胡哲煒，謝儲康，陳艷瓊，周 爍，張才喬

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，杭州 310058)

商品雞在200 d左右產(chǎn)蛋率可達(dá)95%以上，在480 d后產(chǎn)蛋量快速下降。老年母雞產(chǎn)蛋量的下降主要是由于卵巢老化，伴隨著內(nèi)分泌變化，卵黃合成和積累減少，以及進(jìn)入排卵前階段的卵泡數(shù)量減少。

卵巢衰退的主要因素之一是細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)積聚引起的氧化應(yīng)激。在正常細(xì)胞中，抗氧化防御系統(tǒng)來清除ROS，從而減輕氧化應(yīng)激損傷。然而，由于在老化過程中抗氧化劑水平逐漸降低，活性氧生成和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡可能會被破壞。ROS過度累積引起的氧化應(yīng)激是家禽卵巢組織衰退主要因素。一定水平范圍的ROS有助于維持細(xì)胞的正常信號傳導(dǎo)，但是過量的ROS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而損傷細(xì)胞和機(jī)體。在嚙齒動(dòng)物類的研究表明，大鼠和小鼠卵泡閉鎖和卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡由卵巢組織中ROS水平升高導(dǎo)致。肝抗氧化防御功能的降低是導(dǎo)致老齡母雞產(chǎn)蛋性能下降的原因。近幾年，研究人員常篩選天然植物提取物用于緩解氧化應(yīng)激引起的組織損傷。天然植物提取物主要通過兩種途徑發(fā)揮抗氧化作用，一種是對自由基的直接清除，另一種是通過激活與抗氧化作用相關(guān)的信號通路調(diào)節(jié)抗氧化基因和蛋白表達(dá)的水平。Nrf2是一種重要的抗氧化基因細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與細(xì)胞內(nèi)多種氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的調(diào)控。Nrf2可以抑制炎癥發(fā)生，促進(jìn)HO-1表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡。在蛋雞衰老過程中，蛋雞卵巢抗氧化能力下降，同時(shí)Nrf2/HO-1信號通路活性降低。但激活Nrf2/HO-1信號通路是否能夠增強(qiáng)衰老蛋雞卵巢抗氧化能力仍鮮有報(bào)道。

目前，對衰老的研究多采用建立實(shí)驗(yàn)性衰老模型，在國內(nèi)應(yīng)用最多的是D-半乳糖(D-galactose，D-gal)誘導(dǎo)的衰老模型。D-gal誘導(dǎo)衰老模型特征與自然衰老特征相似，表現(xiàn)為氧化還原失衡、細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞退行性變化等。實(shí)驗(yàn)室先前的研究也驗(yàn)證了D-gal誘導(dǎo)的卵巢衰老模型與動(dòng)物機(jī)體正常衰老相似。

蘆薈大黃素(aloe-emodin, AE)，一種天然的蒽醌衍生物，廣泛應(yīng)用于掌跖、虎杖、何首烏等中草藥中。蘆薈大黃素作為中藥已被用作中藥已有2000多年的歷史，目前仍存在于各種中藥制劑中。蘆薈大黃素具有廣泛的藥理作用，包括抗癌、保肝、抗炎、抗氧化和抗菌等。本研究通過給580日齡(D580)蛋雞注射AE比較母雞肝中卵黃前體的形成和卵泡氧化應(yīng)激水平，以闡明AE對衰老蛋雞產(chǎn)蛋性能的緩解作用，再通過建立體外卵泡衰老模型，揭示AE通過Nrf2/HO-1信號途徑緩解衰老蛋雞卵泡的氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

衰老海蘭白蛋雞(D580)購買自嘉興鑫源旺綠色生態(tài)蛋雞養(yǎng)殖場。將D580蛋雞隨機(jī)分為4組，分別經(jīng)腹腔注射5、10和20 mg·kgAE或等量的生理鹽水(對照組)。

1.2 樣品采集

對D580蛋雞進(jìn)行稱重，并在下次排卵前12 h翅下靜脈采血進(jìn)行血清的分離。對所有蛋雞頸部脫臼致死，一部分取出的肝組織于4%多聚甲醛(PFA)中固定用于石蠟組織切片，另一部分保存于液氮中用于RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)；取卵巢組織稱重，采集等級前卵泡，按直徑分為大黃卵泡(large yellow follicle，LYF，8～10 mm)、 小黃卵泡(small yellow follicle，SYF，6～8 mm)、 大白卵泡(large white follicle，LWF，4～6 mm) 和小白卵泡(small white follicle，SWF，2～4 mm)， 同時(shí)采集等級卵泡(F1～F6),分別稱取等級卵泡質(zhì)量和各級卵泡數(shù)量，取一部分SWFs于4%PFA中固定，用于石蠟組織切片，另一部分保存于液氮中，用于RNA提取及RT-PCR試驗(yàn)。

