范正陽，吳秋楨，張春渝，許小瓊，李 丹，孫 瑩，劉生財(cái)，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

【研究意義】PRMT（protein arginine methyltransferases）是蛋白質(zhì)中的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶可將甲基和精氨酸側(cè)鏈緊密連接，促進(jìn)精氨酸N 端殘基甲基化的反應(yīng)過程[1]，在DNA 損傷修復(fù)、RNA 拼接、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)和基因轉(zhuǎn)錄等過程發(fā)揮重要作用[2]。精氨酸甲基化已被公認(rèn)為是一種具有多效性的翻譯后修飾反應(yīng)[3]，可激活或抑制生物體內(nèi)基因表達(dá)，進(jìn)而影響生物的生命發(fā)育活動(dòng)和遺傳信息的傳遞。【前人研究進(jìn)展】PRMT 存在于多個(gè)物種中，目前已知，在人類基因組中已確定了9 個(gè)PRMT，即PRMT1 至PRMT9，根據(jù)最終生成的甲基精氨酸產(chǎn)物，將PRMT 分為3 種類型：I 型PRMT 包括催化MMA（單甲基精氨酸）和aDMA（不對(duì)稱二甲基精氨酸）形成的PRMT1、2、3、4、6和8；II型PRMT包括催化MMA和sDMA（對(duì)稱二甲基精氨酸）形成的PRMT5 和PRMT9；III 型PRMT 包括催化MMA10 形成的PRMT7[4]。在植物中，PRMT家族可調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程并影響植物體的基本特征，包括植株生長(zhǎng)、開花時(shí)間、光周期循環(huán)以及對(duì)不同鹽度和ABA的脅迫響應(yīng)[5]。在其他生物中，病毒所含蛋白在侵染宿主細(xì)胞的過程中被甲基化，PRMT參與病毒的生命周期的循環(huán)過程[6]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)II型AtPRMT5，該精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥出現(xiàn)葉片卷曲、生長(zhǎng)遲緩、開花延遲等多重發(fā)育缺陷癥狀[7]，Niu等[8]從花椰菜中純化出植物蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PHRMT10和PHRMT5，其中PHRMT5是擬南芥中AtPRMT5的同源物，AtPRMT5在促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)和從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的過渡中起著重要作用，該研究為支持II型PRMT參與調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和調(diào)控?cái)M南芥成花機(jī)制提供了重要證據(jù)。鐵皮石斛中發(fā)現(xiàn)6個(gè)PRMT基因家族成員，可能參與調(diào)控金釵石斛光周期的表達(dá)，且PRMT各成員的表達(dá)在根、莖、葉中具有組織特異性[9]。【本研究切入點(diǎn)】PRMT 在高等植物中參與多種生理反應(yīng)，但在香蕉中的研究較少[10]，香蕉（Musa nanaLour）是芭蕉科芭蕉屬植物，在全球熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽培，被世界糧農(nóng)組織定為第四大糧食作物[11]。【擬解決的關(guān)鍵問題】香蕉適宜在高溫高濕的環(huán)境下生長(zhǎng)，對(duì)低溫非常敏感，氣溫低于15 ℃時(shí)生長(zhǎng)受到抑制[12]，由于生產(chǎn)栽培的多倍體香蕉具有高度不育性，傳統(tǒng)技術(shù)手段難以揭示香蕉對(duì)低溫等非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制，因此利用生物信息學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從基因?qū)用娼沂鞠憬兜目鼓鏅C(jī)理對(duì)科研和實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（https：//banana-genome-hub.southgreen.fr/content/download）下載香蕉A[13]、香蕉B[14]和阿寬蕉[15]的全基因組序列、氨基酸序列和基因注釋文件，從TAIR 數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）PRMT家族成員的氨基酸序列；從國家水稻數(shù)據(jù)中心（https：//ricedata.cn/）下載水稻PRMT家族成員的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 香蕉A、B和阿寬蕉PRMT基因家族成員的篩選與鑒定 以擬南芥中的PRMT蛋白為探針，通過本地BLAST，獲取香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉潛在的PRMT 蛋白候選序列，并使用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、Pfam（http：//pfam.xfam.org/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫，基于PRMT和PrmA 結(jié)構(gòu)域（PF05185、PF06325），剔除結(jié)構(gòu)不完整、不包含PRMT相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，對(duì)候選序列進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證，最終將鑒定出的PRMT家族成員用于后續(xù)分析。

