李岳鵬，丁嘉烽，張獻(xiàn)顥，李帥辰，張建濤，王洪斌*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省普通高等學(xué)校 動(dòng)物普通疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

奶牛蹄葉炎是一種較為嚴(yán)重且多發(fā)的肢蹄病，患病奶牛常常出現(xiàn)蹄部疼痛，蹄殼變形，以及多種并發(fā)癥，造成奶牛的繁殖能力和泌乳能力的大幅度下降。由于患有蹄葉炎奶牛的淘汰率高，因此造成了巨大的損失。本文通過對機(jī)體主要的能量代謝器官(肝和肌肉)在患急性蹄葉炎的奶牛中能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的變化，來反應(yīng)急性蹄葉炎奶牛體內(nèi)的能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的變化，為之后的奶牛蹄葉炎的研究提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

三磷酸腺苷激酶(5′-adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是一種高度保守的調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝狀態(tài)的激酶，通過調(diào)節(jié)AMP/ATP的比值來調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，當(dāng)在細(xì)胞處于低能量電荷的狀態(tài)下AMPK被高AMP/ATP比值激活時(shí)，此時(shí)該激酶的作用是降低消耗ATP的合成代謝途徑的活性，并增加產(chǎn)生ATP的分解代謝途徑的活性。根據(jù)組織的不同，在不同的生理情況都有可能激活A(yù)MPK，例如低血糖、組織局部缺血、熱休克和劇烈運(yùn)動(dòng)。雖然AMPK的常見激活途徑是在劇烈運(yùn)動(dòng)的誘導(dǎo)下在骨骼肌中進(jìn)行的，但該激酶仍然在許多其他組織(如心、脂肪組織、肝)的代謝調(diào)節(jié)中起著十分關(guān)鍵作用。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucose transporter-1，GLUT-1)是一種非胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要負(fù)責(zé)大腦、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞等組織中的基礎(chǔ)葡萄糖攝取。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(glucose transporter-4，GLUT-4)僅在胰島素敏感的組織中表達(dá)。GLUT-4蛋白在基礎(chǔ)狀態(tài)下主要定位于細(xì)胞器內(nèi)，在大鼠和人的心、骨骼肌和脂肪組織等組織中表達(dá)，受胰島素刺激后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，發(fā)揮跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的功能。胰島素通過刺激周圍組織特別是骨骼肌和脂肪組織中的葡萄糖攝取和糖原積累，來防止進(jìn)食后血糖濃度過高，當(dāng)GLUT-4蛋白易位或功能受損時(shí)，就容易發(fā)生胰島素抵抗。

本研究選用機(jī)體的高代謝組織肝和骨骼肌，通過檢測AMPK、p-AMPK、GLUT蛋白和基因以及其他相關(guān)基因的表達(dá)來探究奶牛急性蹄葉炎對機(jī)體能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從同一奶牛場購進(jìn)12頭體格大小相近非妊娠期的中國荷斯坦母牛，年齡18～20月齡(20.67±3.01)，體重355～403 kg(379.7±19.77 kg)，參照Sprecher等的制定體況評分標(biāo)準(zhǔn)，評分2.7～3.3 (3.0±0.23)，無過往病史。每頭母牛在試驗(yàn)開始前進(jìn)行蹄部檢查和跛行評分確保奶牛蹄部健康無跛行，在正式試驗(yàn)前飼喂30 d飼草，保證奶牛自由采食，每天對奶牛進(jìn)行牽溜使奶牛適應(yīng)生存環(huán)境和試驗(yàn)流程，減少應(yīng)激。

將12頭奶牛隨機(jī)分為兩組(=6)，分別為試驗(yàn)組(OF組)和對照組(CON組)，OF組灌服大量低聚果糖，劑量為17 g·kg體重，溶于2 L·100 kg體重的溫水中，經(jīng)瘤胃導(dǎo)管一次性灌服。在之前3 d每天通過瘤胃導(dǎo)管灌服5%劑量的低聚果糖作為過渡期。CON組以同樣的方式給予等體積的溫水。在低聚果糖灌服后的72 h，將奶牛安樂死，取肝和肌肉組織。

