王寶友，潘宏年，王修中，王鳳，汪發(fā)勇

（六安市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 六安 237005）

急性胰腺炎是以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征的急腹癥之一，具有起病急、進(jìn)展快及病死率高的特點(diǎn)。有研究表明，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡是急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[1-2]，因此探尋急性胰腺炎新型生物治療靶標(biāo)有效抑制胰腺腺泡細(xì)胞凋亡已成為臨床研究熱點(diǎn)。MicroRNA（miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡等生理過(guò)程[3]。MicroRNA-146a（miR-146a）是miRNAs 家族一員。張高峰等[4]研究顯示，急性重癥胰腺炎患者外周血miR-146a 水平顯著低于輕度胰腺炎患者，其異常低表達(dá)與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。目前有關(guān)miR-146a 對(duì)急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞的生物學(xué)影響尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究探討miR-146a 對(duì)急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響，并分析相關(guān)機(jī)制，以期為臨床提高急性胰腺炎治療效果提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

大鼠胰腺腺泡細(xì)胞系MPC-83 細(xì)胞株購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI-1640 培養(yǎng)液（武漢純度生物科技有限公司），雨蛙素（純度≥98%，規(guī)格1 mg，上海恒斐生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α, TNF- α）、 白細(xì)胞介素 6（Interleukin-6, IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司），LipofectamineTM2000（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），miR-146a-mimics-NC、miR-146a-mimics 序列由南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，凋亡雙染試劑盒（上海玉博生物科技有限公司）， 兔抗鼠增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein, Bax）、B 淋巴細(xì)胞瘤2（B cell lymphoma 2, Bcl-2）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（nuclear factor-κB p65, NF-кB p65）及內(nèi)參甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）一抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（武漢菲恩生物科技有限公司）。

1.2.1主要儀器酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司），培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）。

1.3 MPC-83細(xì)胞培養(yǎng)及急性胰腺炎模型的構(gòu)建

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將MPC-83 細(xì)胞解凍并復(fù)蘇，于含10%滅活FBS、100 u/mL 青霉素、鏈霉素100 μg/mL的RPMI 1640 培養(yǎng)液，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次（無(wú)菌操作），傳代培養(yǎng)。

1.3.2急性胰腺炎模型的構(gòu)建模型建立前1 天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MPC-83 細(xì)胞按2.5×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 后用100 nmol/L 雨蛙素刺激6 h，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集上清液。采用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6 水平。本研究顯示，雨蛙素處理的MPC-83 細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平高于未經(jīng)雨蛙素處理的MPC-83 細(xì)胞（P＜0.05），表明急性胰腺炎模型建立成功[5]，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組取雨蛙素處理的細(xì)胞按2.5×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 后更換無(wú)FBS 的培養(yǎng)液，隨機(jī)分為兩組。①陰性對(duì)照組（mimics-NC 組）： 采用LipofectamineTM2000 將mimics-NC 序列轉(zhuǎn)染至MPC-83 細(xì)胞；②過(guò)表達(dá)miR-146a 組（miR-146a-mimics 組） ： 采 用LipofectamineTM2000 將miR-146a-mimics 序列轉(zhuǎn)染至MPC-83 細(xì)胞。以未經(jīng)雨蛙素處理的細(xì)胞為空白對(duì)照組（NG 組）。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，比較3 組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度。每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞miR-146a 的表達(dá)分別提取3 組MPC-83 細(xì)胞總RNA 并測(cè)濃度，以RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：ULtra SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向引物各2.0 μL、去離子純化水4.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s，60℃變性60 s，共40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線：60℃、95℃，每15 秒升溫0.3℃。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a 相對(duì)表達(dá)量。qRTPCR 引物由上海韻泰信息科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.4.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取3 組MPC-83 細(xì)胞胰酶消化后按2.5×104個(gè)/孔的密度接種至24 孔板，每孔加入20 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的MTT 試劑，培養(yǎng)2 h 后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各孔細(xì)胞光密度（optical density, OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD 值/NG 組OD 值×100%。每組重復(fù)3 次。

1.4.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取3 組MPC-83細(xì)胞，參照Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒，取濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液100 μL，加入5 μL Annexin V/PITC+10 μL PI（20 μg/mL），混勻，避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，每組重復(fù)3 次。

1.4.5ELISA 檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平收集3 組細(xì)胞上清液，采用ELISA 檢測(cè)各組細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.6Western blotting 檢測(cè)PCNA、Bax、Bcl-2、NFкB p65 蛋白的表達(dá)取3 組MPC-83 細(xì)胞，加入裂解液裂解30 min，離心取上清液，電泳、轉(zhuǎn)模，5%脫脂牛奶封閉3 h，加入兔抗鼠PCNA、Bax、Bcl-2、NF-кB p65 及內(nèi)參GAPDH 作為一抗（1∶500稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)┓跤? h。顯色、成像，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組miR-146a 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.15）、（0.99±0.16）、（1.87±0.25），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=408.873，P=0.000）。與mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組miR-146a 相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組可見(jiàn)較強(qiáng)綠色熒光，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果 （×400）