1.3 SWF培養(yǎng)

將采集的SWFs用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)清洗，洗凈表面的紅細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至含有1%雙抗的DMEM中。將SWFs用無菌PBS清洗3～5次。在24孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)放入0.45 μm的濾紙片和卵泡，然后加入含有5%FCS、100 IU·mL青霉素、100 μg·mL鏈霉素、2 mmol·L谷氨酰胺和1×ITS(ITS: 30 nmol·L亞硒酸鈉，5 μg·mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和10 μg·mL胰島素)的完全培養(yǎng)基，同時(shí)添加不同劑量D-gal(0.1、1.0、10.0 mL·mg)。將24孔板置于38.5 ℃的CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，觀察SWFs形態(tài)變化、細(xì)胞凋亡率和增殖率，篩選最佳D-gal 濃度用于建立體外衰老卵泡模型。隨后，在建立的體外衰老卵泡模型中添加不同濃度(5、10、20 μg·mL) 的AE，通過卵泡組織形態(tài)觀察、細(xì)胞增殖率和凋亡率測定，選擇適宜的AE處理濃度。在組織培養(yǎng)過程中，用D-gal、AE、Nrf2激活劑DMF(3 μmol·L)或抑制劑ML385(6 μmol·L)單獨(dú)或聯(lián)合處理培養(yǎng)的卵泡，72 h后進(jìn)行形態(tài)觀察、生化指標(biāo)測定、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和免疫熒光檢測。

1.4 組織切片制作和組織染色

固定24 h后的組織，用酒精逐級脫水、石蠟包埋和切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)或原位末端凋亡法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)染色后觀察。培養(yǎng)的卵泡組織在體外培養(yǎng)48 h后，在添加10 μg·mL5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集組織制作石蠟切片。用酒精逐級脫水、石蠟包埋和切片，經(jīng)小鼠抗BrdU抗體(RT1081，HUABIO，杭州)染色后觀察。

1.5 RT-PCR檢測組織mRNA

采集衰老蛋雞的肝組織和培養(yǎng)后的卵泡，研磨后置于冰盒上，Trizol法提取總RNA。提取的RNA通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系為15 μL。參照GenBank中蛋雞及內(nèi)參-的基因序列，通過Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。基因引物均由上海生工合成。每個(gè)RT-PCR均進(jìn)行至少9個(gè)重復(fù)，使用2-ΔΔ法以-為內(nèi)參基因測定相對mRNA表達(dá)水平。

1.6 Western blot

將樣品研磨后至于離心管中，管內(nèi)加入500 μL RIPA和5 μL PMSF，60 Hz勻漿15 s，12 000 r·min離心15 min。離心后的樣品吸取上清液至新的離心管中，根據(jù)說明書用BCA試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定上清液中蛋白濃度。按4∶1的比例混合22 μg蛋白與5×SDS-PAGE loading buffer，99 ℃ 變性10 min。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳45 min后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加一抗孵育。所用的一抗包括：兔抗PCNA(R1306-5, 1∶500 稀釋)、兔抗Caspase 3(ER1802-42, 1∶500稀釋)、兔抗Nrf2(ER1706-41，1∶1 000稀釋)、兔抗phospho-Nrf2(ET1608-28，1∶500稀釋)、兔抗phospho-NQO1(ET1702-50，1∶500稀釋)、兔抗phospho-HO-1(ER1802-73，1∶500稀釋)、小鼠抗phospho-β-肌動(dòng)蛋白(EM21002，1∶10 000稀釋，HUABIO, 杭州)，在4 ℃ 孵育過夜。次日室溫?fù)u床復(fù)溫1 h，用TBST(每升含2.45 g Tris、8.77 g NaCl和20% Tween-20)洗膜后，二抗室溫?fù)u床孵育(HRP標(biāo)記鼠二抗，1∶10 000 稀釋；HRP標(biāo)記兔二抗，1∶10 000稀釋)1 h，用TBST洗膜后，用ECL化學(xué)發(fā)光液(弗德生物)進(jìn)行顯色。蛋白條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