1.2.2 香蕉PRMT 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析 使用ExPAsy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)香蕉PRMT蛋白成員的氨基酸數(shù)（number of amino acids）、分子量（Mw）、等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）、脂肪系數(shù)（aliphatic index）和總平均親水性（GRAVY）；使用WOLF PSORT 在線軟件（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)分析亞細(xì)胞定位；使用SignalP-4.1 在線網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 使用MEGA-X 軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining Method）構(gòu)建香蕉A、香蕉B、阿寬蕉、擬南芥和水稻的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 值設(shè)置為1 000，其余參數(shù)默認(rèn)，最后用iTOL（https：//itol.embl.de/）美化。

1.2.4 保守基序和蛋白結(jié)構(gòu)域分析 使用在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme），分析香蕉PRMT 蛋白的保守基序，基序基數(shù)設(shè)置為10，其余參數(shù)默認(rèn)，獲取MEME.XML 文件。使用和NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）獲取香蕉目標(biāo)PRMT 蛋白的結(jié)構(gòu)域信息文件，最后使用Tbtools[16]（軟件版本號(hào)：1.098652）將MEME.XML和結(jié)構(gòu)域信息文件可視化。

1.2.5 啟動(dòng)子響應(yīng)元件預(yù)測(cè)和蛋白互作分析 從香蕉基因組中提取PRMT上游的2 000 bp 序列用于啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，通過Plant CARE 在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子元件，用Excel 2016篩選處理Plant CARE 預(yù)測(cè)結(jié)果并保留響應(yīng)類元件后，用Tbtools進(jìn)行展示。使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），上傳3種香蕉的PRMT氨基酸序列，以擬南芥數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析 從香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉的低溫轉(zhuǎn)錄組[17]中提取PRMT基因家族數(shù)據(jù)，將0，4，13，28 ℃的FPKM值轉(zhuǎn)換為log2(FPKM)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，用Tbtools進(jìn)行展示。

1.2.7 香蕉共線性分析及染色體定位 基于香蕉基因組中基因的位置和基因注釋文件（gff/gff3），利用Tbtools 的One Step MCScanX-Super Fast 進(jìn)行物種內(nèi)共線性分析，然后用Advance Circos 功能添加香蕉A、B 的染色體和阿寬蕉的scaffold 基因密度，標(biāo)注出目標(biāo)基因后進(jìn)行可視化分析。阿寬蕉scaffold按長(zhǎng)度排序，選取前15 條scaffold 和PRMT所在的8 個(gè)scaffold，用于可視化分析，由于scaffold148 在二者之間重疊，因此共展示22 條scaffold。使用One Step MCScanX-Super Fast 功能，將擬南芥、香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉的基因組序列兩兩比對(duì)，合并比對(duì)結(jié)果文件后，用Tbtools 的Multiple Synteny Plot 功能進(jìn)行展示。