為保證奶牛的動(dòng)物福利在低聚果糖灌服后的18和24 h給與補(bǔ)液。

1.2 組織樣本的采集和處理

在低聚果糖灌服后的72 h，將奶牛麻醉后，用活檢鉗夾取適量的肝組織；直接切取足量的臀后部肌肉，用無菌的PBS清洗去血跡，切碎后分裝到凍存管中，放入液氮中暫時(shí)保存，待采樣結(jié)束后放入-80 ℃ 冰箱中長期保存，備用。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

用Western blot的方法分別檢測肝和肌肉的AMPK、P-AMPK、GLUT-1、GLUT-4蛋白表達(dá)情況。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝和肌肉組織中、-1、-4、-γ、、1-α基因表達(dá)情況。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 主要儀器設(shè)備和試劑

JTFSTPRP-48組織研磨機(jī)(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)、Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、C1000 TouchPCR儀(美國伯樂公司)、NO-ONE AZY1708063超微量核酸蛋白測定儀(美國Gene公司)、Light Cycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(德國羅氏診斷儀器有限公司)。

AMPK、P-AMPK抗體購自美國CST公司。GLUT-1、CLUT-4抗體購自美國Novers公司。引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生物工程股份有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Spss22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素的方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用GraphPad Prism 5.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物表現(xiàn)

在試驗(yàn)過程中，所有CON組的奶牛均表現(xiàn)正常。低聚果糖灌服之后，OF組的奶牛最早在6 h開始出現(xiàn)腹瀉，同時(shí)出現(xiàn)跛行，隨后其他試驗(yàn)牛陸續(xù)開始出現(xiàn)不同程度的跛行，通過跛行評分(表2)斷定試驗(yàn)組的奶牛有明顯的跛行，并伴有腹瀉，體溫、蹄溫升高，指(趾)動(dòng)脈亢進(jìn)，瘤胃蠕動(dòng)減緩。依據(jù)奶牛的跛行情況和臨床癥狀判斷為奶牛急性蹄葉炎疾病模型建立成功。在試驗(yàn)過程中所有奶牛均以人道主義的方式對待。

表2 跛行評分表[15]

2.2 肝中AMPK和GLUT-1蛋白和基因以及其他基因的表達(dá)情況

與CON組相比OF組奶牛肝組織中AMPK基因和蛋白的表達(dá)量顯著增加(圖1A、B)(<0.05,<0.01)。 但OF組奶牛肝組織中的P-AMPK/AMPK的比值極顯著下降(<0.01)(圖2)。

OF組奶牛肝組織中GLUT-1基因和蛋白的表達(dá)量與CON組相比無顯著變化(>0.05)(圖3A、B)。同時(shí)OF組奶牛肝組織中-γ基因，1-α基因和基因的表達(dá)量無顯著變化(>0.05)(圖4～6)。

A. mRNA表達(dá)水平；B.蛋白表達(dá)水平。與CON組相比，*.P<0.05；**.P<0.01,下圖同A. mRNA expression；B. Protein expression. Compared with CON group, *. P<0.05; **. P<0.01, the same as below圖1 肝AMPK mRNA和蛋白表達(dá)水平變化Fig.1 Changes in AMPK mRNA and protein expression in liver

圖2 肝P-AMPK/AMPK比值Fig.2 Ratio of P-AMPK/AMPK in liver

2.3 肌肉中AMPK和GLUT-4蛋白和基因以及其他基因的表達(dá)情況

與CON組相比，OF組奶牛肌肉的AMPK基因和蛋白的表達(dá)量無顯著變化(>0.05)(圖7A、B)。但OF組奶牛的肌肉組織P-AMPK/AMPK比值顯著下降(<0.05)(圖8)。這表明奶牛急性蹄葉炎模型中肌肉組織的AMPK的磷酸化被抑制。

