楊 莎，楊宇澤，徐 茜，郝海生，杜衛(wèi)華，龐云渭，趙善江，鄒惠影，朱化彬，趙學(xué)明*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.北京市畜牧總站，北京 100101)

玻璃化冷凍是一種在高濃度的冷凍保護(hù)劑的作用下，以極快的速度將細(xì)胞溫度降至-196 ℃，防止冰晶的形成，從而減少毒性、滲透損傷和冷凍傷害的冷凍保存方法。相較于常規(guī)冷凍方法而言，玻璃化冷凍因其冷凍效果更好，已成為卵母細(xì)胞冷凍保存的首選方法。同時(shí)，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞玻璃化冷凍能夠跨越時(shí)間和空間的限制，實(shí)現(xiàn)家畜胚胎體外生產(chǎn)和移植更大范圍的推廣應(yīng)用，對(duì)于瀕危動(dòng)物和優(yōu)秀品種種質(zhì)資源保存有著重要意義。卵母細(xì)胞玻璃化冷凍還可以為那些愿意推遲生育的夫婦或過早失去卵巢功能的女性擴(kuò)大生育選擇范圍。

但是，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力問題仍待解決。大量研究證實(shí)，在配子成熟、合子基因組激活以及胚胎著床前發(fā)育過程中，表觀遺傳發(fā)揮著重要作用。DNA 甲基化的動(dòng)態(tài)變化可能會(huì)影響早期細(xì)胞命運(yùn)的決定，同時(shí)DNA甲基化的異常重編程可能導(dǎo)致發(fā)育缺陷和胚胎停滯。前人研究表明，玻璃化冷凍會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生影響。玻璃化冷凍小鼠卵母細(xì)胞體外受精 (fertilization，IVF) 囊胚中19、3 和的 DNA 甲基化水平降低，玻璃化冷凍牛MII期卵母細(xì)胞的整體 DNA 甲基化水平和 H3K9me3 水平降低、而H3K9ac水平增加。在本課題組的前期研究中，對(duì)體內(nèi)囊胚和新鮮、玻璃化冷凍卵母細(xì)胞IVF囊胚進(jìn)行了全基因組甲基化測序，結(jié)果表明，與體內(nèi)組和新鮮組相比，冷凍組中2R基因的甲基化水平顯著降低((18.76±2.77)%、(15.04±6.64)%(9.41±3.52)%，<0.05)。2R 是2的受體，是一個(gè)印記基因，在調(diào)節(jié)早期胎兒正常生長、2 循環(huán)水平和心發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。綿羊體外生產(chǎn)胚胎2R 基因印跡丟失會(huì)直接導(dǎo)致其后代出現(xiàn)胎盤和胚胎過度生長的現(xiàn)象，即巨胎癥 (large offspring syndrome， LOS)。鑒于2R在胚胎發(fā)育過程中的重要作用，如何精確調(diào)控玻璃化冷凍卵母細(xì)胞 IVF 囊胚中2R的甲基化水平，使之恢復(fù)正常，成為了當(dāng)前需要解決的問題。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)自2012年誕生以來已經(jīng)在基因精確敲除/敲入領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。隨后，研究人員將Cas9蛋白結(jié)構(gòu)域中引入突變，使得蛋白活性發(fā)生缺陷，生成了dCas9 (dead Cas9)蛋白，其可以通過融合不同蛋白產(chǎn)生多種衍生工具。DNMT3A 是DNA從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能獨(dú)立于復(fù)制并在未甲基化和/或半甲基化 DNA 的 CpG 位點(diǎn)啟動(dòng)甲基化。2016年，研究人員將dCas9蛋白與DNMT3A相融合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶基因位點(diǎn)甲基化水平的精準(zhǔn)調(diào)控。2017年，Huang等利用與重復(fù)肽表位 (SunTag) 融合的dCas9 蛋白募集多份抗體融合的DNMT3A (dCas9-SunTag-DNMT3A)，增加了局部 DNMT3A 濃度，并最終增強(qiáng)了目標(biāo)位點(diǎn)的CpG 甲基化。2019年，研究人員將 dCas9-DNMT mRNA 注射進(jìn)入小鼠卵母細(xì)胞，成功提高了靶基因的 DNA 甲基化水平，并獲得了后代。

