常趙陽，劉玉梅，劉濰萁，王佳寧，位 蘭，張自強

(河南科技大學動物科技學院，洛陽 471000)

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)又稱兔瘟或兔壞死性肝炎，是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)所引起的以家兔實質(zhì)性器官出血、壞死為主要特征的傳染性疾病。經(jīng)典RHDV會導致家兔急性、出血性死亡，且該病發(fā)病急，病死率高。RHDV屬于杯狀病毒科，兔病毒屬，對家兔具有高度傳染性和致命性的病毒。我國流行的經(jīng)典RHDV主要是G2和G6型，G6型也稱為RHDVa。2010年，RHDV毒株的新變種在法國被發(fā)現(xiàn)并首次進行報道，Le-Gall-Recule等將其命名為RHDV2，也稱為RHDVb。RHDV2在基因和抗原性上不同于經(jīng)典RHDV和RHDVa，RHDV2衣殼蛋白(VP60)的核苷酸與經(jīng)典RHDV相差15%以上，RHDV2引起了非典型的RHD，導致接種了疫苗的成年家兔和通常對經(jīng)典RHDV具有抗性的幼兔的死亡。隨后該毒株在歐洲開始擴散，并且在北美洲、非洲、大洋洲都有相關(guān)報道。2020年4月，我國四川省首次確診了RHDV2感染病例，并將該毒株命名為SC2020/04。

2021年初，河南省某地區(qū)一兔場出現(xiàn)患病家兔急性死亡，且斷奶前后的幼兔也出現(xiàn)發(fā)病死亡現(xiàn)象，死亡家兔的臨床癥狀和病理變化與兔出血癥病毒感染高度相似，本實驗室通過臨床剖檢結(jié)合實驗室檢測的方法，初步確定該次疫情是由RHDV2感染所致，并以病兔的含病毒肝懸液進行了動物回歸試驗，對毒株的致病力有了初步了解，為后續(xù)RHDV2的防控提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及處理

病料樣品來源為河南省某地區(qū)一規(guī)?；脠?只疑似感染RHDV2的家兔(分別編號為樣品1、樣品2、樣品3)，分別采集3只發(fā)病家兔的胸腺、心、肝、脾、腎、肺、氣管等樣品，用于后期的試驗檢測。

1.2 主要試驗試劑和儀器

Trizol試劑，Premix Taq(EXTaqVersion 2.0 plus dye)，RT-PCR擴增試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司的產(chǎn)品；DM2000 DNA Marker購自康為世紀生物科技有限公司；溴化乙錠溶液購自蘇州天可貿(mào)易有限公司；實驗兔購買自濟源市陽光兔業(yè)科技有限公司[SCXK(豫)2016-0001]。

主要儀器包括臺式冷凍高速離心機(Hitachi CT15RE)、普通PCR儀(LongGene A200)、凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)、電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 病理學觀察

取“1.1”中疑似感染RHDV2的家兔胸腺、心、肝、脾、腎、肺、氣管等組織，浸入4%的多聚甲醛溶液中固定，修塊、包埋、切片后，進行HE染色，用CaseViewer軟件進行拍照并分析病理學變化。

1.4 引物的設(shè)計與合成

引物對P1/P2是參考文獻[12]中使用的經(jīng)典RHDV擴增引物，引物對P3/P4是參考文獻[13]中使用的RHDV2擴增引物，兩對引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列信息

1.5 微量血凝試驗

取發(fā)病家兔的肝組織，剪碎后，以1 g∶10 mL加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)后勻漿，反復凍融后，再以1 000 r·min離心30 min，取上清25 μL在96孔V型微量凝集板上進行倍比稀釋，向每孔加入1%的人“O”型紅細胞懸液，立即搖勻，4 ℃靜置5 min， 觀察凝血現(xiàn)象，同時設(shè)置陰性對照組，具體方法參照《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制試驗方法》(NY/T 572—2016)。

1.6 病毒RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

使用勻漿后的家兔肝組織懸液，與Trizol試劑按1∶10(質(zhì)量體積比)混合后研磨成懸液，12 000 r·min， 離心15 min，取上清液500 μL，后續(xù)按照Trizol法提取RNA的步驟進行進一步操作，提取組織中的RNA，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得組織的cDNA，放入-20 ℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 病毒cDNA的PCR鑒定

分別用P1/P2和P3/P4的特異性引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系25 μL：Premix酶12.5 μL、 無酶水9.5 μL、上、下游引物各1 μL，“1.6”中獲得的病毒cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，51.1 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.8 病毒基因序列的遺傳進化分析