1.2.8 植物PRMT5基因進(jìn)化分析 低溫轉(zhuǎn)錄組熱圖中發(fā)現(xiàn)MiPRMT7在13℃時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最高，與擬南芥PRMT 蛋白比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其為PRMT5 蛋白，因此從http：//plants.ensembl.org/index.html 下載獼猴桃（Actinidia chinensis，AcPRMT5，PSR91898）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii，AetPRMT5，AET6Gv2028330 0.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，AtPRMT5，AT4G31120.1）、甜菜（Beta vulgaris，BvPRMT5，KMT17602）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，BdPRMT5，KQJ93267）、歐洲油菜（Brassica napus，BnPRMT5，CDX68722）、野甘藍(lán)（Brassica oleracea，BoPRMT5，Bo7g114970.1）、蕪青（Brassica rapa，BrPRMT5，Bra010256.1-P）、黃麻（Corchorus capsularis，CcPRMT5，OMO61939）、黃瓜（Cucumis sativus，CsPRMT5，KGN60149）、野胡蘿卜（Daucus carota，DcPRMT5，KZN08629）、彎葉畫眉草（Eragrostis curvula，EcPRMT5，TVU33485）、大麥（Hordeum vulgare，HvPRMT5，HORVU6Hr1G019540.1）、木薯（Manihot esculenta，MePRMT5，OAY35258）、香蕉（Musa acuminata，MaPRMT5，Ma10_g02940.1）、煙草（Nicotiana attenuata，NaPRMT5，A4A49_03162）、光稃稻（Oryza glaberrima，OgPRMT5，ORGLA02G0030400.1）、水稻（Oryza sativa Indica Group，OsPRMT5，BGIOSGA007160-TA）、菜豆（Phaseolus vulgaris，PvPRMT5，ESW09099）、小立碗蘚（Physcomitrella patens，PhpPRMT5，Pp3c1_39750V3.1）、桃（Prunus persica，PpPRMT5，ONI34114）、月季（Rosa chinensis，RcPRMT5，PRQ28102）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii，SmPRMT5，EFJ08472）、粟（Setaria italica，SiPRMT5，KQL28795）、番茄（Solanum lycopersicum，Sl-PRMT5，Solyc08g005970.3）、高粱（Sorghum bicolor，SbPRMT5，EES06257）、紅車軸草（Trifolium pratense，TpPRMT5，Tp57577_TGAC）、小麥（Triticum aestivum，TaPRMT5，TraesCS6B02G137700.1）、赤豆（Vigna angularis，VaPRMT5，KOM41912）和玉米（Zea mays，ZmPRMT5，Zm00001eb086470）這30 個(gè) 物種的PRMT5基因CDS 序列用于分析。使用MEGA-X 構(gòu)建30 個(gè)PRMT5氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（鄰接法，Neighbor-joining Method），采用本地blast 計(jì)算香蕉PRMT5氨基酸序列與其余29 個(gè)物種之間的相似度，最后通過Excel 365 將相似度數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果分析

2.1 PRMT基因家族成員鑒定結(jié)果及基本理化性質(zhì)分析

基于香蕉A、香蕉B和阿寬蕉基因數(shù)據(jù)庫，結(jié)合家族成員之間的聚類進(jìn)化關(guān)系，在上述3個(gè)品種香蕉中各鑒定出8 條成員（表1），根據(jù)PRMT家族成員的基因ID 順序，分別命名為MaPRMT1-8（Musa acuminataprotein arginine methyltransferases 1-8）、MbPRMT1-8（Musa balbisanaprotein arginine methyltransferases 1-8）和MiPRMT1-8（Musa itineransprotein arginine methyltransferases 1-8）。

對(duì)3 種香蕉PRMT 蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，結(jié)果見表1。香蕉PRMT 蛋白長(zhǎng)度、分子量、理論等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)分別介于144～921、15.86～103.17 ku、4.58～8.80 和35.28～59.12，總平均親水系數(shù)小于0，均為親水蛋白，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)的比例為4.17%、8.33%、33.33%和54.17%，信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，MiPRMT7 蛋白包含信號(hào)肽，屬于分泌蛋白，其余均為非分泌蛋白。

2.2 PRMT基因家族進(jìn)化樹分析

使用MEGA-X對(duì)3種香蕉、擬南芥和水稻的PRMT家族成員蛋白進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果顯示，香蕉PRMT基因家族成員可分為5 個(gè)亞族，亞族1（Group1）包含6 個(gè)成員：MbPRMT4、MiPRMT6、MaPRMT4、MiPRMT5、MbPRMT1和MaPRMT1。亞族2（Group2）包含3 個(gè)成員：MbPRMT5、MiPRMT7和MaPRMT6。亞族3（Group3）有6 個(gè)成員：MiPRMT4、MbPRMT8、MaPRMT8、MbPRMT7、MiPRMT1和MaPRMT7。亞族4（Group4）僅包含2 個(gè)成員：MbPRMT6和MiPRMT8。亞族5（Group5）成員數(shù)量最多，有7 個(gè)，分比為：MiPRMT3、MaPRMT5、MaPRMT3、MbPRMT2、MaPRMT2、MbPRMT3和MiPRMT2。結(jié)合PRMT家族成員鑒定結(jié)果，證明成員之間親緣關(guān)系較近。

圖1 香蕉PRMT家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of banana PRMT family members

