兩種病程相關(guān)蛋白在寄主抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[33]。本試驗?zāi)毘裙麑嵔?jīng)MeJA 處理后，其病程相關(guān)蛋白CHI和GLU 活性相比對照和SHAM 處理有顯著提高，臍橙果實對青霉病原菌的抗性增強(qiáng)。這一結(jié)果與MeJA 誘導(dǎo)甜櫻桃抗青霉病[34]和獼猴桃抗軟腐病[35]結(jié)論一致，說明MeJA 誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病可能與提高果實內(nèi)病程相關(guān)蛋白活性有關(guān)。

綜上所述，25～1 000 μmol/L MeJA 對臍橙青霉病菌無直接抑制作用，但熏蒸處理后均可提高果實對青霉病的抗性。MeJA 誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病可能通過激發(fā)臍橙果實防御酶（POD、PPO、APX 和CAT）以及病程相關(guān)蛋白（CHI和GLU）活性，降低MDA含量，延緩膜脂過氧化，從而減緩臍橙果實青霉病的發(fā)生，有關(guān)MeJA誘導(dǎo)臍橙果實抗青霉病的分子機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

致謝：江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心項目（JXGS-03）對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！