由于60基因編碼RHDV的結(jié)構(gòu)蛋白，是對RHDV進行分型的主要依據(jù)，將PCR擴增的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序，根據(jù)Blast的結(jié)果，從GenBank中獲取多條RHDV2毒株的60基因序列，使用MEGA-X對病毒的60基因的核苷酸序列進行構(gòu)建進化樹并進行遺傳進化分析。

1.9 動物回歸試驗

嚴格遵循實驗室安全指南和生物安全防控的條件下，在超凈工作臺中，取疑似RHDV2病死兔的肝臟，剔除肝樣品上的結(jié)締組織后，加入少許的PBS進行勻漿，以1 g∶10 mL制成懸液，高速離心30 min，取上清液，并用0.22 μm的濾膜除菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

隨機選取同一批次未接種疫苗的54日齡的雄性青年兔5只，對家兔進行人工感染，分別于頸部皮下接種1 mL的病毒懸液，同時設(shè)置5只同等健康條件的家兔作為空白對照，每只接種1 mL的生理鹽水，接種后分開飼養(yǎng)，觀察記錄家兔的精神，食欲及體溫等臨床變化，并對發(fā)病死亡的家兔及時進行剖檢、取材，進行RT-PCR檢測。

產(chǎn)生的垃圾和動物尸體經(jīng)高壓滅菌后無害化處理，試驗結(jié)束后對整個試驗環(huán)境進行徹底消毒。

2 結(jié) 果

2.1 病理學觀察

2.1.1 剖檢變化 家兔發(fā)病死亡后多呈現(xiàn)角弓反張，四肢劃水樣的姿態(tài)(圖1A)，典型癥狀為口鼻有泡沫狀血液流出(圖1B)，肛門松弛，肛周有淡黃色膠凍樣液體和少許糞便附著(圖1C)。

A. 角弓反張；B. 口鼻；C. 肛門。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖A. Angle arch backtension; B. mouth and nose; C. anus. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page圖1 臨床癥狀Fig.1 Clinlcal symptom

剖檢可見內(nèi)臟實質(zhì)性器官腫脹，出血，尤其是胸腺、肝、脾、腎出血較為嚴重；氣管環(huán)上有暗紅色淤血(圖2A)；肺也有不同程度出血癥狀，有明顯的水腫和大小不一的出血斑塊(圖2B)，切開后流出泡沫狀液體；胸腺腫大，出血明顯，有散在的針尖到米粒大小不一的出血點(圖2C)；肝腫大，顏色發(fā)黃，呈土黃色或土褐色，質(zhì)地變脆，切面粗糙，呈“檳榔肝”樣病變，膽囊積液充盈，顏色變深(圖2D)；脾明顯腫大，呈藍紫色(圖2E)；腎出血、充血，腎表面呈暗紅色，切開腎可見皮質(zhì)區(qū)有散在的大小不一的針尖樣出血點(圖2F)；腸道有輕微出血，腸系膜靜脈淤血，淋巴結(jié)出血，腫大，腹部有積水；膀胱積尿，并且有白色絮狀沉淀物；典型病例剖開病兔皮下可見有黃疸現(xiàn)象。

A. 氣管；B. 肺；C. 胸腺；D. 肝；E. 脾；F. 腎；G. 膀胱；H. 肌肉。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖A. Trachea；B. Lung；C. Thymus；D. Liver；E. Spleen；F. Kidney；G. Bladder；H. Muscle. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page圖2 病理剖檢Fig.2 Pathological examination

2.1.2 病理組織學觀察 對取材的家兔的器官進行石蠟包埋，HE染色后，結(jié)果如圖3所示。

發(fā)病家兔組織切片鏡檢顯示胸腺皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)均有多處紅細胞堆積，胸腺上皮細胞脫落，巨噬細胞數(shù)量明顯增多，成纖維細胞大量死亡，崩解，細胞核皺縮(圖3A、B)；氣管黏膜層上假復層纖毛柱狀上皮細胞斷裂，杯狀細胞數(shù)量減少，固有層有炎性浸潤，黏膜層毛細血管擴張，充血，黏膜下層與外膜分離，氣管腺與透明軟骨分離(圖3C、D)；肺組織出血，腫脹，可見有彌漫性的血管內(nèi)凝血，肺泡腔內(nèi)有大量粉紅色炎性滲出物，主要為中性粒細胞和淋巴細胞，大面積肺泡萎縮(圖3E、F)；肝組織中肝細胞索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞有不同程度的空泡變性，胞核崩解，肝細胞塌陷和消失的區(qū)域可見纖維蛋白和出血，在肝病變的晚期，細胞或細胞碎片從肝索上脫落(圖3G、H)；脾組織中白髓數(shù)量明顯減少，紅髓正常結(jié)構(gòu)消失，被大量紅細胞和血漿滲透、填充，脾小結(jié)壞死，淋巴細胞數(shù)量減少，網(wǎng)狀細胞增生(圖3I、J)，腎中腎小球腫脹，腎小囊被漿液性物質(zhì)充盈，毛細血管充血，少量腎小管壞死，部分上皮細胞顆粒樣變性或空泡變性，腎小囊刷狀緣脫落(圖3K、L)。