綜上，本試驗(yàn)擬采用 dCas9-SunTag-DNMT3A DNA 甲基化調(diào)控技術(shù)，對(duì)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞IVF囊胚中2R 的甲基化水平進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)增，使其甲基化水平恢復(fù)正常。本研究結(jié)果將為冷凍卵母細(xì)胞/胚胎的特定位點(diǎn) DNA 甲基化的精確調(diào)控提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

若無特殊說明，文中所提到的試劑均采購自Sigma公司(美國)。

1.2 卵母細(xì)胞采集和體外成熟

將屠宰場來源的牛卵巢在2 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，并使用提前熱好的生理鹽水(含雙抗)清洗2～3次去除表面雜物。選取卵巢上直徑約為2～8 mm的卵泡，利用真空泵抽取卵泡液于15 mL離心管中。靜置，吸取沉淀于90 mm的培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下選擇符合培養(yǎng)要求的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在洗卵液中清洗2次，成熟液中清洗2～3次后，轉(zhuǎn)入裝有成熟液的4孔板中，在含有5% CO，濕度為100%，溫度為38.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。

1.3 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍及解凍

在Hou等的玻璃化冷凍和解凍程序上略作修改。冷凍程序：保持室溫在25 ℃左右，使試驗(yàn)用具和試劑平衡充分，并在恒溫工作臺(tái)(38～39 ℃)上進(jìn)行試驗(yàn)。用OPS管將成熟好的卵母細(xì)胞移入預(yù)處理液(10% EG + 10% DMSO)中平衡30 s后，移入冷凍液中(EDFSF40)平衡25 s，然后將卵母細(xì)胞重新吸入到OPS管中，直接投入液氮中進(jìn)行冷凍。

解凍程序：將OPS管從液氮中取出，立刻將卵母細(xì)胞吹入到0.25 mol·L蔗糖解凍液中平衡 1 min， 然后轉(zhuǎn)移入0.15 mol·L蔗糖解凍液中平衡 5 min，最后再將卵母細(xì)胞在IVM液中洗滌2次， 選取符合要求的卵母細(xì)胞備用。

1.4 卵母細(xì)胞IVF

IVF步驟借鑒Brackett 和 Oliphant的方法，稍作修改。將凍精從液氮罐中取出后，在38 ℃的水浴鍋中進(jìn)行解凍，后移入超凈臺(tái)，將精液加入到含有7 mL洗精液的離心管中，離心(1 500 r·min,5 min)， 去上清，重復(fù)上述操作一次。離心結(jié)束后，加入受精液，調(diào)整精液密度為5×10個(gè)·mL，隨后取20 μL精液與80 μL受精液相混合成100 μL受精滴，使精子終密度為1×10·mL，放入培養(yǎng)箱(38.5 ℃、5%CO、100%濕度)中平衡1.5 h。將新鮮、冷凍的卵母細(xì)胞移入受精滴中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h進(jìn)行體外受精。受精完成后，脫去卵丘細(xì)胞，放入胚胎前期培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，計(jì)算卵裂率，隨后將卵裂的胚胎移入胚胎后期液中培養(yǎng)，并每隔48 h 進(jìn)行半量換液，在受精后第7天統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.5 dCas9-SunTag-DNMT3A和gRNA制備