2.3 香蕉PRMT蛋白保守基序和結(jié)構(gòu)域分析

使用MEME 在線軟件對(duì)香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果（圖2a）表明，MaPRMT7、MaPRMT8、MbPRMT7、MbPRMT8、MiPRMT1 和MiPRMT4 這6 條蛋白保守基序數(shù)量最多，包含10 個(gè)保守基序，且保守基序排列相似度和長(zhǎng)度也較接近，推測(cè)上述基因之間具有高度同源性；MbPRMT2保守基序數(shù)量最少，僅有2 個(gè)。24 條蛋白均含有Motif1 和Motif7，該基序可能與PRMT 和PrmA 域相關(guān)性較強(qiáng)。除MbPRMT2蛋白外，其余23條PRMT 蛋白均含有Motif2、Motif3、Motif4和Motif6這4個(gè)保守基序，說明香蕉中PRMT 蛋白保守性較強(qiáng)，但基序位置有所差異。可視化香蕉PRMT 蛋白結(jié)構(gòu)域后結(jié)果（圖2b）表明，蛋白結(jié)構(gòu)域的類聚情況與保守基序分布較為一致。9條PRMT蛋白含有AdoMet_Mtases超家族，另有9條含有AdoMet_Mtases，MiPRMT7、MaPRMT6 和MbPRMT5 分別含有PRMT5 和PRMT5_C 和PRMT5_TIM 結(jié)構(gòu)域，此外，MbPRMT7還含有RRM結(jié)構(gòu)域。

圖2 香蕉PRMT家族成員保守基序（a）和蛋白結(jié)構(gòu)域（b）分析Fig.2 Analysis of conserved motifs（a）and conserved domains（b）of banana PRMT

2.4 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析

對(duì)PRMT基因家族進(jìn)行順式作用元件分析（圖3），提取PRMT基因上游2 000 bp 的序列，使用plant-CARE在線網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，香蕉A、香蕉B和阿寬蕉24個(gè)PRMT基因啟動(dòng)子中響應(yīng)元件主要分為3類：光響應(yīng)、逆境脅迫響應(yīng)和植物激素響應(yīng)元件。24個(gè)成員均含有光響應(yīng)元件，22個(gè)成員含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，17個(gè)成員含有脫落酸響應(yīng)元件，15個(gè)成員含有低溫響應(yīng)元件，14個(gè)成員含有赤霉素響應(yīng)元件，11個(gè)成員含有生長(zhǎng)素和防御應(yīng)激響應(yīng)元件，9個(gè)成員含有水楊酸響應(yīng)元件，7個(gè)成員含有干旱誘導(dǎo)性元件，6個(gè)成員含有厭氧誘導(dǎo)元件，3個(gè)成員含有晝夜節(jié)律控制元件，1個(gè)成員含有胚乳表達(dá)元件。

圖3 PRMT基因家族啟動(dòng)子響應(yīng)元件Fig.3 PRMT gene family promoter response elements

2.5 香蕉PRMT蛋白互作預(yù)測(cè)

以擬南芥蛋白為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，使用STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉PRMT 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖4），用以分析PRMT 蛋白的功能關(guān)系。結(jié)果表明，該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)由PRMT1A、PRMT3、PRMT4B、PRMT6、PRMT10、PRMT7 和PRMT11 這7 個(gè)核心蛋白構(gòu)成，PRMT 蛋白成員之間相互作用較強(qiáng)，除此之外，PRMT 蛋白主要與FIB2、AT1G31660、PWP2、SKB1、AT1G07840、AT1G10490、AT1G06720 和RAP74 發(fā)生強(qiáng)相互作用，和其余蛋白之間相互作用較弱。

圖4 香蕉PRMT蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein-protein interaction network of bananas

2.6 香蕉PRMT在不同低溫下表達(dá)量分析

為了解3種香蕉PRMT家族成員在不同低溫下的表達(dá)情況，從香蕉低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取PRMT基因的FPKM 值。結(jié)果（圖5）表明，家族成員聚類為兩大類：第Ⅰ類中MbPRMT3、MiPRMT4、MiPRMT1、MaPRMT7和MiPRMT2在0 ℃時(shí)表達(dá)上調(diào)，4℃時(shí)表達(dá)下調(diào)，表達(dá)量最低；MbPRMT5、MbPRMT7和MiPRMT6在4 ℃時(shí)表達(dá)量較高，0 ℃和13 ℃時(shí)表達(dá)量較低；MaPRMT1、MaPRMT8和MbPRMT4在0 ℃和13 ℃時(shí)下調(diào)表達(dá)，4 ℃和28 ℃上調(diào)表達(dá)；MaPRMT4、MbPRMT1和MbPRMT2在28 ℃表達(dá)量最高，在其他溫度下表達(dá)量較低或不表達(dá)。在第Ⅱ類中，MaPRMT6、MbPRMT6、MbPRMT8、MaPRMT3和MaPRMT5均不表達(dá)；MiPRMT5、MiPRMT7、MiPRMT3、MiPRMT8和MaPRMT2在13 ℃時(shí)表達(dá)量最高，其余溫度下表達(dá)量較低或不表達(dá)。

