張 婷，楊 博，崔卉梅，袁興國(guó)，趙登率，楊金柯，郝 雨，陳學(xué)輝，閆文倩，申超超，史喜絹，張大俊，楊 行，劉湘濤，鄭海學(xué)，張克山

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

非洲豬瘟(African swine fever， ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染家豬和野豬引起的一種嚴(yán)重的出血性傳染病，ASF的流行傳播對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，目前沒(méi)有商業(yè)化的疫苗和抗病毒藥物。ASFV感染豬的靶細(xì)胞主要為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary macrophages， PAMs)用于ASFV的感染機(jī)制和病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)的研究。目前，非洲豬瘟活病毒的檢測(cè)依賴PAMs，但分離PAMs的過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)。源于非洲綠猴的商業(yè)化細(xì)胞系MA-104可用于替代PAMs感染ASFV，但其感染ASFV后病毒的復(fù)制能力并不高。

ASFV編碼150～167個(gè)開(kāi)放閱讀框，ASFV編碼包括50多種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中，ASFV編碼包括5種解旋酶，分別為D1133L、Qp509L、Q706L、B962L和A859L，在病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮作用，這些基因?qū)Σ《緩?fù)制過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄階段發(fā)揮重要的功能，其中，1133L基因與牛痘病毒的D6R具有相似的結(jié)構(gòu)域，與病毒轉(zhuǎn)錄起始階段有關(guān)。

目前，常利用慢病毒(lentivirus)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系來(lái)研究病毒的功能。如小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus， PPPRV)的結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白在Vero細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，在BHK細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus，BTV)的VP6蛋白，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的GP2和N蛋白在MARC-145細(xì)胞系上穩(wěn)定表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)基因的BHK-21細(xì)胞系的構(gòu)建及其對(duì)新城疫病毒(Newcastle disease virus， NDV)增殖效果的評(píng)價(jià)等。本實(shí)驗(yàn)室前期已明確了1133L的基因序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位。前期研究提示，ASFV編碼的解旋酶D1133L對(duì)于病毒復(fù)制十分重要，為進(jìn)一步研究1133L基因功能，本試驗(yàn)利用慢病毒系統(tǒng)，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)D1133L的MA-104細(xì)胞，并比較評(píng)價(jià)了病毒增殖能力。本文通過(guò)該方法構(gòu)建過(guò)表達(dá)D1133L細(xì)胞系來(lái)探究此基因?qū)SFV復(fù)制能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 MA-104細(xì)胞由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫流行病實(shí)驗(yàn)室保存，非ASFV CN/GS/2018分離株、缺失MGF360-9L基因(ASFV-G-Δ40)和同時(shí)缺失ASFV-110-9L、ASFV-505-7R兩個(gè)基因的 (ASFV-G-Δ20-53)重組毒株均由蘭州獸醫(yī)研究所非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試劑和抗體 胎牛血清(FBS)和0.25%EDTA-Trypsin(Gibco)購(gòu)自偉博鑫生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液(三抗)和PBS緩沖液購(gòu)于北京索萊寶公司，大腸桿菌Trans5a感受態(tài)、LADNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ、T4 DNA 連接酶、均購(gòu)于寶生物工程大連有限公司，RPIM1640培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，鼠抗β-actin單克隆抗體和TRizol Reagent購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，Goat Anti-Mouse，蛋白marker購(gòu)自Proteintech公司,Western一抗稀釋液、Western Bright ECL 化學(xué)發(fā)光底物和硝酸纖維素膜NC膜(0.22 μm)購(gòu)于碧云天有限公司，預(yù)混型定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green染料法標(biāo)準(zhǔn)型定量試劑盒購(gòu)于上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。

本研究所用的鼠抗ASFV p30單克隆抗體，兔抗ASFV p72多克隆抗體和鼠抗1133L單克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行病學(xué)團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ASFV1133L基因 (ID:59226965)，以慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro進(jìn)行構(gòu)建，根據(jù)1133L的基因CDS序列和載體的MCS位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性PCR primers，設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表1，雙酶切酶為RⅠ和Ⅰ，酶切后重連插入到慢病毒載體 Lv-PCDH 的 MCS 區(qū)，命名為pCDH-CMV-D1133L-EF1-CopGFP-T2A-Puro。