2.2 微量血凝試驗

基于人“O”型血紅細胞的微量血凝試驗結(jié)果顯示，3只發(fā)病死亡家兔的肝樣品均能凝集人的“O”型血紅細胞，全部出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，該結(jié)果可證實采集的3只病兔樣本均具有凝集性，初步證明了采集的病料組織中含有RHDV抗原。

2.3 RHDV2的RT-PCR檢測

以病毒的cDNA為模板，用P1/P2的鑒定引物進行PCR擴增，在591 bp的位置，均未出現(xiàn)特異性條帶(圖4A)；用P3/P4的鑒定引物進行PCR擴增，在829 bp的位置都出現(xiàn)了明亮的特異性條帶(圖4B)；可以證明采集的死亡病兔都是由RHDV2感染引起的死亡，不是由經(jīng)典RHDV感染所引起的死亡。

2.4 基于VP60基因的遺傳進化分析

使用MEGA-X對病毒的60基因的核苷酸序列進行遺傳進化分析，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5)，結(jié)果證明試驗分離得到的病毒毒株屬于RHDV2的分支，與四川省分離得到的毒株SC2020/04具有高度同源性，且相似性高達98.2%。

2.5 動物回歸試驗

用制備的病毒上清液接種健康的家兔，每只家兔皮下注射1 mL上清液，攻毒組家兔出現(xiàn)了感染RHDV2的典型癥狀。臨床表現(xiàn)為食欲減退，精神沉郁，體溫升高，最快的病例在24 h內(nèi)發(fā)病，其中一只家兔在48 h內(nèi)死亡，兩只家兔在72 h內(nèi)死亡，兩只家兔在96 h內(nèi)死亡，發(fā)病過程短，發(fā)病后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，四肢呈劃水狀，發(fā)出尖叫后死亡。病理剖檢可見全身多器官出血，肝、脾充血出血嚴重(圖6A、B)，臨床癥狀與感染RHDV2死亡的家兔高度相似，病理組織切片觀察結(jié)果顯示，攻毒組家兔各實質(zhì)性器官中有大量的出血點，肝中明顯可見肝細胞有空泡樣變性，竇狀隙中有紅細胞堆積，胞核溶解(圖6C)，脾中可見紅髓區(qū)和白髓區(qū)大量細胞崩解、壞死，淋巴細胞數(shù)量減少，大量紅細胞進入脾索，且脾索處大量纖維組織增生，脾血竇內(nèi)皮細胞脫落，在脾索和脾血竇周圍出現(xiàn)大量紅細胞，并伴隨大量炎性細胞浸潤(圖6D)，而空白對照組無上述的癥狀和病理變化。取病死兔的肝進行PCR擴增，攻毒組均顯示出特異性條帶，檢測到RHDV2呈陽性。(圖7)。

A、B. 胸腺；C、D. 氣管；E、F. 肺；G、H. 肝；I、J. 脾；K、G. 腎；左側(cè)A、C、E、G、I、K放大倍數(shù)10×；右側(cè)B、D、F、H、J、L放大倍數(shù)40×。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖A, B. Thymus; C, D. Trachea；E, F. Lung; G, H. Liver; I, J. Spleen; K, G. Kidney; The magnification of A, C, E, G, I and K on the left is 10×; The magnification of B, D, F, H, J and L on the right is 40×. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page圖3 各組織臟器的病理變化Fig.3 Pathological changes of various tissues and organs

A. RHDV擴增(P1/P2)；B. RHDV2擴增(P3/P4)；M. DM2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1～3. 肝樣品1～3A. RHDV amplification (P1/P2); B. RHDV2 amplification (P3/P4); M. DM2000 DNA marker;1-3. Liver sample 1-3圖4 分離毒株的PCR擴增Fig.4 PCR amplification of the isolated virus

圖5 VP60基因的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)進化樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of VP60 genes

A、C. 肝；B、D. 脾；A、B. 剖檢病理變化；C、D. 組織病理變化(40×)。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖A, C. Liver; B, D. Spleen; A, B. Pathological changes of autopsy; C, D. Histopathological changes (40×). The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page圖6 攻毒試驗的病理變化Fig.6 Pathological examination of challenge test