圖5 香蕉PRMT在不同低溫下表達(dá)量分析Fig.5 Expression analysis of banana PRMT at different low temperatures

2.7 香蕉物種內(nèi)共線性、染色體定位和基因密度分析

為了解香蕉PRMT家族的基因擴(kuò)增機(jī)制，結(jié)合染色體或scaffold 的基因密度，對(duì)3 種香蕉的全基因組進(jìn)行共線性分析。香蕉A（圖6a）MaPRMT7和MaPRMT8與香蕉B（圖6b）MbPRMT7和MbPRMT8參與基因復(fù)制事件，且兩對(duì)基因均位于相對(duì)應(yīng)品種的第11 條染色體上基因密度較高的區(qū)域，此外，Mb-PRMT7還參與了香蕉B 第8 條染色體上某個(gè)基因片段復(fù)制事件。阿寬蕉（圖6c）的PRMT基因之間沒有發(fā)生基因復(fù)制事件，且PRMT基因片段所在的scaffold 長(zhǎng)度相對(duì)較短，與其余scaffold 之間無共線性。特別地，香蕉B 的PRMT有2 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因，位于Bchr05（MbPRMT2和MbPRMT3）上，這些串聯(lián)重復(fù)基因可能參與PRMT的功能分化和家族數(shù)量擴(kuò)增[18]，為PRMT家族成員的進(jìn)化過程和擴(kuò)增機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

香蕉A 的PRMT基因分別定位在第3、5、6、9、10 和11 這6 條染色體上（圖6a），MaPRMT2和MaPRMT3位于第5 條染色體上，二者在染色體上的分布位置較近，MaPRMT7和MaPRMT8分布在第11 條染色體上；其余4 條染色體均只有1 個(gè)PRMT基因存在。香蕉B 的PRMT基因定位在第3、5、6、10、11 這5 條染色體上（圖6b），MbPRMT2和MbPRMT3均位于第5 條染色體上，MbPRMT7和Mb-PRMT8分布在第11 條染色體，香蕉A 和香蕉B 第3 和11 條染色體PRMT基因的分布位置和起始位點(diǎn)都極其相似，說明兩個(gè)品種的香蕉在進(jìn)化過程中，依然保持較近的親緣關(guān)系。阿寬蕉的PRMT基因分別位于scaffold1047、scaffold1048、scaffold1059、scaffold1225、scaffold148、scaffold173、scaffold1802 和scaffold877，8 個(gè)PRMT基因分布在不同的scaffold 上（圖6c）?；蛎芏确治鼋Y(jié)果表明，香蕉A 和B 的第10 條染色體前端的基因密度低，后端基因密度高；其余染色體前端和后端基因密度高，中部基因密度低（圖5a 和圖5b）；香蕉A 和B 分別有50%、62.5%的PRMT分布在高基因密度區(qū)，阿寬蕉的PRMT均位于低基因密度區(qū)。

圖6 香蕉物種內(nèi)共線性分析Fig.6 Collinearity analysis within banana species

2.8 香蕉與擬南芥物種間共線性分析

為研究3 種香蕉PRMT基因之間的進(jìn)化關(guān)系，使用3 種香蕉的基因組與擬南芥基因組進(jìn)行物種間共線性分析。結(jié)果（圖7）顯示，擬南芥有2 個(gè)PRMT基因與香蕉A 關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，分別是 ATchr3-Achr11 和 ATchr4-Achr10；香蕉A 與香蕉B 之間的共線性關(guān)系最為密切，PRMT基因在染色體上的位置也極為相似，除Achr08-Bchr11，其余均基因所在的染色體編號(hào)相一致，說明二者在進(jìn)化過程中的基因相似度高。香蕉B 與阿寬蕉之間有5 個(gè)基因關(guān)聯(lián)性強(qiáng)，且該5 個(gè)基因均位于長(zhǎng)度較長(zhǎng)的scaffold 片段，Mi-3、Mi-5 和Mi-7 與其他物種無關(guān)聯(lián)性。擬南芥和香蕉具有明顯的共線性關(guān)系，推測(cè)這些基因可能是從同一個(gè)祖先的基因組中進(jìn)化而來。