表1 引物信息

1.7 肝和血清指標(biāo)

采集的全血分離出血清，保存于-20 ℃，依據(jù)試劑盒說明書測定血清激素指標(biāo)(Abbott，Lisnamuck, Ireland)，包括谷胱甘肽(glutathione，GSH)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和過氧化氫(hydrogen peroxide，HO)。

肝組織與生理鹽水按1∶100混合后充分研磨，3 000 r·min離心15 min，取上清，-20 ℃保存，用于總膽固醇(total cholesterol，TC)的測定。按照試劑盒說明書進(jìn)行TC的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定。所用試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量藥物處理后卵巢質(zhì)量、卵泡數(shù)量和體重的變化

注射10 mg·kgAE后，母雞體重降低了11.54%。同時(shí)，LYF、SYF、LWF和SWF數(shù)量分別上升了32.00%、34.62%、50.00%和54.21%(圖1)。本文選擇10 mg·kgAE進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

A. 體重；B. 卵巢質(zhì)量；C. 排卵前卵泡質(zhì)量；D. 大黃卵泡、小黃卵泡、大白卵泡和小白卵泡數(shù)量。字母不同表示有顯著差異，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001A. Body weight; B. Ovarian weight; C. Preovulatory follicle weight; D. Number of large yellow, small yellow, large white and small white follicles. Different letters represent significant differences, *. P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001圖1 不同劑量AE對衰老蛋雞體重、卵巢質(zhì)量和卵泡數(shù)量的影響Fig.1 Effects of different doses of AE on body weight, ovarian weight and follicle number of aging layers

2.2 AE對抗氧化能力變化的影響

與對照組相比，注射10 mg·kgAE組顯著升高了蛋雞卵泡GSH、T-SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT和GSH-ST水平(分別提高了46.73%、25.08%、9.61%、37.44%、18.90%和31.18%)。并且注射10 mg·kgAE可以使蛋雞卵泡中MDA和HO水平分別降低49.41%和72.58%。另外，注射10 mg·kgAE蛋雞卵泡中E水平升高了34.14%，同時(shí)P水平提高6.8倍。注射10 mg·kgAE處理還可以顯著升高肝組織中TG水平(71.52%)。此外，注射10 mg·kgAE處理后D580蛋雞卵泡ERα和ERβ表達(dá)量顯著升高(圖2)。

2.3 AE對肝卵黃合成和沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用RT-PCR方法檢測肝卵黃合成和脂肪酸合成相關(guān)基因，如圖3所示，注射10 mg·kgAE可以明顯提高蛋雞肝卵黃合成相關(guān)基因(、、、、)表達(dá)水平，但是基因表達(dá)水平明顯下降(<0.05或<0.01)。同時(shí)，注射10 mg·kgAE還可以提高卵黃沉積相關(guān)基因Ⅱ、Ⅱ、、和表達(dá)水平(<0.05或<0.01)。

2.4 D-gal誘導(dǎo)衰老卵泡模型建立

D-gal(0.1、1.0和10.0 mg·mL)體外處理D280蛋雞SWF。培養(yǎng)72 h后，H&E染色結(jié)果顯示，對照組SWF形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞排列規(guī)則；0.1 mg·mLD-gal處理后，部分顆粒細(xì)胞出現(xiàn)排列松散、不規(guī)則，卵泡基本維持在原來的形態(tài)；1 mg·mLD-gal處理后，大部分顆粒細(xì)胞排列松散且不規(guī)則，出現(xiàn)核固縮。10 mg·mLD-gal處理后，SWF和顆粒細(xì)胞受損嚴(yán)重，幾乎所有的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則排布，SWF發(fā)生凋亡并出現(xiàn)空洞(圖4A)。TUNEL染色顯示，對照組只有極少量的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，D-gal誘導(dǎo)卵泡組織細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性增多(圖4A)。Western blot 結(jié)果顯示，在D-gal誘導(dǎo)衰老卵泡中，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量顯著下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase3的表達(dá)量顯著上調(diào)，這些變化呈D-gal劑量依賴性(圖4B)。

