張旭，趙芳園

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150040）

慢性腎衰竭（chronic renal failure, CRF）是指在慢性腎病基礎(chǔ)上，腎臟持續(xù)性損傷導(dǎo)致體內(nèi)代謝產(chǎn)物大量滯留，電解質(zhì)與酸堿失衡，機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡被破壞并產(chǎn)生臨床癥狀的過(guò)程。CRF 有多種并發(fā)癥，以鈣磷代謝紊亂為主，隨著病程進(jìn)展，還會(huì)引起動(dòng)脈血管鈣化、腎性骨病等，嚴(yán)重危害人體健康[1-2]。臨床上常采用磷結(jié)合劑、鈣受體激動(dòng)劑和血液透析等方法治療CRF，但由于均是單因素靶向治療，所以常引起高磷血癥，且磷結(jié)合劑價(jià)格較昂貴，患者難以接受[3-4]。中醫(yī)認(rèn)為腎絡(luò)淤堵，脾虛風(fēng)動(dòng)是CRF 的主要病機(jī)，患者體內(nèi)常有淤血、痰濁與濕濁滯留[5]，因此本研究根據(jù)CRF 病機(jī)，結(jié)合《五十二病方》中活血化瘀方劑進(jìn)行調(diào)整，將黃芪、茯苓、黨參、忍冬藤、白術(shù)、澤瀉、當(dāng)歸、紅花、陳皮、黃柏、丹參配伍成益氣活血化瘀湯，用于治療CRF 模型大鼠，探究其對(duì)鈣磷代謝紊亂和血管鈣化的影響及機(jī)制，為中醫(yī)臨床治療CRF 提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡健康雄性SD 大鼠50 只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，正常飼喂，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0033。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1試劑黃芪、茯苓、黨參、忍冬藤、白術(shù)、澤瀉、當(dāng)歸、紅花、陳皮、黃柏、丹參（北京同仁堂大藥房），骨化三醇膠丸（羅蓋全，0.25 μg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字J20050021，德國(guó)羅氏制藥有限公司），血鈣濃度檢測(cè)試劑盒、血磷濃度檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司），血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）試劑盒、血甲狀旁腺激素（甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）檢測(cè)試劑盒、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor-23,FGF-23）檢測(cè)試劑盒與25-羥維生素D325（OH）D3檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），尿蛋白（urinary protein,UP）檢測(cè)試劑盒、血清肌酐（serum creatinine, Scr）檢測(cè)試劑盒（上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司），兔抗大鼠Wnt、β-catenin 和β-actin 一抗、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（北京康為試劑有限公司），MolPure?TRIeasy Plus Total RNA Kit 總RNA 提取試劑盒、Hifair?ⅢOne Step qRT-PCR SYBR Green Kit（一步法反轉(zhuǎn)定量）試劑盒（上海翌圣生物科技有限公司），PCR 引物（北京擎科生物有限公司），Minute（TM）動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒（上海西寶生物科技股份有限公司）。

1.2.2儀器SD1 全自動(dòng)生化分析儀（成都斯馬特科技有限公司），UV759CRT 型掃描型紫外可見分光光度計(jì)（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司），JC-MB36 酶標(biāo)儀（青島聚創(chuàng)嘉恒分析儀器有限公司），HOG-24組織均質(zhì)器（上海輔光精密儀器有限公司），NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1益氣活血化瘀湯準(zhǔn)確稱取黃芪、茯苓、黨參、忍冬藤、白術(shù)各12 g，澤瀉、當(dāng)歸、紅花各8 g，陳皮、黃柏各、丹參各5 g，浸泡1 h 后加水煎煮2 次，過(guò)濾后將2 次濾液混合均勻，濃縮至生藥含量為62.4 g/mL 的濃縮液，置于4℃冰箱保存。

1.3.2腎衰竭模型的復(fù)制采用5/6 腎切除法復(fù)制CRF 大鼠[6]。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺(tái)上，使大鼠背部左腎區(qū)朝上，距左脊肋骨約1.5 cm 處做斜向外方切口，打開腹腔暴露腎臟，切除2/3 腎組織并用明膠海綿壓迫止血30 s，滴加纖維蛋白原和凝血酶溶液，等待60 s 后觀察切面無(wú)活動(dòng)性出血后將左腎復(fù)位、縫合。大鼠恢復(fù)1 周后，打開腹腔，切除整個(gè)右腎，2 次手術(shù)共切除約80%腎臟。假手術(shù)組打開腹腔，切除腎臟周圍部分脂肪組織，然后縫合傷口。