1.5.1 構(gòu)建dCas-GCN、scFv-DNMT3A基因真核表達(dá)質(zhì)粒和體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 通過PCR將dCas-GCN片段從pPlatTET-gRNA2 (addgene#82559)擴(kuò)增下來，并通過膠回收純化獲得dCas-GCN片段。之后將dCas-GCN片段、質(zhì)粒scFv-sfGFP-DNMT3A (addgene#102278)通過R I/I雙酶切鏈接在pcDNA3.1(+)上，成為pcDNA3.1-dCas-GCN和pcDNA3.1-scFv-DNMT3A。

1.5.2 體外轉(zhuǎn)錄dCas-GCN、scFv-DNMT3A mRNA 采用KOD plus-neo高保真擴(kuò)增PCR體系，從第1步中的質(zhì)粒上擴(kuò)增下mRNA的DNA模板，隨后采用NEB公司的T7 RNA聚合酶試劑盒 (#E2040)。反應(yīng)時(shí)需加入各 1.5 mmol·L的 ATP、UTP、GTP、CTP和帶有T7啟動(dòng)子的模板 DNA 1 μg，在 37 ℃ 溫育16 h。最后加入DNAase 1 μL，在 37 ℃ 溫育0.5 h。最后使用Trizol (Invitrogen)試劑抽提純化。

1.5.3 設(shè)計(jì)牛2R基因的啟動(dòng)子區(qū)sgRNA 從UCSC查找出牛2R基因的啟動(dòng)子區(qū)序列，在網(wǎng)站設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物T7-gIGF2R F(5′-3′)：ATGACTCAACTCTTCGCATG；下游引物gRNA-ovlap R(5′-3′):CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC。

1.5.4 合成牛2R基因啟動(dòng)子區(qū)gRNA的模板和體外轉(zhuǎn)錄 將上述上、下游引物100 μmol·L各3 μL，于Taq酶buffer中混勻(30 μL體系)，在沸水中與水一起慢慢降溫，實(shí)現(xiàn)退火。3 h后，加3 μL dNTP、1 μL酶，于72 ℃水浴15 min。用康為Cleanup試劑盒純化，測定濃度。體外轉(zhuǎn)錄g2R，方法同上。

1.6 顯微注射

采用顯微操作儀將 dCas9- DNMT3A mRNA (20、40、60 ng·μL)和 sgRNA(20、40、60 ng·μL) 注射到受精后的原核胚的胞質(zhì)中。注射完成后，受精卵放入胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后，將卵裂的胚胎放到胚胎培養(yǎng)液+10% FBS 中繼續(xù)培養(yǎng) 120 h，每隔 48 h 進(jìn)行半量換液。最后，收集獲得的囊胚進(jìn)行3A甲基化模式分析，檢驗(yàn) dCas9- DNMT3A 的 DNA 甲基化水平調(diào)增效果。

1.7 甲基化檢測

1.7.1 基因組 DNA 的提取和亞硫酸氫鹽處理 利用EZ DNA Mthylation-DirectKit試劑盒說明書提取胚胎DNA，隨后進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鹽修飾及純化。

1.7.2 亞硫酸氫鹽聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(BSP-PCR)引物設(shè)計(jì)及合成 本試驗(yàn)是針對(duì)2R 基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行特定甲基化修飾，所以引物是根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，第一步，獲得2R基因的啟動(dòng)子區(qū)序列。第二步，使用Methylation primer 網(wǎng)站得到基因的甲基化序列，并設(shè)計(jì)甲基化引物。第三步，使用 Snapgene 找到引物對(duì)應(yīng)的參考序列并合成。

1.7.3 亞硫酸氫鹽聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(BSP-PCR) 采用25 μL的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，模板為1 μL經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾過后的DNA溶液， 12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix (TRAN)，表1中上、下游引物各1 μL，補(bǔ)足水至總反應(yīng)體積25 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；然后于94 ℃ 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，此過程循環(huán)35次；最后于72 ℃ 延伸7 min。