2.5 不同劑量AE對D-gal誘導(dǎo)小白卵泡衰老的保護(hù)作用

經(jīng)不同劑量AE對10 mg·mLD-gal體外誘導(dǎo)衰老保護(hù)的D280蛋雞小白卵泡HE染色結(jié)果顯示，AE對小白卵泡衰老的保護(hù)作用呈劑量依賴性增加后下降。與對照組相比，低劑量AE(5 μg·mL)組，出現(xiàn)輕微好轉(zhuǎn)，部分顆粒細(xì)胞出現(xiàn)排列松散、不規(guī)則，卵泡基本維持在原來的形態(tài)。在中劑量AE(10 μg·mL)組，生長卵泡形態(tài)相對正常，顆粒細(xì)胞規(guī)則排布。高劑量 AE(20 μg·mL)組，保護(hù)效果不如中劑量組，顆粒細(xì)胞排列較松散。通過BrdU檢測不同劑量AE對10 mg·mLD-gal體外誘導(dǎo)衰老D280蛋雞SWF細(xì)胞凋亡保護(hù)的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著AE劑量的加大直至10 μg·mL時(shí)，小白卵泡中增殖細(xì)胞逐漸增多。而20 μg·mL的AE處理后，細(xì)胞增殖率反而下降(圖5A)。Western blot結(jié)果顯示，在AE保護(hù)D-gal誘導(dǎo)衰老卵泡中，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量隨著AE劑量增加至中劑量AE(10 μg·mL)時(shí)顯著上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞凋亡關(guān)蛋白Caspase3的表達(dá)量顯著下調(diào)，這些變化在高劑量AE(20 μg·mL)時(shí)反而不如中劑量組顯著(圖5B)。

A. 抗氧化能力；B. 氧化指標(biāo)；C. 血清激素水平和肝TG水平；D. ERs表達(dá)水平。*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001A. Antioxidant capacity; B. Oxidation index; C. Serum hormone level and liver TG level; D. The expression level of ERs. *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001圖2 AE對衰老蛋雞SWF抗氧化能力和肝三酰甘油合成能力的影響Fig.2 Effects of AE on antioxidant capacity of ovary and triglyceride synthesis of liver in aging laying hens

β-actin 為內(nèi)參基因，各組數(shù)據(jù)均為β- actin is an internal reference gene, and the data of each group are the mean±standard error (n=9). *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001圖3 AE對衰老蛋雞肝卵黃合成和沉積相關(guān)基因的影響Fig.3 Effects of AE on genes related to yolk synthesis and deposition in liver of aging laying hens

A. 熒光染色，標(biāo)尺：20 μm；HE染色，標(biāo)尺：50 μm；B. 體外培養(yǎng)72 h后280日齡蛋雞小白卵泡組織通過Western blot檢測PCNA和Caspase3表達(dá)的變化。不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Immunofluorescence staining, scale bar: 20 μm; HE staining, scale bar: 50 μm; B. The expression of PCNA and Caspase3 in 280-day-old laying hens were detected by Western blot after 72 h culture. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖4 D-gal誘導(dǎo)卵泡衰老模型的建立Fig.4 Establishment of follicular aging model induced by D-gal

A. 熒光染色，標(biāo)尺：20 μm；HE染色，標(biāo)尺：50 μm；B. 體外培養(yǎng)72 h后280日齡蛋雞小白卵泡組織通過Western blot檢測PCNA和Caspase3的表達(dá)變化。不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Immunofluorescence staining, scale bar: 20 μm; HE staining, scale bar: 50 μm; B. Expression of PCNA and Caspase3 in 280-day-old laying hens were detected by Western blot after 72 h culture. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖5 不同劑量AE對D-gal誘導(dǎo)小白卵泡衰老的保護(hù)作用Fig.5 Protective effects of different doses of AE on aging of small white follicles induced by D-gal