與CON組相比，OF組奶牛的肌肉組織中GLUT-4的蛋白表達(dá)量顯著下降，且差異極顯著，這與-4基因的變化相符合(<0.01)(圖9A、B)。這表明奶牛急性蹄葉炎過程中肌肉組織葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用被抑制。

A. mRNA表達(dá)水平；B.蛋白表達(dá)水平A. mRNA expression；B. Protein expression圖3 肝GLUT-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化Fig.3 Changes in GLUT-1 mRNA and protein expression in liver

圖4 肝PPAR-γ mRNA表達(dá)水平變化Fig.4 Changes in PPAR-γ mRNA expression in liver

圖5 肝PGC1-α mRNA表達(dá)水平變化Fig.5 Changes in PGC1-α mRNA expression in liver

圖6 肝PEPCK mRNA表達(dá)水平變化Fig.6 Changes in PEPCK mRNA expression in liver

結(jié)果表明，OF組奶牛肌肉組織的PPAR-γ基因的表達(dá)量極顯著升高(<0.01)(圖10)。這可能表明奶牛急性蹄葉炎模型肌肉組織ATP消耗迅速增加。OF組奶牛肌肉的PGC1-α mRNA表達(dá)量無顯著的變化(>0.05)，但PEPCK mRNA表達(dá)量極顯著升高(<0.01)(圖11、12)。

3 討 論

奶牛蹄葉炎是指奶牛蹄真皮的彌散性、無敗性炎癥，本病最常侵害前肢的內(nèi)側(cè)指和后肢的外側(cè)趾，其他指(趾)也有發(fā)病，高產(chǎn)奶牛的發(fā)病率更高。目前，關(guān)于蹄葉炎的病因和致病機(jī)理還沒有得到很好的解釋。較多的研究認(rèn)為蹄葉炎是動(dòng)物機(jī)體代謝紊亂的局部表現(xiàn)，在馬和奶牛上展開的研究結(jié)果均認(rèn)為，蹄葉炎的發(fā)生與組織的能量代謝衰竭有關(guān)。本試驗(yàn)在奶牛急性蹄葉炎的疾病模型下對高能代謝組織(肝和肌肉)的相關(guān)代謝指標(biāo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的情況進(jìn)行研究，探究患急性蹄葉炎奶牛的能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)情況。

AMPK(AMP-activated protein kinases)作為能量傳感器能實(shí)時(shí)監(jiān)測AMP和ATP的濃度，調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝。AMPK作為重要的能量調(diào)節(jié)樞紐已被廣泛研究。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK參與維持細(xì)胞極性，AMPK還可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激基因的表達(dá)，具有一定的抗氧化應(yīng)激的功能。此外，AMPK與自噬以及組織中的高炎癥反應(yīng)有關(guān)。AMPK有許多生產(chǎn)和激活的途徑，例如PPAR-γ能介導(dǎo)AMPK的轉(zhuǎn)錄活性和抑制AMPK的激活；而PGC1-α能增強(qiáng)AMPK表達(dá)和激活A(yù)MPK乙?；?。

A. mRNA表達(dá)水平；B.蛋白表達(dá)水平A. mRNA expression；B. Protein expression圖7 肌肉AMPK mRNA和蛋白表達(dá)水平變化Fig.7 Changes in AMPK mRNA and protein expression in muscle