圖7 香蕉與擬南芥物種間共線性分析Fig.7 Collinearity analysis between different species of banana and Arabidopsis thaliana

2.9 植物PRMT5進(jìn)化關(guān)系分析

為探究PRMT5在不同植物中的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA-X 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖8）表明，PRMT5主要聚類為兩大類，除玉米（ZmPRMT5）外，其余禾本科植物PRMT5之間親緣關(guān)系較近，同源性和相似度高，說明禾本科植物PRMT5在進(jìn)化過程中相對(duì)保守，經(jīng)過漫長(zhǎng)的進(jìn)化依然高度同源。此外，同一物種間（如水稻OsPRMT5和光稃稻OgPRMT5，小麥TaPRMT5、大麥HvPRMT5和節(jié)節(jié)麥AetPRMT5）同源性最高，位于同一進(jìn)化分支。同科植物（如煙草NaPRMT5和番茄SlPRMT5）之間親緣關(guān)系較近，但與黃瓜CsPRMT5親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與茄科植物不同的是，豆科植物（赤豆VaPRMT5、菜豆PvPRMT5和紅車軸草TpPRMT5）聚類在同一進(jìn)化分支，推測(cè)同科植物在進(jìn)化過程中基因功能多樣化表達(dá)，既出現(xiàn)顯著性的功能分化，又存在保守性。

圖8 植物PRMT5基因進(jìn)化關(guān)系分析Fig.8 Analysis of evolutionary relationship of PRMT5 in plants

2.10 植物與香蕉PRMT5氨基酸序列相似度比對(duì)

為進(jìn)一步探究PRMT5的進(jìn)化關(guān)系，將29 個(gè)物種的PRMT5 氨基酸序列與香蕉做比對(duì)，結(jié)果（圖9）表明，氨基酸序列相似度在70%左右波動(dòng)，同一科屬植物之間序列相似度較高。其中，歐洲油菜（Bn-PRMT5）與香蕉PRMT5相似度最高，達(dá)79.19%，最低的是江南卷柏（SmPRMT5），僅64.59%。

圖9 植物與香蕉PRMT5氨基酸序列相似率Fig.9 Amino acid sequence similarity of PRMT5 between plant and banana

3 討論

3.1 香蕉PRMT參與精氨酸甲基化和DNA損傷修復(fù)過程

PRMT在動(dòng)物中研究較多，且大多與癌癥等疾病[19-22]或病毒[23]相關(guān)，在植物中的研究相對(duì)較少。本研究在香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉均鑒定出8 個(gè)PRMT成員，經(jīng)前人發(fā)現(xiàn)，植物中PRMT基因家族成員在擬南芥中有9 個(gè)[24]，水稻[5]、玉米[25]和海濱雀稗[26]中均有8 個(gè)，桉樹[27]中有7 個(gè)，金釵石斛中有6 個(gè)[9]，從家族成員數(shù)量來看，3種香蕉與模式植物（擬南芥和水稻）以及非模式植物（蘋果、海濱雀稗、桉樹等）大致相等。