2.6 AE對體外培養(yǎng)卵泡氧化應(yīng)激損傷的緩解作用

選取10 mg·mLD-gal和10 μg·mLAE進(jìn)行AE緩解卵泡氧化應(yīng)激損傷對比試驗(yàn)。HE染色結(jié)果顯示，對照組卵泡組織內(nèi)生長卵泡形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞規(guī)則排布。D-gal組SWF和顆粒細(xì)胞受損嚴(yán)重，幾乎所有的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則排布，SWF發(fā)生凋亡并出現(xiàn)空洞。而在D-gal+AE組，這一現(xiàn)象得到了緩解，僅有部分顆粒細(xì)胞出現(xiàn)排列松散、不規(guī)則。AE組生長卵泡形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞規(guī)則排布，與對照組相比有促進(jìn)作用。通過BrdU檢測細(xì)胞凋亡或增殖的影響，結(jié)果顯示，D-gal組只有極少量細(xì)胞增殖現(xiàn)象。在D-gal+AE組，小白卵泡中增殖細(xì)胞顯著增多，甚至超過對照組。AE組細(xì)胞增殖明顯，超過對照組。說明AE能緩解卵泡氧化應(yīng)激損傷(圖6A)。Western blot結(jié)果顯示，D-gal組PCNA的表達(dá)量顯著下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase3的表達(dá)量顯著上調(diào)，而在D-gal+AE組這一現(xiàn)象緩解，且AE組與對照組相比有促進(jìn)作用，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖6B)。

A. 熒光染色，標(biāo)尺：20 μm；HE染色，標(biāo)尺：50 μm；B. 體外培養(yǎng)72 h后280日齡蛋雞小白卵泡組織通過Western blot檢測PCNA和Caspase3的表達(dá)的變化。各組數(shù)據(jù)均為不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Immunofluorescence staining, scale bar: 20 μm; HE staining, scale bar: 50 μm; B. Expression of PCNA and Caspase3 in 280-day-old laying hens were detected by Western blot after 72 h culture. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖6 AE對卵泡氧化應(yīng)激損傷的緩解作用Fig.6 Alleviating effect of AE on ovarian oxidative stress damage

2.7 AE對體外培養(yǎng)卵泡抗氧化能力變化的影響

AE處理可以明顯提高蛋雞卵泡體外培養(yǎng)中GSH-Px、T-AOC、GSH、GSH-ST水平，并且AE處理可降低卵泡中MDA和HO水平(圖7)。

2.8 AE對Nrf2/HO-1通路活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，D-gal誘導(dǎo)衰老卵泡pNrf2/Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)量顯著下調(diào)，AE單獨(dú)處理組和D-gal與AE聯(lián)合處理組 Nrf2、2和-1的表達(dá)水平與對照組無顯著差異(圖8A)。RT-PCR結(jié)果顯示，D-gal處理顯著下調(diào)2和-1基因的表達(dá)水平，同時(shí)添加AE處理可有效緩解2和-1基因的表達(dá)水平的降低。與對照組相比，單獨(dú)使用AE處理能顯著上調(diào)-1基因的表達(dá)水平，D-gal與AE聯(lián)合處理顯著上調(diào)2基因的表達(dá)水平(圖8B)。對2-1下游幾種抗氧化基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，、、和基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，同時(shí)添加AE處理不同程度的緩解這些基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)；、、和基因在AE單獨(dú)處理組以及D-gal和AE聯(lián)合處理組SWF中的表達(dá)水平顯著高于對照組(圖8B)。D-gal下調(diào)SWF中Nrf2/HO-1通路活性，添加AE處理，Nrf2/HO-1通路活性得到有效緩解。

A. 抗氧化能力；B. 氧化指標(biāo)。各組數(shù)據(jù)均為不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Antioxidant capacity; B. Oxidation index. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖7 AE對衰老蛋雞體外卵泡抗氧化能力的影響Fig.7 Effect of AE on antioxidant capacity of ovary in aging layers in vitro

為進(jìn)一步探究AE對D-gal誘導(dǎo)衰老卵泡氧化應(yīng)激的緩解作用是否通過Nrf2/HO-1信號通路的激活實(shí)現(xiàn)，本試驗(yàn)選取ML385和DMF分別作為Nrf2/HO-1信號通路的阻斷劑和激活劑，檢測激活和抑制Nrf2/HO-1信號通路后，AE是否仍發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。Western blot結(jié)果顯示，3 μmol·LDMF單獨(dú)處理72 h后，SWF中pNrf2/Nrf2和HO-1的表達(dá)量顯著高于對照組；與對照組相比，D-gal單獨(dú)處理顯著降低HO-1和pNrf2/Nrf2的表達(dá)水平；D-gal與DMF聯(lián)合處理可使SWF中pNrf2/Nrf2的表達(dá)量恢復(fù)至對照組水平；D-gal與AE聯(lián)合處理組SWF中HO-1的表達(dá)量與對照組均無顯著差異(圖9)。單獨(dú)使用ML385(6 μmol·L)處理72 h后，SWF中pNrf2/Nrf2和HO-1的表達(dá)量顯著高于對照組；與對照組相比，D-gal單獨(dú)處理顯著降低pNrf2/Nrf2和HO-1的表達(dá)水平；D-gal與DMF聯(lián)合處理，使SWF中pNrf2/Nrf2的表達(dá)量恢復(fù)至對照組水平；D-gal與AE聯(lián)合處理組SWF中HO-1的表達(dá)量與對照組均無顯著差異(圖9)。