表1 D1133L特異性PCR引物序列

1.2.2 ASFV病毒感染 ASFV毒株(MOI=1.5)感染MA-104/D1133L細(xì)胞系和野生型MA-104，48 h后收取病毒液。將MA-104/D1133L和MA-104細(xì)胞消化后鋪于12孔板中，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度至 70%～90%時(shí)，用無(wú)血清的DMEM 將細(xì)胞清洗2次，以去除細(xì)胞中殘留的血清；用無(wú)血清的DMEM 將ASFV稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，之后將稀釋好的毒液按照適當(dāng)?shù)捏w積加入到細(xì)胞中，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱孵育2 h 之后，棄去毒液，換成 2%FBS DMEM 維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采用 Trizol 裂解法提取細(xì)胞的總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用于Real-time qPCR，反轉(zhuǎn)錄體系 20 μL：4 μL 5×反轉(zhuǎn)錄酶，6 μL DEPC 水，10 μL模板 RNA。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR(quantitative real-time PCR) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time qPCR，RT-qPCR)的反應(yīng)體系(10 μL)：5 μL SYBR Permix ExⅡ，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，3 μL DEPC 水和1 μL cDNA。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火和延伸 34 s，共 40 個(gè)循環(huán)，這些基因的相對(duì)mRNA水平歸一化為豬mRNA水平，引物序列見(jiàn)表2。以ASFV72基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)ASFV基因組DNA的拷貝數(shù)。采用QIAamp DNA Mini Kits(Qiagen，Germany)提取樣品DNA。ASFV-72-R: 5′-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3′；ASFV-72-F: 5′- GATACCACAAGATCAGCCGT-3；探針: 5′-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3′；5′-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)熱30 s， 95 ℃預(yù)熱5 s，58 ℃預(yù)熱30 s， 循環(huán)40次。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ASFV基因組的數(shù)量，并以每微升基因組拷貝數(shù)表示。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) MA-104/D1133L和MA-104細(xì)胞以每孔1×10細(xì)胞量接種于12孔板，感染ASFV(MOI=1.5)。不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞裂解蛋白，用PBS洗滌后加入100 μL 1×loading蛋白上樣緩沖液裂解細(xì)胞，取20 μL蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后用100 V恒壓轉(zhuǎn)印至NC膜1.5 h，用TBST配制5%的脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，抗體稀釋液稀釋按照比列稀釋一抗D1133L單克隆抗體(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)、p30(1∶1 000)和p72(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育，1×TBST配制HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，Goat Anti-Mouse(1∶10 000)室溫孵育2 h，用Western Bright ECL 化學(xué)發(fā)光底物全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析。

表2 引物序列信息

1.2.6 ASFV病毒滴度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[19-20]方法來(lái)測(cè)定ASFV的HAD或TCID，利用ASFV熒光重組毒感染長(zhǎng)滿單層MA-104細(xì)胞和MA-104/D1133L細(xì)胞，36 h后收取，置于-80 ℃病毒反復(fù)凍融3次后，收集上清，1 200 r·min離心10 min， 取0.1 mL上清液進(jìn)行10～10倍梯度稀釋?zhuān)臃N長(zhǎng)滿PAM細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，測(cè)定HAD，每孔加入25 μL的1%豬紅細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，0.1 mL·孔，培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)5～7 d，逐日觀察記錄細(xì)胞形成玫瑰花環(huán)數(shù)，而TCID根據(jù)出現(xiàn)的熒光數(shù)量并記錄，用Reed-Munch 法計(jì)算。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，*.<0.05 說(shuō)明數(shù)據(jù)間有顯著差異，**.<0.01 說(shuō)明數(shù)據(jù)間有極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 MA-104/D1133L細(xì)胞系的構(gòu)建

為構(gòu)建1133L基因過(guò)表達(dá)MA-104細(xì)胞系，利用慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MA-104細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后。慢病毒Lv-PCDH、Lv-D1133L分別感染MA-104細(xì)胞，8 h后終止。加入3 μg·mL的puromycin對(duì)各組細(xì)胞系進(jìn)行藥篩培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)基并傳代，維持培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞系，提取各組細(xì)胞RNA，進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，D1133L在該細(xì)胞系中能夠高效、穩(wěn)定表達(dá)。經(jīng)測(cè)序后將獲得的過(guò)表達(dá)D1133L穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系命名為MA-104/D1133L。