香蕉PRMT蛋白結(jié)構(gòu)域中，有18 個(gè)成員保守結(jié)構(gòu)域與AdoMet_Mtases 相關(guān)，3 個(gè)成員包含Methyltransf_25。腺苷蛋氨酸（AdoMet）是甲基轉(zhuǎn)移酶（Mtase）催化的多種生物甲基化反應(yīng)中普遍存在的甲基供體[28-30]，AdoMet 類似物是炔基鏈取代磺基結(jié)合而成的甲基，可以作為許多DNA 和RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的替代輔助因子，使這些線性鏈能夠共價(jià)沉積到DNA 或RNA 中的同源靶點(diǎn)[28]，腺苷蛋氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶的催化，這種翻譯后修飾具有多種細(xì)胞功能，此外，一些甲基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出廣泛的底物特異性[31]，需要全面的靶向分析方法進(jìn)一步研究。部分成員含有RRM1（核糖核苷酸還原酶大亞基）、RRM2（核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2）和RRM 結(jié)構(gòu)域。高陽[32]研究證實(shí)，靶向RRM1 可以增加輻射誘導(dǎo)的DNA 雙鏈斷裂損傷和凋亡信號(hào)；申慧敏[33]證實(shí)，RRM2表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，抑制細(xì)胞凋亡，RRM2表達(dá)下調(diào)則與之相反，RRM 類的結(jié)構(gòu)域說明PRMT與DNA 的損傷、修復(fù)和細(xì)胞凋亡相關(guān)。MiPRMT7、MaPRMT6和MbPRMT5含有PRMT5、PRMT5_C和PRMT5_TIM 結(jié)構(gòu)域，PRMT5是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)對(duì)稱精氨酸甲基化主要的催化反應(yīng)酶[34]，PRMT5通過催化精氨酸391（R391）上AKT1的對(duì)稱二甲基，促進(jìn)AKT活化，進(jìn)而參與細(xì)胞的凋亡、增殖與分化[35]。Ezeka等[36]證明，PRMT5與甲基小體蛋白50(MEP50）輔因子協(xié)同作用，催化組蛋白中關(guān)鍵精氨酸的對(duì)稱二甲基化，改變?nèi)旧|(zhì)環(huán)境，可影響基因表達(dá)。結(jié)合蛋白互作結(jié)果，PWP2 參與90S 前核糖體的組裝過程[37]，SKB1 維持根部干細(xì)胞的表達(dá)以應(yīng)對(duì)DNA 損傷[38]，RAP74 可調(diào)控RNA 聚合酶II 終端領(lǐng)域特有的磷酸鹽，參與磷酸活化[39]，推測(cè)香蕉中PRMT 蛋白可能也具有上述特異性功能。綜上所述，初步證明香蕉PRMT兼具保守性和功能特異性，3 種香蕉的PRMT與精氨酸甲基化相關(guān)，且RRM系列結(jié)構(gòu)域還參與DNA損傷修復(fù)。

3.2 香蕉PRMT可能參與激素代謝通路并抵御逆境脅迫

啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)香蕉PRMT啟動(dòng)子中含有大量非生物脅迫和植物激素響應(yīng)元件，表明其可能參與相關(guān)代謝途徑影響香蕉生長(zhǎng)發(fā)育。研究證實(shí)，茉莉酸甲酯（MeJA）在逆境脅迫相關(guān)代謝方面被廣泛研究[40-41]，可緩解鹽脅迫和抗氧化作用[42]，結(jié)合EBR（24-油菜素內(nèi)酯）增強(qiáng)油橄欖葉片抗凍性[43]。脫落酸（ABA）在干旱脅迫、氣孔開閉等生理過程密切相關(guān)，在抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[44]，ABA 在重度干旱條件下可調(diào)控凈光合速率和水分利用率[45]，達(dá)到抗旱效果[46]。水楊酸（SA）是普遍存在于植物中的酚類化合物，是激活植物抗逆反應(yīng)和逆境脅迫的信號(hào)分子[47]，外源SA 可提高葉綠素和總酚含量，并提高細(xì)胞滲透壓，緩解鹽脅迫作用[48]，Yang等[49]發(fā)現(xiàn)SA通過激活抗氧化防御系統(tǒng)、調(diào)節(jié)離子平衡和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，Souana等[50]研究表明外源SA可提高抗氧化能力和光合作用速率，緩解鹽脅迫作用。

綜上，24 個(gè)PRMT家族成員中，91.67%、70.83%、58.33%、45.83%、37.50%的成員含有MeJA、ABA、GA、Aux和SA響應(yīng)元件，表明PRMT可能與香蕉的激素代謝和調(diào)節(jié)過程密切相關(guān)，MeJA、ABA和SA在多種植物中都據(jù)有抗逆作用，推測(cè)上述物質(zhì)在香蕉A、香蕉B 和阿寬蕉中可能發(fā)揮相似的脅迫防御或應(yīng)激反應(yīng)，除與植物激素相關(guān)的抗逆代謝通路外，啟動(dòng)子順式元件中還包含干旱、低溫、厭氧誘導(dǎo)和晝夜節(jié)律調(diào)控元件，但在香蕉中的具體代謝途徑和作用機(jī)理，還需進(jìn)一步研究。