圖8 肌肉P-AMPK/AMPK比值Fig.8 Ratio of P-AMPK/AMPK in muscle

在OF組奶牛肝組織中AMPK的基因表達(dá)量顯著增加，同時(shí)AMPK的蛋白表達(dá)量極顯著升高，而P-AMPK的蛋白表達(dá)量沒有明顯改變，導(dǎo)致P-AMPK/AMPK的比值極顯著下降，雖然相對于CON組奶牛磷酸化的AMPK無明顯改變，但是存在相對的磷酸化AMPK功能下降的趨勢。但在肝中GLUT-1的表達(dá)沒有顯著的下降，且其他基因指標(biāo)沒有顯著變化，這表明肝葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能并未受到影響，而磷酸化AMPK功能下降可能僅僅是灌服低聚果糖引起的奶牛肝能量代謝功能暫時(shí)性的紊亂，并未導(dǎo)致肝能量代謝功能受損。綜合AMPK、P-AMPK和CLUT-1的檢測結(jié)果表明，在奶牛急性蹄葉炎發(fā)生時(shí)可能并沒有顯著的影響肝的能量代謝，這與Burns等的試驗(yàn)結(jié)果相一致。在OF組的肌肉組織中AMPK的蛋白和基因的表達(dá)量均無明顯的改變，但OF組肌肉組織中-γ的基因表達(dá)量極顯著升高，而P-AMPK的蛋白表達(dá)量極顯著下降，P-AMPK/AMPK的比值顯著下降，過多的PPAR-γ表達(dá)能夠抑制AMPK的激活，這可能說明在奶牛急性蹄葉炎的肌肉組織中AMPK的磷酸化被明顯的抑制，沒有磷酸化的AMPK不能起到能量調(diào)節(jié)的作用，這說明急性蹄葉炎奶牛的肌肉組織存在能量代謝異常。

A. mRNA表達(dá)水平；B.蛋白表達(dá)水平A. mRNA expression；B. Protein expression圖9 肌肉GLUT-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化Fig.9 Changes in GLUT-4 mRNA expression and protein expression in muscle

圖10 肌肉PPAR-γ mRNA表達(dá)水平變化Fig.10 Changes in PPAR-γ mRNA expression in muscle

圖11 肌肉PGC1-α mRNA表達(dá)水平變化Fig.11 Changes in PGC1-α mRNA expression in muscle

圖12 肌肉PEPCK mRNA表達(dá)水平變化Fig.12 Changes in PEPCK mRNA expression in muscle

組織內(nèi)的葡萄糖攝取主要是通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，GLUT-4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胰島素敏感組織中表達(dá)，主要在大鼠和人的心、骨骼肌和脂肪組織中表達(dá)，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，受到胰島素刺激后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜。當(dāng)GLUT-4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生易位或功能受損時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗。GLUT-1是一種非胰島素依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在大腦、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，肝組織中表達(dá)，主要分布于細(xì)胞膜上。該蛋白是一種非胰島素依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白，主要位于基礎(chǔ)狀態(tài)的細(xì)胞膜中，不需要胰島素刺激即可上調(diào)和激活。

在OF組奶牛肝中-1的基因表達(dá)無顯著變化，同時(shí)蛋白表達(dá)量也無顯著變化；但OF組奶牛的肌肉組織中GLUT-4的蛋白和基因水平表達(dá)量均顯著下降，肌肉組織是胰島素敏感的組織，其葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)需依靠GLUT-4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。文獻(xiàn)[16]證實(shí)，OF組奶牛的血清胰島素濃度在6、12、36和48 h 與CON組相比顯著下降，這與肌肉中GLUT-4的轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白表達(dá)量極顯著下降相互印證，這也證明在奶牛急性蹄葉炎中肌肉的損傷也可能存在。

依據(jù)肝和肌肉組織中AMPK、p-AMPK/AMPK和GLUT的變化來看，肝作為能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要器官之一，并未受到奶牛急性蹄葉炎的顯著影響，但在這一疾病的發(fā)病過程中肌肉組織的能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受到了顯著的抑制，由此表明奶牛急性蹄葉炎能夠抑制肌肉的能量代謝和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，但對肝未發(fā)現(xiàn)明顯的影響。

4 結(jié) 論

通過檢測建立奶牛急性蹄葉炎疾病模型，檢測該模型中肝和骨骼肌的能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功能變化，發(fā)現(xiàn)奶牛急性蹄葉炎對機(jī)體的能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功能產(chǎn)生影響，主要的影響肌肉組織。本試驗(yàn)主要著手與對能量代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，并未對肌肉的損傷進(jìn)行相關(guān)的探究，所以在此未能探討該影響是否會(huì)對肌肉造成損傷，但依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析，可能會(huì)對肌肉造成明顯的損傷，這有待于進(jìn)一步的探究。