1.3.3分組與給藥50 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腎衰組、低劑量組、高劑量組、骨化三醇組，每組10 只。模型復(fù)制成功后2 周后開始給藥，按照人與大鼠體表面積換算出給藥劑量作為最低給藥劑量。高、低劑量組大鼠分別按35.2 g/kg、8.8 g/kg 灌胃益氣活血化瘀湯；骨化三醇組將骨化三醇在溫水中搗碎溶成懸液，按25 ng/kg 灌胃；假手術(shù)組灌胃等體積溫水，均1 次/d，連續(xù)8 周。腎衰組模型復(fù)制成功后未做任何處理。給藥結(jié)束后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，3 000 r/min 離心10 min，取上清液于4℃待測(cè)。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁水、禁食。治療期間，觀察大鼠體重、精神狀態(tài)、行為、中毒及死亡情況。

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)血液礦物質(zhì)與生化指標(biāo)大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液，麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，切開腹腔，腹主動(dòng)脈采血5 mL，4 000 r/min 離心20 min，分離上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清鈣和磷；ELISA 測(cè)定大鼠血清PTH、FGF-23、25（OH）D3。酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)血標(biāo)本在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（optical density, OD）值，以試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)（X），對(duì)應(yīng)OD 值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血標(biāo)本的OD 值計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.3.5腎臟功能指標(biāo)檢測(cè)取離心后血清，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)大鼠血清Scr 含量。在氯化高鐵一磷酸中加入含有BUN 的血清、二乙酰一肟和硫胺脲，加熱生成紅色的二嗪化合物，顏色深淺與血BUN 呈正比，取加熱煮沸的混合液，待其冷卻后利用分光光度計(jì)測(cè)量540 nm 處的OD 值。取離心后尿液上清，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)大鼠尿液UP 含量，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，濃度計(jì)算方法同方法1.3.4。

1.3.6主動(dòng)脈茜素紅法鈣鹽染色參照Z(yǔ)HANG等[7]的方法，腹主動(dòng)脈采血后，剪開胸腔，剝離出胸主動(dòng)脈，剪取長(zhǎng)約5 cm 動(dòng)脈，用含肝素鈉的生理鹽水沖洗動(dòng)脈，將動(dòng)脈外部和管腔中的血液完全沖除干凈，浸泡于PBS 緩沖液中。①血管大體染色：隨機(jī)取出5 只大鼠的主動(dòng)脈，用吸水紙吸干水分，浸泡于95%乙醇12 h 脫水處理，用茜素紅染料（0.004%茜素紅+1%氫氧化鉀）室溫下染色12 h，取出動(dòng)脈血管，2%氫氧化鉀沖洗干凈（時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)），4%多聚甲醛固定，拍照觀察染色情況。②血管切片染色：將剩余5 只大鼠的主動(dòng)脈取出，每根剪取1 cm，吸干水分，用4%多聚甲醛在常溫下固定24 h，不同濃度乙醇梯度脫水，加入二甲苯透明處理10 min，石蠟包埋，切片厚約5 μm，放于載玻片上，60℃烘烤，二甲苯脫蠟，水中浸泡2 min，0.2% 茜素紅染液染色6 min，用水洗去多余染液并加入二甲苯脫水，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察血管鈣化情況。

1.2.1 水資源量 2016年河套灌區(qū)各旗（縣、區(qū)）水資源總量合計(jì)為46.277億m3，其中，地表水資源量42.483億m3，地下水資源量為16.993億m3，地表與地下水重復(fù)計(jì)算量13.199億m3。降水量27.794億m3，引用黃河水量和地表水徑流量分別為41.976，0.507億m3，分別占地表水資源量的98.8%，1.2%。河套灌區(qū)地下水年平均埋深2.13 m。

1.3.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)Wnt/β-catenin 通路mRNA 的表達(dá)大鼠腹主動(dòng)脈采血后，取出腎臟，生理鹽水沖洗干凈。加入適量生理鹽水，用組織勻漿器研磨腎臟組織，采用TRIzol法提取RNA（總RNA 提取試劑盒），用Nano Drop 測(cè)量濃度。采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR 擴(kuò)增引物（見表1）。取0.1 μg RNA，使用Hifair?ⅢOne Step qRT-PCR SYBR Green Kit（一步法反轉(zhuǎn)定量）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量，40℃、10 min 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI PRISM 7500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（ABI）中進(jìn)行反應(yīng)，qRT-PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，共38 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Wnt/β-catenin 通路[結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli, APC）、T 細(xì)胞因子4（T-cell factor, TCF4）、β-catenin] mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次獲得平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.8Western blotting 檢測(cè)Wnt/β-catenin 通路蛋白的表達(dá)取研磨好的腎臟組織勻漿液，提取總蛋白，利用BCA 試劑盒測(cè)定濃度。添加緩沖液，將蛋白質(zhì)樣本在95℃條件下加熱10 min，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓80 V 用于濃縮，120 V 用于分離。恒壓100 mV 條件下濕轉(zhuǎn)移120 min，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上。室溫下將PVDF 膜置于5%牛血清白蛋白中封閉1 h，與一抗（兔抗大鼠Wnt、β-catenin 和β-actin一抗，均1∶1 000 稀釋）在4℃條件下孵育一晚。TBST 沖洗膜3 次，5 min/次，加入二抗孵育1 h，TBST再洗膜3 次，5 min/次。使用發(fā)光液ECL 底物對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行可視化處理，以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算APC、TCF4、β-catenin 灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