結(jié)合香蕉0，4，13，28 ℃的低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)低溫在24 個(gè)PRMT成員中呈現(xiàn)出兩大類不同的表達(dá)模式。第Ⅰ類大致在0 ℃和4 ℃時(shí)表達(dá)量高，說明低溫促進(jìn)第Ⅰ類基因表達(dá)，13 ℃或28 ℃的溫度抑制其表達(dá)，推測(cè)PRMT家族成員中發(fā)揮抗寒功能的基因主要來自第Ⅰ類。第Ⅱ類中MiPRMT5、MiPRMT7、MiPRMT3、MiPRMT8 和MaPRMT2在13 ℃時(shí)表達(dá)量最高，這5 個(gè)基因?qū)?3 ℃最敏感，該溫度非常接近抑制香蕉生長(zhǎng)的臨界溫度，推測(cè)香蕉在面對(duì)不同梯度的低溫條件時(shí)，會(huì)調(diào)控不同的相關(guān)抗寒基因表達(dá)。

3.3 香蕉PRMT5進(jìn)化過程相對(duì)獨(dú)立

香蕉PRMT5位于禾本科以外的進(jìn)化大類中，但獨(dú)立出現(xiàn)在一個(gè)進(jìn)化分枝，與其他物種之間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，基因進(jìn)化過程與其余物種出現(xiàn)較大的分化。值得注意的是，禾本科植物（除玉米外）PRMT5均能聚類到同一進(jìn)化分枝中，說明禾本科植物PRMT5可能是同源的，基因序列之間的差異性則意味著禾本科植物種屬間由于進(jìn)化發(fā)育，進(jìn)而產(chǎn)生不同的族群。禾本科的氨基酸序列相似率較接近，進(jìn)一步說明禾本科之間親緣關(guān)系相近。重復(fù)是基因組和遺傳系統(tǒng)演化中的重要表現(xiàn)形式之一[51]，物種經(jīng)歷全基因組加倍事件后，基因數(shù)量和功能可能發(fā)生改變[52]，但在植物中PRMT家族成員數(shù)目普遍小于10，且PRMT5未出現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增事件。玉米（ZmPRMT5）獨(dú)自位于一個(gè)進(jìn)化分枝中，可能是由于玉米基因組經(jīng)歷某次特異性擴(kuò)增[53]，使ZmPRMT5功能特異性表達(dá)，與其余植物的親緣關(guān)系出現(xiàn)遠(yuǎn)離。綜上，初步說明PRMT5在多種植物中均有穩(wěn)定遺傳表達(dá)，不同物種間的PRMT5存在一定的親緣關(guān)系，其中禾本科植物之間的同源性和相似性最高，且香蕉中PRMT5的進(jìn)化過程相對(duì)獨(dú)立。但PRMT5的起源、復(fù)制、分化和進(jìn)化機(jī)理等問題，還需進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié)論

研究基于香蕉A、香蕉B和阿寬蕉的基因組數(shù)據(jù)，在3種香蕉中均篩選并鑒定出8個(gè)PRMT基因家族成員，利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹、保守基序、蛋白結(jié)構(gòu)域、啟動(dòng)子響應(yīng)元件預(yù)測(cè)、蛋白互作、低溫轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式和共線性進(jìn)行系統(tǒng)分析，并研究植物PRMT5基因的進(jìn)化關(guān)系。進(jìn)一步討論結(jié)果表明，3 種香蕉PRMT的保守結(jié)構(gòu)域均與精氨酸甲基化相關(guān)；啟動(dòng)子元件中均包含光響應(yīng)元件，并含有大量植物激素和非生物脅迫響應(yīng)元件；結(jié)合低溫轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，香蕉在其抗寒代謝過程中會(huì)依據(jù)不同梯度的低溫調(diào)控不同的基因進(jìn)行表達(dá)，以達(dá)到適應(yīng)環(huán)境的效果；且香蕉PRMT5進(jìn)化過程相對(duì)獨(dú)立。本研究為進(jìn)一步探究香蕉PRMT家族成員的基因信息和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

致謝：福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目（CXZX2020027A）和福建省高原學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)（102/71201801101）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！