A.Western blot; B.RT-PCR。不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)A.Western blot; B.RT-PCR. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖8 AE對Nrf2/HO-1通路活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of AE on Nrf2/HO-1 pathway

不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖9 Nrf2激活劑和阻斷劑對蘆薈大黃素對D-gal誘導(dǎo)衰老卵泡氧化應(yīng)激緩解作用的變化Fig.9 Effects of Nrf2 activators and inhibitors on the alleviating effect of AE on oxidative stress on aging follicles induced by D-gal

3 討 論

母雞在達(dá)到性成熟后，卵巢中存在大量生長緩慢的直徑在2～6 mm的卵泡以維持產(chǎn)蛋進(jìn)程，機(jī)體每天會篩選出1個(gè)直徑6～8 mm卵泡進(jìn)入快速發(fā)育階段。在等級前卵泡中，肝合成大量的卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG)和載脂蛋白(apolipoprotein，APO)，經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)送至卵巢，在卵泡中沉積。越來越多的證據(jù)表明，隨著年齡的增長，雌性小鼠和人類在卵泡儲備和卵母細(xì)胞質(zhì)量方面都有一定程度的下降。卵巢衰老的主要原因是ROS在卵巢中逐漸積累引起的氧化應(yīng)激。在衰老過程中，ROS發(fā)生積聚，同時(shí)，機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平降低，氧化還原水平失衡，最終導(dǎo)致器官功能失常。6和12月齡大鼠小腦組織中SOD、CAT和GSH水平顯著高于18月齡大鼠。卵巢衰老影響了母禽的商業(yè)價(jià)值。然而，關(guān)于蛋雞卵巢衰老引起的卵泡質(zhì)量下降機(jī)制的研究很少。闡明卵巢內(nèi)卵泡衰老和緩解氧化應(yīng)激的機(jī)制可延長母禽產(chǎn)蛋周期，從而提高產(chǎn)蛋性能。

蛋雞產(chǎn)蛋量在500日齡后急劇下降。因此，了解老化過程中蛋雞產(chǎn)蛋性能下降的機(jī)理，能夠采取有效措施緩解卵巢衰老，從而提升母雞的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。越來越多的證據(jù)表明，補(bǔ)充食用抗氧化劑是減輕卵泡氧化應(yīng)激的有效措施。蘆薈大黃素是一種蒽醌類多酚化合物，存在于一些傳統(tǒng)藥用植物中，如決明子、大黃和何首烏。蘆薈大黃素具有多種藥理作用。蘆薈大黃素可能是大黃和決明子的肝毒性成分之一。作為植物中有效的抗氧化劑之一，蘆薈大黃素被廣泛用于防止氧化應(yīng)激介導(dǎo)的組織損傷。先前的研究已經(jīng)證實(shí)蘆薈大黃素通過上調(diào)p53的表達(dá)、刺激p21/WAF1、下調(diào)calpain-2(CAPN2)和泛素蛋白連接酶E3A(UBE3A)來促進(jìn)人肝癌細(xì)胞系的抗增殖和凋亡。然而，蘆薈大黃素在蛋雞卵巢衰老，特別是卵泡衰老中的抗氧化作用尚未明確闡明。在本研究中，腹腔注射AE顯著提高了D580蛋雞卵泡中GSH水平、T-SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC活性，且MDA和HO含量顯著降低，這說明AE可以提高衰老蛋雞卵泡抗氧化水平、血清E水平、肝TC水平以及參與蛋黃前體合成的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄。