表1 BSP-PCR引物

1.8 連接和轉(zhuǎn)化

將BSP-PCR產(chǎn)物與 PMD-19T Vector 載體連接。Solution1 5 μL,PMD-19T 載體0.5 μL,線性載體4.5 μL，16 ℃孵育4 h。將連接好的重組載體轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性菌進(jìn)行測序。

1.9 測序分析

在超凈臺(tái)中用無菌槍頭挑取單克隆菌落作為模板，以通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，隨后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，確定陽性克隆后進(jìn)行測序。對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，檢驗(yàn) dCas9-DNMT3A 的 DNA 甲基化水平調(diào)增效果。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

采用BIO-RAD(美國)CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。采用Oligo7軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見表2。試驗(yàn)采用15 μL反應(yīng)體系：上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，TB Green Premix Ex Taq II 7.5 μL，RNase free ddHO 4.5 μL。 反應(yīng)程序：先95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s， 共計(jì)39 個(gè)循環(huán)。以牛為內(nèi)參基因。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)組至少進(jìn)行3次以上的生物學(xué)重復(fù)，采用EXCEL 2010軟件對(duì)囊胚細(xì)胞中目的基因和內(nèi)參基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行處理，采用 2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SAS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 sgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A注射對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

如表3所示，相較于冷凍組((50.92±4.53)%、(13.25±1.19)%)而言，20、40、60 ng·μL注射組的卵裂率((54.62±4.62)%、(61.18±5.36)%、(55.41±3.18)%)和囊胚率((14.08±0.95)%、(22.58±2.12)%、(15.85±1.42)%)都有所提高。同時(shí)，40 ng·μL組發(fā)育能力最好，但仍顯著低于新鮮組((84.80±7.32)%、(40.57±3.28)%，<0.05)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

表3 外源注射sgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

2.2 sgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A注射對(duì)IGF2R甲基化的影響

如表4所示，與冷凍組相比，顯微注射40 ng·μLsgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A顯著提高2R啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平((14.33±1.19)%(9.33±0.56)%，<0.05)，與新鮮組無顯著差異((15.67±1.23)%，>0.05)。

2.3 sgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A注射對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

本試驗(yàn)利用熒光定量PCR對(duì)經(jīng)過40 ng·μL組調(diào)控后的玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞IVF囊胚中2R、-、1、-4基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。由圖1可以看出，40 ng·μL組中2R的mRNA表達(dá)量顯著低于冷凍組(<0.05)，與新鮮組相似(>0.05)。同時(shí)，40 ng·μL組1和-4的表達(dá)量顯著高于冷凍組和新鮮組(<0.05)，-表達(dá)量顯著高于冷凍組(<0.05)，與新鮮組相似(>0.05)。

3 討 論

在哺乳動(dòng)物基因組中，DNA 甲基化是一種表觀遺傳機(jī)制，可以將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的 C5 位置以形成 5-甲基胞嘧啶并通過招募參與基因抑制的蛋白質(zhì)或通過抑制轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 的結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。前期試驗(yàn)表明，玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞IVF囊胚中2R基因的甲基化水平會(huì)異常降低。查閱前人的試驗(yàn)也表明，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍會(huì)導(dǎo)致胚胎的DNA甲基化水平降低，在單峰駝、牛和小鼠卵母細(xì)胞中都得到過相似的結(jié)果。但在上述試驗(yàn)中，還未明確DNA甲基化水平異常降低是由冷凍損傷引起的還是由高濃度的抗凍劑化學(xué)毒性引起，故該部分內(nèi)容還有待論證，需要進(jìn)一步的研究。

表4 IGF2R啟動(dòng)子甲基化水平

同組數(shù)據(jù)上標(biāo)不同字母表示差異顯著 (P<0.05)Different letter superscripts in the same row means significant difference between the treatments (P<0.05)圖1 sgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A注射后IGF2R和發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平Fig.1 The expression level of IGF2R and development related genes after sgRNA and dCas9-SunTag-DNMT3A injection