2.2 MA-104/D1133L細(xì)胞系鑒定

利用慢病毒包裝后Lv-PCDH、Lv-D1133L感染D1133L細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)均正常，藥物篩選后能夠正常的傳代培養(yǎng)，將篩選出的陽(yáng)性克隆細(xì)胞系連續(xù)傳代15代后，用TRizol法提取細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞系中的1133L的基因轉(zhuǎn)錄水平，Western blot鑒定細(xì)胞系中D1133L蛋白是否穩(wěn)定表達(dá)。利用RT-qPCR檢測(cè)了D1133L的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)(圖1A)，MA-104/D1133L 細(xì)胞系中的D1133L顯著高于野生型MA-104(<0.05)；Western blot結(jié)果(圖1B)顯示，細(xì)胞系連續(xù)傳代15代后仍能穩(wěn)定表達(dá)D1133L蛋白，以上表明該細(xì)胞系連續(xù)傳代后仍能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和表達(dá)D1133L。RT-qPCR試驗(yàn)結(jié)束后，利用核酸電泳技術(shù)對(duì)RT-qPCR的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示：對(duì)于1133L基因，MA-104/D1133L細(xì)胞系的RT-qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶與MA-104細(xì)胞系相比，差異顯著；對(duì)于-基因，兩個(gè)細(xì)胞系的RT-qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶基本相當(dāng)。

2.3 MA-104/D1133L細(xì)胞中ASFV基因表達(dá)檢測(cè)

將MA-104/D1133L和MA-104細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%，ASFV(MOI=1.5)感染兩種細(xì)胞，在12、24 h時(shí)收取的樣品，利用RT-qPCR測(cè)定MA-104/D1133L細(xì)胞中30、72/mRNA表達(dá)量顯著(<0.001)高于野生型MA-104細(xì)胞中30、72/mRNA表達(dá)量(圖3A、3B)。即MA-104/D1133L細(xì)胞系與野生型MA-104細(xì)胞系相比在12、24 h均能促進(jìn)ASFV30和72基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。同時(shí)用Western blot檢測(cè)p72蛋白表達(dá)，MA-104/D1133L細(xì)胞中p72蛋白表達(dá)量顯著高于野生型MA-104細(xì)胞中p72表達(dá)量(圖3C)。同樣ASFV重組熒光毒株感染MA-104和MA-104/D1133L細(xì)胞，36 h后收取樣品，檢測(cè)p72和p30的表達(dá)量，與上述結(jié)果一致(圖3D)，MA-104/D1133L細(xì)胞系中p30和p72的高于野生型MA-104細(xì)胞中。綜上所述，ASFV在MA-104/D1133L細(xì)胞中的復(fù)制能力強(qiáng)于MA-104。

A. RT-qPCR鑒定D1133L基因轉(zhuǎn)錄水平；B. Western blot鑒定D1133L蛋白水平。與Mock相比，*.P<0.05A. Identification of D1133L gene transcription level by RT-qPCR; B. Western blot identification of D1133L protein level.Compared with Mock,*.P<0.05圖1 連續(xù)傳代至15代，MA-104/D1133L細(xì)胞系中D1133L穩(wěn)定性鑒定Fig.1 Identification of D1133L stability in MA-104/D1133L cell line of successive generations to 15 generations

圖2 MA-104和MA-104/D1133L中RT-qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶分析Fig.2 Electrophoretic band analysis of RT-QPCR products in MA-104 and MA-104/D1133L