D-gal誘導(dǎo)的卵巢衰老模型顯示，卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，顯著下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量，同時(shí)顯著上調(diào)細(xì)胞凋亡關(guān)蛋白Caspase3的表達(dá)量。在D-gal誘導(dǎo)衰老模型中，通常伴隨著因抗氧化酶活性降低和氧化產(chǎn)物增多引起的氧化應(yīng)激。這說明D-gal誘導(dǎo)的衰老模型與氧化應(yīng)激模型相關(guān)，因?yàn)榭寡趸富钚越档团c氧化劑水平升高之間存在明確的關(guān)系。在本研究中，觀察到在D-gal誘導(dǎo)的衰老卵泡中，與對照組相比，GSH、T-AOC 的含量以及T-SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低，而MDA和HO的水平顯著提高。同時(shí)，D-gal誘導(dǎo)衰老組織中，卵泡顆粒細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)損傷，這些現(xiàn)象在添加AE處理后得到緩解。本研究發(fā)現(xiàn)，D-gal誘導(dǎo)卵泡組織細(xì)胞凋亡率升高、細(xì)胞增殖率降低，同時(shí)添加AE處理，顯著緩解這些現(xiàn)象。通過體外試驗(yàn)研究AE緩解卵泡氧化應(yīng)激損傷發(fā)現(xiàn)，AE能緩解D-gal造成的卵泡結(jié)構(gòu)異常，同時(shí)可以使細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡關(guān)蛋白Caspase3的表達(dá)量顯著下調(diào)。

Nrf2是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，對氧化應(yīng)激具有細(xì)胞保護(hù)作用。CAT、SOD和HO-1的表達(dá)以及GSH的合成均受Nrf2調(diào)節(jié)。Nrf2/HO-1途徑的激活誘導(dǎo)小鼠腎中GSH、CAT和SOD水平升高。先前的研究表明，Nrf2表達(dá)及其靶基因表現(xiàn)出年齡依賴性下降。在本研究中，作者檢測自然衰老母雞卵泡中相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，研究了衰老與Nrf2/HO-1通路活性的影響。然后研究了蘆薈大黃素對D-gal誘導(dǎo)的衰老卵泡氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。此外，還證實(shí)了蘆薈大黃素對自然衰老卵泡氧化應(yīng)激的潛在抑制作用。本研究表明，衰老過程中卵泡中Nrf2/HO-1通路的活性顯著降低。

Nrf2/HO-1途徑的激活可上調(diào)許多抗氧化基因的表達(dá)，并減輕組織中的氧化應(yīng)激。Su等證明，Nrf2誘導(dǎo)HO-1需要轉(zhuǎn)錄阻遏物BACH1失活。AE對氧化應(yīng)激的保護(hù)作用是通過激活Nrf2/HO-1或AKT/mTOR/MAPK信號途徑實(shí)現(xiàn)的。Abdellatef等報(bào)道，AE通過上調(diào)Nrf2介導(dǎo)的HO-1抑制TNFα誘導(dǎo)的信號通路的激活內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。在本研究中，D-gal處理顯著降低了Nrf2、pNrf2、HO-1的表達(dá)，同時(shí)補(bǔ)充AE緩解了這種下降的趨勢，與對照組相比，單獨(dú)使用AE顯著上調(diào)了Nrf2、HO-1和pNrf2的表達(dá)。為了闡明AE與氧化應(yīng)激相關(guān)的保護(hù)作用機(jī)制，分別添加Nrf2的激活劑DMF和Nrf2的抑制劑，這些結(jié)果表明，AE對衰老卵泡氧化應(yīng)激的保護(hù)作用與DMF相似，而ML385處理消除了AE對衰老卵泡氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

AE提高D580母雞卵黃沉積能力，并通過激活Nrf2/HO-1途徑提高了D580母雞卵泡的體外抗氧化能力，并維持了細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡。

綜上所述，AE能夠緩解衰老母雞產(chǎn)蛋性能下降，提高蛋雞的經(jīng)濟(jì)效益，為提高家禽的產(chǎn)蛋性能提供理論依據(jù)，為禽蛋的高質(zhì)量生產(chǎn)具有實(shí)際意義。同時(shí)，采用中藥解決產(chǎn)蛋量下降問題的新思路為日后研究蛋雞的生產(chǎn)性能、禽蛋的產(chǎn)出等開拓了新方法。

4 結(jié) 論

AE可以提升血清E水平和卵黃遞質(zhì)合成中的關(guān)鍵基因(Ⅱ、、Ⅱ、、、、、、Ⅰ和)，從而提高蛋黃前體的合成能力。AE通過激活衰老卵泡Nrf2/HO-1信號通路，提高衰老蛋雞卵泡的抗氧化能力，發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而延緩蛋雞卵巢衰退。