治療期間，大鼠精神狀態(tài)良好，飲食與行為正常，毛色正常，未出現(xiàn)中毒與死亡情況。

2.2 各組大鼠血液礦物質(zhì)與生化指標(biāo)比較

假手術(shù)組、腎衰組、低劑量組、高劑量組、骨化三醇組大鼠血鈣、血磷、PTH、FGF-23、25（OH）D3比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：腎衰組血鈣、25（OH）D3低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與腎衰組比較，低劑量組、高劑量組和骨化三醇組血鈣、25（OH）D3升高（P＜0.05）；高劑量組和骨化三醇組血鈣、25（OH）D3高于低劑量組（P＜0.05）；骨化三醇組血鈣、25（OH）D3高于高劑量組（P＜0.05）；腎衰組血磷、PTH、FGF-23 高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與腎衰組比較，低劑量組、高劑量組和骨化三醇組血磷、PTH、FGF-23 降低（P＜0.05）；高劑量組和骨化三醇組血磷、PTH、FGF-23 低于低劑量組（P＜0.05）；骨化三醇組血磷、PTH、FGF-23 低于高劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血鈣、血磷、PTH、FGF-23、25（OH）D3比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠血鈣、血磷、PTH、FGF-23、25（OH）D3比較 （n=10，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與腎衰組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05；④與高劑量組比較，P ＜0.05。

?組別25（OH）D3/（ng/mL）血鈣/（mmol/L）血磷/（mmol/L）PTH/（pg/mL）FGF-23/（pg/L）假手術(shù)組腎衰組低劑量組高劑量組骨化三醇組F 值P 值13.85±2.73 6.27±1.12①9.54±1.61②12.76±2.01②③14.17±2.32②③④27.307 0.000 2.97±0.69 1.87±0.41①2.18±0.27②2.67±0.74②③2.84±0.68②③④6.257 0.000 2.01±0.41 4.17±1.01①3.92±0.87②2.93±0.51②③2.51±0.52②③④35.315 0.000 0.71±0.17 19.32±4.18①14.31±3.27②12.79±2.88②③9.17±1.53②③④61.898 0.000 0.48±0.11 1.17±0.26①0.92±0.18②0.62±0.12②③0.54±0.11②③④38.189 0.000

2.3 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

假手術(shù)組、腎衰組、低劑量組、高劑量組和骨化三醇組大鼠BUN、Scr、24 h UP 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：假手術(shù)組BUN、Scr、24 h UP 低于其余4 組（P＜0.05）；與腎衰組比較，低劑量組、高劑量組和骨化三醇組BUN、Scr、24 h UP 降低（P＜0.05）；高劑量組和骨化三醇組BUN、Scr、24 h UP 低于低劑量組（P＜0.05）；骨化三醇組BUN、Scr、24 h UP 低于高劑量組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清BUN、Scr、24 h UP比較（n=10，±s）

表3 各組大鼠血清BUN、Scr、24 h UP比較（n=10，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與腎衰組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05；④與高劑量組比較，P ＜0.05。

24 h UP/（mg/d）組別BUN/（mmol/L）Scr/（μmol/L）0.41±0.11 13.21±3.46①11.02±2.98①②10.77±2.35①②③9.14±1.57①②③④42.764 0.000假手術(shù)組腎衰組低劑量組高劑量組骨化三醇組F 值P 值7.58±2.04 18.96±4.27①16.87±3.17①②13.77±3.02①②③11.48±2.36①②③④21.243 0.000 36.52±9.32 95.74±21.71①75.31±18.14①②61.27±18.01①②③56.33±12.87①②③④17.711 0.000