2.4 MA-104/D1133L細(xì)胞中ASFV滴度及拷貝數(shù)測(cè)定

為進(jìn)一步比較分析不同毒力毒株在MA-104/D1133L細(xì)胞中的增殖能力，ASFV強(qiáng)毒株ASFV CN/GS2018毒株和兩種弱毒株ASFV重組熒光缺失毒株，分別為ASFV-G-Δ20-53和ASFV-G-Δ40株，在MA-104/D1133L細(xì)胞系和野生型MA-104細(xì)胞中的增殖水平，利用 RT-PCR 方法檢測(cè)ASFV基因組，即病毒復(fù)制拷貝數(shù)。用HAD或TCID測(cè)定病毒滴度，在豬紅細(xì)胞存在的情況下，CD2v蛋白介導(dǎo)ASFV在感染細(xì)胞周?chē)难何剑纬擅倒寤ōh(huán)，使用血液吸附試驗(yàn)(HAD)計(jì)算ASFV CN/GS2018毒株感染細(xì)胞后的病毒滴度，由于本試驗(yàn)構(gòu)建的重組病毒均含有p72-eGFP啟動(dòng)子，可替代CD2v基因，用熒光代替花環(huán)來(lái)統(tǒng)計(jì)，因此每個(gè)樣品的TCID是根據(jù)樣品稀釋后的eGFP熒光測(cè)定，統(tǒng)計(jì)熒光顯微鏡下熒光數(shù)量檢測(cè)病毒滴度。

2.4.1 ASFV滴度(HAD/TCID)測(cè)定 如圖4A所示，測(cè)定了強(qiáng)毒株ASFV CN/GS2018毒株HAD，即強(qiáng)毒株ASFV在MA-104/D1133L細(xì)胞系中的病毒滴度HAD(4.75和4.875)顯著高于野生型MA-104細(xì)胞系病毒滴度HAD(4.125和4.25)，同時(shí)也比較兩種重組弱毒株在MA-104/D1133L細(xì)胞系和野生型MA-104細(xì)胞上的增殖能力，在雙基因缺失毒株ASFV-G-Δ20-53中病毒滴度TCID，MA-104/D1133L細(xì)胞系病毒滴度TCID(3.50和4.00)比野生型MA-104細(xì)胞系增殖滴度TCID(2.875和2.875)ASFV的高(圖4B)，在單基因缺失毒株ASFV-G-Δ40中病毒滴度TCID，MA-104/D1133L細(xì)胞系病毒滴度TCID(3.25和3.50)比野生型MA-104細(xì)胞系增殖滴度TCID(2.625和2.750)ASFV的高(圖4C)。綜上結(jié)果表明MA-104/D1133L細(xì)胞系病毒增殖能力顯著高于野生型MA-104細(xì)胞(<0.05)。

A. ASFV p30的mRNA水平；B. ASFV p72的mRNA水平；C. 感染ASFV CN/GS2018毒株不同時(shí)間點(diǎn)ASFV p72蛋白水平；D. 感染ASFV重組毒株36 h后ASFV p30、p72蛋白水平。*. P<0.05；**.P<0.01；***. P<0.001A. ASFV p30 mRNA level; B. ASFV p72 mRNA level; C. different time points of infection with wild strain ASFV p72 protein level; D. AFSV P30 and ASFV p72 protein levels 36 h after infection with recombinant strains.*. P<0.05; * * P<0.01; ***. P<0.001圖3 MA-104、MA-104/D1133L細(xì)胞系感染ASFV后p30、p72轉(zhuǎn)錄和蛋白水平變化Fig.3 Changes in p30 and p72 transcription and protein levels of MA-104 and MA-104 /D1133L cell lines infected with ASFV

2.4.2 ASFV基因拷貝數(shù)測(cè)定 采用RT-qPCR方法測(cè)定不同毒力毒株中病毒復(fù)制拷貝數(shù)來(lái)評(píng)估病毒的復(fù)制差別。如圖5所示，ASFV CN/GS2018毒株、雙基因重組缺失病毒ASFV-G-Δ20-53和單基因缺失重組病毒復(fù)制拷貝數(shù)結(jié)果表明MA-104/D1133L的細(xì)胞系均顯著高于比野生型MA-104病毒拷貝數(shù)(<0.05)。綜上表明，ASFV毒株在MA-104/D1133L的復(fù)制能力均高于MA-104細(xì)胞。