M. DM2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1～5. 肝樣品M. DM2000 DNA marker；1-5. Liver samples圖7 攻毒試驗的PCR擴增Fig.7 PCR amplification of challenge test

3 討 論

自1984年，中國首次從德國進口商業(yè)養(yǎng)殖的安哥拉兔中發(fā)現(xiàn)經(jīng)典RHDV，至今已有37年，目前，該病通過經(jīng)典RHDV疫苗免疫能夠很好的預防和控制。2010年，RHDV2在法國被發(fā)現(xiàn)，目前在全球范圍內(nèi)流行，有逐漸取代經(jīng)典RHDV的趨勢，成為危害家兔的主要病原。經(jīng)典RHDV主要感染兩月齡以上的家兔，死亡率非常高，甚至達到99%，但對40日齡以下的家兔不易感，哺乳仔兔不發(fā)病。然而，RHDV2主要感染斷奶前后的家兔，最早對11日齡以上仔兔即可感染致死，對仔兔的致死率可達50%。相較于經(jīng)典RHDV，RHDV2感染的宿主范圍更廣，不僅能感染家兔，還能感染歐洲野兔、意大利兔、撒丁海角兔和山兔。經(jīng)典RHDV在我國的流行傳播中出現(xiàn)了G2基因型的新變種，而RHDV2進入我國時間較短，正處于傳播階段，新的變種在國內(nèi)還未見報道，但是國外已經(jīng)報道RHDV2出現(xiàn)了新的變異重組體，流行范圍在全球不斷擴大，在多個國家都有其相關(guān)報道，嚴重影響RHDV2的預防和治療效果。

本實驗室通過臨床問診了解到該兔場對基礎(chǔ)母兔和幼兔已注射兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，發(fā)病后，再次緊急接種了兔病毒性出血癥疫苗，未能有效控制家兔發(fā)病，兔場死亡率繼續(xù)不斷上升，采集發(fā)病兔場樣本，通過臨床剖檢和病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)感染RHDV2的家兔的病理變化與感染經(jīng)典RHDV家兔的病理變化未見有明顯的區(qū)別。感染RHDV2后典型的病兔口鼻處有泡沫樣血液流出，臨床剖檢可見內(nèi)臟多器官充血、出血；病理組織切片鏡檢觀察，各器官的組織病理變化明顯，尤其是肝和脾最為典型，可見組織中淋巴細胞和中性粒細胞大量浸潤，實質(zhì)性細胞大量崩解，壞死；RT-PCR擴增，從臨床病例的樣品中擴增出了RHDV2的特異性條帶，未擴增出經(jīng)典RHDV的特異性條帶；基于60基因的核苷酸序列測序和遺傳進化分析結(jié)果證實了該病毒為RHDV2，并且與在四川省發(fā)現(xiàn)的國內(nèi)首例毒株SC2020/04有高達98.2%的相似性；在動物回歸試驗中，攻毒組的家兔在接種1 mL含有病毒的上清液后，72 h內(nèi)全部死亡，平均死亡時間65.8 h，死亡率達到100%，病理組織切片結(jié)果呈現(xiàn)出典型的RHDV2病理癥狀，有明顯的出血斑塊，RT-PCR擴增均顯示出特異性條帶，RHDV2結(jié)果呈陽性。

RHDV2的傳播速度快，對環(huán)境的抵抗力強，其存在于宿主的血液、器官、排泄物、嘔吐物、分泌物中，此外污染的水源、飼料和宿主接觸過的場地等都可能成為接觸感染的傳染源。目前RHDV2在我國發(fā)現(xiàn)的時間尚短，要加強防控，防止病毒的大面積傳播和出現(xiàn)新的可致病重組體。河南作為我國的養(yǎng)兔大省，一定要在銷售、運輸過程中做好消殺，加強檢疫與隔離，切斷傳播途徑，堅持做好衛(wèi)生防疫工作。加強對家兔RHDV2的監(jiān)測，了解我國不同區(qū)域的RHDV2的流行情況和抗原變異情況對疾病的防控和疫苗的研發(fā)具有重要意義。目前，我國并沒有針對RHDV2的有效疫苗，研發(fā)疫苗更是當務(wù)之急，應(yīng)當加快病毒組織滅活疫苗等相關(guān)疫苗的研發(fā)，為中國養(yǎng)兔業(yè)提供強而有力的保障措施。

4 結(jié) 論

本研究證實，引起本次河南兔場兔群大規(guī)模發(fā)病死亡的病原為RHDV2，是首次在河南發(fā)現(xiàn)家兔感染RHDV2，這為RHDV2的合理防控提供了科學參考。