2.4 各組大鼠主動(dòng)脈血管鈣化情況

血管整體茜素紅染色可見假手術(shù)組主動(dòng)脈呈白色，無(wú)紅色鈣化點(diǎn)；腎衰組主動(dòng)脈則鈣化嚴(yán)重，呈紅色；低劑量組主動(dòng)脈呈淺紅色，鈣化程度略輕；高劑量組主動(dòng)脈紅色更淡，鈣化程度緩解；骨化三醇組主動(dòng)脈部分呈白色，部分呈淺紅色，鈣化程度減輕。

茜素紅切片染色中，假手術(shù)組切片未觀察到鈣化點(diǎn)；腎衰組切片觀察到大面積紅色鈣化點(diǎn)，呈彌散性分布；與腎衰組比較，可見低劑量組紅色鈣化點(diǎn)減少，高劑量組紅色鈣化點(diǎn)明顯減少；骨化三醇組紅色鈣化點(diǎn)也明顯減少。見圖1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈截面切片 （茜素紅染色×50）

2.5 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

假手術(shù)組、腎衰組、低劑量組、高劑量組和骨化三醇組大鼠APC、TCF4、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：腎衰組APC mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與腎衰組比較，低劑量組、高劑量組和骨化三醇組APC mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；高劑量組和骨化三醇組APC mRNA相對(duì)表達(dá)量高于低劑量組（P＜0.05）；骨化三醇組APC mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于高劑量組（P＜0.05）；腎衰組TCF4、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與腎衰組比較，低劑量組、高劑量組和骨化三醇組TCF4、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；高劑量組和骨化三醇組TCF4、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于低劑量組（P＜0.05）；骨化三醇組TCF4、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于高劑量組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表4 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與腎衰組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05；④與高劑量組比較，P ＜0.05。

β-catenin mRNA 0.87±0.13 1.95±0.32①1.51±0.35②1.21±0.31②③1.07±0.27②③④10.803 0.000組別假手術(shù)組腎衰組低劑量組高劑量組骨化三醇組F 值P 值A(chǔ)PC mRNA 0.98±0.12 0.37±0.08①0.58±0.10②0.61±0.11②③0.65±0.10②③④22.812 0.000 TCF4 mRNA 1.10±0.31 2.07±0.48①1.87±0.51②1.29±0.33②③1.03±0.21②③④7.461 0.001

2.6 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表5 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表5 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與腎衰組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05；④與高劑量組比較，P ＜0.05。

β-catenin 0.36±0.09 1.12±0.29①0.98±0.21②0.56±0.11②③0.38±0.08②③④18.068 0.000組別假手術(shù)組腎衰組低劑量組高劑量組骨化三醇組F 值P 值A(chǔ)PC 1.13±0.25 0.35±0.09①0.48±0.11②0.67±0.13②③0.78±0.15②③④18.503 0.000 TCF4 0.28±0.05 1.07±0.30①0.82±0.15②0.58±0.10②③0.36±0.08②③④20.323 0.000

圖2 各組大鼠腎臟APC、TCF4、β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討論

鈣磷代謝紊亂是CRF 的主要并發(fā)癥之一，貫穿于腎功能損壞的全過(guò)程[8]。長(zhǎng)期鈣磷代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致各種組織器官發(fā)生繼發(fā)性損壞，主要表現(xiàn)為主動(dòng)脈鈣化、軟組織鈣化和腎性骨病等，增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。既往研究顯示，CRF 患者血鈣、血磷、PTH 異常，誘發(fā)高磷血癥，加快血管鈣化的進(jìn)展[9]。臨床上主要以控制患者飲食或使用磷結(jié)合劑來(lái)降低血磷和恢復(fù)血鈣濃度，目前已經(jīng)研制出碳酸司維拉姆、鹽酸司維拉姆等新型磷結(jié)合劑，但價(jià)格昂貴，患者接受度低[10-11]。在現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)中，CRF 屬本虛標(biāo)實(shí)癥，認(rèn)為腎乃“先天之本”，腎氣虛弱，則陰陽(yáng)失調(diào)，導(dǎo)致淤血、痰積、濁毒、風(fēng)邪等實(shí)癥。腎絡(luò)淤堵，濁毒痰瘀潴留，導(dǎo)致鈣磷代謝紊亂；痰瘀于血脈，致血管鈣化，故應(yīng)以補(bǔ)腎健脾，泄?jié)嵬ǜň徑獠“Y。湯水福教授[12]也在其研究中闡述治療CRF 應(yīng)以通絡(luò)、活血、化瘀、益氣為主。