3 討 論

目前，一些商業(yè)化的傳代細(xì)胞可感染ASFV。ZMAC-4 豬巨噬細(xì)胞系可替代PAM細(xì)胞研究其復(fù)制動(dòng)力學(xué)，MA-104細(xì)胞可替代肺泡巨噬細(xì)胞檢測(cè)ASFV。最新報(bào)道也發(fā)現(xiàn)ASFV 可以感染HEK293T細(xì)胞，但復(fù)制效率較低，有趣的是在HEK293T細(xì)胞中連續(xù)傳代，獲得了RT-qPCR測(cè)定MA-104/D1133L細(xì)胞中30、72/mRNA表達(dá)量顯著(<0.001)高于野生型MA-104細(xì)胞中30、72/mRNA表達(dá)量(圖3A、3B)。即MA-104/D1133L細(xì)胞系與野生型MA-104細(xì)胞系相比在12、24 h均能促進(jìn)ASFV30和72基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。同時(shí)用Western blot檢測(cè)p72蛋白表達(dá)，MA-104/D1133L細(xì)胞中p72蛋白表達(dá)量顯著高于野生型MA-104細(xì)胞中p72表達(dá)量(圖3C)。同樣ASFV重組熒光毒株感染MA-104和MA-104/D1133L細(xì)胞，36 h后收取樣品，檢測(cè)p72和p30的表達(dá)量，與上述結(jié)果一致(圖3D)，MA-104/D1133L細(xì)胞系中p30和p72的高于野生型MA-104細(xì)胞中。綜上所述，ASFV在MA-104/D1133L細(xì)胞中的復(fù)制能力強(qiáng)于MA-104。

A. ASFV CN/GS2018毒株 (WT) HAD50測(cè)定；B. ASFV-G-Δ20-53重組毒株TCID50測(cè)定；C. ASFV-G-Δ40重組毒TCID50測(cè)定A. ASFV CN/GS2018 HAD50 assay; B. TCID50 assay of ASFV-G-Δ20-53; C. TCID50 determination of ASFV-G-Δ40圖4 不同ASFV毒株感染MA-104、MA-104/D1133L細(xì)胞后病毒滴度測(cè)定Fig.4 Titer determination of different ASFV strain infected MA-104 and MA-104/ D1133L cells

A. ASFV CN/GS2018毒株 (WT) 病毒拷貝數(shù)；B. ASFV-G-Δ20-53重組毒株病毒拷貝數(shù)；C. ASFV-G-Δ40重組毒株病毒拷貝數(shù)A. CN/GS 2018 virulent strain (WT) virus copies number; B. Copies number of ASFV-G-Δ20-53 recombinant virus; C. Copies number of ASFV-G-Δ40 recombinant virus圖5 評(píng)估不同毒株感染MA-104、MA-104/D1133L細(xì)胞系的病毒拷貝數(shù)Fig.5 Evaluation of the copies number of different virus strains infected MA-104 and MA-104/D1133L cell lines

ASFV編碼1133L基因與病毒復(fù)制相關(guān)，其對(duì)病毒復(fù)制具有重要作用。利用D1133L蛋白解旋酶基序的特性，探究D1133L在病毒復(fù)制中發(fā)揮的作用是具有重要意義。本試驗(yàn)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)D1133L的MA-104/D1133L細(xì)胞系，評(píng)估了ASFV CN/GS2018分離株和ASFV基因缺失重組毒株在MA-104/D1133L細(xì)胞系的病毒復(fù)制水平和增殖能力，通過(guò)RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)了MA-104、MA-104/D1133L細(xì)胞系感染ASFV后，早期蛋白p30和晚期蛋白p72轉(zhuǎn)錄和蛋白水平之間的差異，測(cè)定病毒滴度HAD或TCID和病毒拷貝數(shù)在兩種細(xì)胞中ASFV的增殖水平和病毒復(fù)制，從數(shù)據(jù)可知ASFV在MA-104/D1133L細(xì)胞增殖能力高于MA-104。綜上所述，ASFV感染該細(xì)胞系后病毒增殖能力高于野生型MA-104，過(guò)表達(dá)D1133L蛋白能進(jìn)一步促進(jìn)ASFV復(fù)制。

4 結(jié) 論

D1133L在ASFV復(fù)制過(guò)程中扮演重要角色，本試驗(yàn)通過(guò)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)D1133L的MA-104/D1133L細(xì)胞系，不同毒力的ASFV毒株感染此細(xì)胞系，ASFV增殖能力強(qiáng)于野生型MA-104，本研究構(gòu)建的D1133L過(guò)表達(dá)MA-104細(xì)胞系為研究1133L基因功能及針對(duì)該基因有效藥物的開(kāi)發(fā)積累了生物材料。