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（99.96±0.06）%、（128.69±8.97）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=499.735，P=0.000）。與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較

NG組、mimics-NC組、miR-146a-mimics組細(xì)胞凋亡率分別為（39.11±5.86）%、（41.01±6.01）%、（18.76±2.82）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=407.634，P=0.000）。與NG組、mimics-NC組比較，miR-146amimics 組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞流式細(xì)胞圖

2.4 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6水平比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=423.477 和391.410，均P=0.000）。與NG組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6水平比較 （ng/L，x±s）

2.5 各組細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=345.536、352.413、322.885和342.213，均P=0.000）。與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組細(xì)胞PCNA、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），Bax、NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和表3。

圖3 各組細(xì)胞PCNA、Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白的表達(dá)

表3 各組細(xì)胞PCNA、Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組細(xì)胞PCNA、Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：?與NG組、mimics-NC組比較，P ＜0.05。

組別NG組mimics-NC組miR-146a-mimics組F 值P 值NF-κB p65 1.22±0.19 1.25±0.19 0.60±0.09?342.213 0.000 PCNA 0.80±0.12 0.77±0.12 1.26±0.19?345.536 0.000 Bax 0.96±0.14 0.98±0.15 0.36±0.05?352.413 0.000 Bcl-2 0.73±0.11 0.75±0.12 1.15±0.18?322.885 0.000

3 討論

急性胰腺炎是一種常見(jiàn)的危及生命的炎癥性疾病，其發(fā)病率隨人們生活水平提高呈逐年上升趨勢(shì)，但臨床治療方式仍以傳統(tǒng)支持治療為主，沒(méi)有較大改善，故病死率仍居高不下[6-7]。因此探尋新型生物治療靶標(biāo)以提高急性胰腺炎的治療效果十分重要。

有研究表明，TNF-α 可使促炎因子IL-6 的合成和釋放，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)及多器官功能障礙綜合征，其是急性胰腺炎發(fā)生時(shí)較早升高的主要炎癥細(xì)胞因子[8-9]。既往研究表明，雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型能很好地模擬人體急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制，應(yīng)用較多[10]。本研究采用雨蛙素誘導(dǎo)胰腺腺泡MPC-83 細(xì)胞的急性胰腺炎模型，結(jié)果顯示，經(jīng)雨蛙素誘導(dǎo)的MPC-83 細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平顯著高于未經(jīng)雨蛙素誘導(dǎo)的細(xì)胞，說(shuō)明急性胰腺炎細(xì)胞模型建立成功。

miRNAs 是由19～23 個(gè)核苷酸組成的單鏈小分子RNA，能夠調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程[11]。miR-146a 是較早證實(shí)的與炎癥相關(guān)的miRNAs 家族一員。既往研究報(bào)道，抑制miR-146a 表達(dá)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)小鼠糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展[12]。另有研究顯示，血清miR-146a 水平異常表達(dá)參與免疫炎癥疾病類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展[13]。既往研究結(jié)果顯示，外周血miR-146a 異常低表達(dá)參與急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展，且可以評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度[4]。還有研究表明，胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡失衡是急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一[14]。目前有關(guān)miR-146a 對(duì)急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚。PCNA 是細(xì)胞增殖狀態(tài)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Bcl-2、Bax是人體最主要的抑凋亡、促凋亡基因[15]。本研究成功轉(zhuǎn)染MPC-83 細(xì)胞后，結(jié)果顯示，與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146amimics 組細(xì)胞存活率升高，凋亡率、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，PCNA、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明上調(diào)miR-146a 表達(dá)可能抑制雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎MPC-83 細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

NF-κB 是一種炎癥轉(zhuǎn)錄因子，主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白（inhibitor kappa, I-κB）形成復(fù)合體，存在于正常細(xì)胞中。在細(xì)胞因子的刺激下，促使p50/p65 二聚體與I-κB 發(fā)生解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，進(jìn)而調(diào)控多種炎性介質(zhì)（TNF-α、IL-6 等）的轉(zhuǎn)錄，促使大量炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞等）聚集，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[16]。張敏劍等[17]研究結(jié)果表明，抑制NF-κB/IκB 信號(hào)通路活化可對(duì)急性胰腺炎肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。陳進(jìn)城等[18]研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-146a 可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路活化，改善頸型頸椎病模型兔頸部炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示，與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量，TNFα、IL-6 水平顯著降低，與既往炎癥性疾病中表達(dá)模式一致，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-146a 可能通過(guò)抑制NF-κB 通路活化，從而抑制急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。

綜上所述，上調(diào)miR-146a 表達(dá)可抑制急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，其作用可能通過(guò)抑制NF-κB 通路活化來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究為探尋急性胰腺炎新型生物治療靶標(biāo)有效治療急性胰腺炎提供了新的參考依據(jù)。