本研究中主動(dòng)脈茜素紅染色結(jié)果表明，腎衰組大鼠主動(dòng)脈完全變成暗紅色，說(shuō)明血管鈣化嚴(yán)重，而相比于腎衰組，低劑量組、高劑量組和骨化三醇組的主動(dòng)脈紅色依次減弱，說(shuō)明益氣活血化瘀湯可以有效緩解鈣磷代謝紊亂，減少血管中鈣磷沉積，減輕血管鈣化程度。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，腎衰組大鼠血鈣、25（OH）D3降低，血磷、PTH、FGF-23 升高。與腎衰組相比，各治療組大鼠血鈣、25（OH）D3升高，血磷、PTH、FGF-23 降低，并且高劑量組各指標(biāo)的變化程度高于低劑量組，提示高劑量的益氣活血化瘀湯可以更好地改善CRF 大鼠鈣磷代謝紊亂。FGF-23 是調(diào)磷素之一，是調(diào)節(jié)血磷與維生素D 的主要物質(zhì)。25（OH）D3是固醇類激素，與PTH、血鈣、血磷的調(diào)節(jié)有關(guān)，可以間接反映機(jī)體鈣磷紊亂程度。血鈣、血磷、PTH 可以直接反映機(jī)體鈣磷代謝紊亂程度?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪可以減緩CRF 大鼠腎損傷，調(diào)節(jié)鈣磷代謝紊亂[13]。Scr、BUN 是機(jī)體代謝產(chǎn)物，由腎臟排除，可以間接反映腎功能。本研究結(jié)果顯示，腎衰組大鼠Scr、BUN高于假手術(shù)組；而與腎衰組相比，各治療組Scr、BUN均出現(xiàn)不同程度的下降。黃芪為補(bǔ)氣的良藥，補(bǔ)氣升陽(yáng)充盈脈絡(luò)之氣，補(bǔ)腎健脾化脾腎之虛，常配伍黨參，達(dá)到益氣固元之功效。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的水提取物可以調(diào)節(jié)CRF 大鼠體內(nèi)Scr、BUN 水平，對(duì)CRF 癥狀有緩解作用[14]。崔龍海等[15]發(fā)現(xiàn)黨參總堿苷治療腎損傷大鼠后，腎壞死灶減小，炎癥浸潤(rùn)降低，對(duì)腎損傷具有保護(hù)作用。丹參具有解毒通絡(luò)，活血化瘀的作用[16]，忍冬藤和紅花具有活血通絡(luò)的作用。中醫(yī)角度認(rèn)為Scr、BUN 屬于機(jī)體的“淤濁”，而本研究中，CRF 大鼠經(jīng)益氣活血化瘀湯治療后，“淤濁”降低，提示益氣活血化瘀湯具有排濁化瘀的功效。正常情況下，由于腎小球的濾過(guò)作用，尿液中的蛋白質(zhì)不會(huì)隨尿液排出體外，而在本研究中收集腎衰組大鼠處死前24 h 尿液發(fā)現(xiàn)其中含有大量UP，說(shuō)明腎功能受損，經(jīng)治療后，各組尿液中UP含量出現(xiàn)不同程度降低。因此推測(cè)，益氣活血化瘀湯具有修復(fù)受損腎臟、排濁化瘀的作用，提高治療劑量則效果更佳。

本研究結(jié)果表明，腎衰組TCF4、β-catenin mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組；各治療組大鼠腎臟TCF4、β-catenin mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于腎衰組。與假手術(shù)組比較，腎衰組大鼠腎臟APC mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)；與腎衰組相比，各治療組大鼠腎臟APC mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)。說(shuō)明益氣活血化瘀湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/βcatenin 信號(hào)通路來(lái)抑制腎臟損傷，保護(hù)腎臟組織。既往研究顯示，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在慢性腎病中發(fā)揮重要作用，其中β-catenin 是該通路的重要蛋白[17]。正常情況下，β-catenin 在細(xì)胞膜上與其他蛋白質(zhì)一同維持細(xì)胞膜的完整性，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，Wnt 激活β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游腎纖維化基因的表達(dá)。APC 則可以降解β-catenin 蛋白復(fù)合體，使細(xì)胞核內(nèi)β-catenin 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，一部分APC 可以與β-catenin 結(jié)合，阻止其激活下游基因，抑制腎臟損傷的發(fā)生。β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核后，無(wú)法直接作用于遺傳物質(zhì)，作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子家族的TCF4 可以幫助β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核，并與其結(jié)合進(jìn)一步激活下游基因，引起腎臟損傷[18]。

綜上所述，益氣活血化瘀湯可以改善CRF 大鼠鈣磷代謝紊亂，緩解血管鈣化程度，適當(dāng)增加益氣活血化瘀湯的劑量療效更好。其治療作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究為中醫(yī)臨床治療CRF 提供了新思路，但益氣活血化瘀湯對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，還需后續(xù)研究進(jìn)一步闡明。