有研究表明，受精卵顯微注射不影響發(fā)育。如表3所示, 相較于冷凍對(duì)照組，顯微注射dCas9-SunTag-DNMT3A和sgRNA均可有效提高玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞IVF胚胎的發(fā)育效果，其中40 ng·μL組的效果明顯好于 20 和60 ng·μL組。本試驗(yàn)中，20 ng·μL組的注射濃度較低且沒有達(dá)到顯著的調(diào)控效果，這可能是由于編輯效率會(huì)隨著注射劑量的增加而提高。同時(shí)，60 ng·μL組調(diào)控效果也不理想，這可能是由于高濃度的9 mRNA 與gRNA 顯微共注射后具有一定的細(xì)胞毒性，會(huì)對(duì)細(xì)胞有一定的副作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的發(fā)育效果降低。

至今，dCas9-SunTag-DNMT3A 已被成功應(yīng)用于甲基化精準(zhǔn)調(diào)控中。2016年，Liu等利用 dCas9-SunTag-DNMT3A 靶向兩個(gè) CTCF 結(jié)合位點(diǎn)，誘導(dǎo)了這些位點(diǎn)中 CpG 的從頭甲基化，成功抑制了相關(guān)基因的表達(dá)，并干擾了相關(guān)蛋白質(zhì)的功能。2017年，Huang等證實(shí)，該系統(tǒng)具有甲基化效率高、脫靶效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究表明，40 ng·μL組中2R啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與新鮮組相似，顯著高于冷凍組，這為冷凍卵母細(xì)胞IVF胚胎中基因甲基化的精準(zhǔn)調(diào)控提供了有效參考。

DNA 甲基化一般與基因表達(dá)水平抑制或沉默相關(guān)。同時(shí)DNA 甲基化在協(xié)調(diào)所有物種的2R 等位基因表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用。本研究表明，注射40 ng·μL的sgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3A后，顯著降低2R基因的mRNA表達(dá)水平，這主要是由于調(diào)控系統(tǒng)升高了2R基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。Hiura等證實(shí)了母體印跡的建立與卵母細(xì)胞的生長有關(guān)。同時(shí)，2R在動(dòng)物胚胎發(fā)育、胎兒生長和疾病中發(fā)揮重要作用。小鼠中2R 敲除導(dǎo)致胚胎過度生長。IGF2R是IGF2的受體，2基因編碼一種在組織分化、胎兒生長中起關(guān)鍵作用的生長因子，綜上所述，通過正向調(diào)節(jié)2R基因的表達(dá)就能夠?qū)β涯讣?xì)胞的生長發(fā)育起到積極的作用。前人研究表明，-是衡量體外生產(chǎn)牛胚胎發(fā)育能力和質(zhì)量的指標(biāo)，1是囊胚滋養(yǎng)外胚層分化的重要標(biāo)志物，-4 在建立和維持胚胎的多能性中發(fā)揮重要作用，三者的表達(dá)水平均能反映胚胎的發(fā)育情況和質(zhì)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，40 ng·μLsgRNA和dCas9-SunTag-DNMT3注射后囊胚中-、1、-4基因的表達(dá)水平上升，這可能是由于dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化調(diào)控系統(tǒng)提高了2R基因啟動(dòng)子的甲基化水平，降低了2R基因的表達(dá)水平，使之恢復(fù)正常，從而提高了玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞IVF胚胎的發(fā)育能力，顯著提高了體外生產(chǎn)胚胎的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，注射40 ng·μLdCas9-SunTag-DNMT3A甲基化編輯系統(tǒng)后，成功提高了玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞IVF囊胚中2R基因啟動(dòng)子甲基化水平(<0.05)并降低了其mRNA表達(dá)水平(<0.05)，使得玻璃化冷凍卵母細(xì)胞IVF胚胎的發(fā)育能力得到顯著提高。本研究結(jié)果將為玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的廣泛、安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。