覃穎穎，楊慧瑩，吳青，謝金蓮，蒙諾，雷宇，唐國(guó)都

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530007；3.右江民族醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣西 百色 533000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是臨床急腹癥的常見(jiàn)病因，20%～30%可進(jìn)展為重癥[1]，且進(jìn)展兇險(xiǎn)， 預(yù)后差[2]。 線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（mitochondrial calcium uniporter, MCU） 是新近鑒定的位于線粒體內(nèi)膜的特異性鈣離子通道，具有對(duì)釕紅（ruthenium red, RR）敏感、可順電化學(xué)梯度攝入Ca2+等特點(diǎn)[3]。胞內(nèi)持續(xù)的鈣離子濃度升高可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞事件[4]，引起細(xì)胞異常的代謝活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5-6]。氧自由基的參與是AP發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，線粒體鈣信號(hào)可作為機(jī)體氧化信號(hào)的調(diào)節(jié)器[7]。強(qiáng)化抗氧化效應(yīng)時(shí)可以改善AP 的嚴(yán)重程度[8]，沉默信息調(diào)節(jié)因子3（silent information regulator 3, SIRT3）可通過(guò)多種途徑抑制機(jī)體生成活性氧（reactive oxygen species, ROS）[9]。DONG 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體腔內(nèi)的ROS 可以作為MCU 半胱氨酸97 敏感的信號(hào)源，促進(jìn)MCU 高階低聚物形成，持續(xù)激活MCU 通道。本研究旨在探討抑制MCU、減輕線粒體鈣超載對(duì)AP 胰腺病理?yè)p傷和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠8～12 周齡、體重210～250 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0004。大鼠在20～25℃空調(diào)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，通風(fēng)良好，鼠籠定期清潔，自由進(jìn)食、飲水。根據(jù)不同研究方法分為對(duì)照組、AP 組、AP+RR 組、RR 組，每組8 只。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（No：2019-KY- 國(guó)基-017）。

1.2 主要試劑

雨蛙肽（上海Amquar 公司），Ⅳ型膠原酶、RR（美國(guó)Sigma公司），白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（武漢華美生物科技有限公司），丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、還原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司），DHE 熒光探針（北京普利萊公司），F(xiàn)luo-4 AM Ca2+（美國(guó)Thermo Fisher 公司）、Rhod-2 AM Ca2+熒光探針（美國(guó)Invitrogen 公司），βactin、MCU、SIRT3 兔源單克隆抗體、羊抗兔二抗（美國(guó)CST 公司），MnSOD 抗體（英國(guó)Abcam 公司）。

1.3 主要儀器

紅外線掃膜儀（美國(guó)Licor 公司），顯微鏡（日本Olympus 株式會(huì)社），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司），7600-120 型自動(dòng)生化分析儀（日本HITACHI 株式會(huì)社），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

1.4 方法

1.4.1AP誘導(dǎo)大鼠禁食12 h，稱體重。對(duì)照組大鼠注射2.5 mg/kg 生理鹽水，AP 組大鼠腹腔注射50 μg/kg 雨蛙肽，每次間隔1 h，注射7 次，復(fù)制AP 模型；AP+ RR 干預(yù)組大鼠腹腔注射2.5 mg/kg RR，20 min 后腹腔注射50 μ g/kg 雨蛙肽，RR 組大鼠注射等量2.5 mg/kg RR。

1.4.2血清淀粉酶（Amylase, Amy）、脂肪酶（Lipase）活性和IL-6表達(dá)量測(cè)定最后1 次注射雨蛙肽結(jié)束開(kāi)始計(jì)時(shí)。模型復(fù)制24 h 后于大鼠腹主動(dòng)脈穿刺取血，4℃靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min，取適量上清液，送至廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清Amy、Lipase 活性；采用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清IL-6 表達(dá)量，在多功能酶標(biāo)儀450 nm 處讀取吸光度值。

1.4.3胰腺組織病理學(xué)評(píng)分模型復(fù)制24 h 后留取大鼠胰腺組織，在4%多聚甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋。選取包埋組織4 μm 厚切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色。顯微鏡下觀察每張樣本切片的5 個(gè)視野（×200）并評(píng)分，并取平均值，最終得分是每個(gè)病理參數(shù)的總和。胰腺組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]見(jiàn)表1。

表1 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.4胰腺腺泡細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察取2 mm×2 mm×2 mm 主胰管組織，戊二醛中避光固定＞2 h，固定、脫水、滲透、包埋、切片、染色，電鏡（×2 500、×8 000）下隨機(jī)拍攝。

1.4.5腺泡細(xì)胞的提取及單細(xì)胞懸液的制備仔細(xì)切取主胰管周圍胰腺組織，大小約2 mm×2 mm×2 mm，剪碎，37℃環(huán)境下與1 mg/mL Ⅳ型膠原酶孵育15～30 min 后終止消化，用70 μm、40 μm 細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，1 000 r/min 離心5 min，杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）洗2、3 次后重懸。

1.4.6腺泡細(xì)胞線粒體內(nèi)Ca2+、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、ROS 濃度檢測(cè)1 mL 腺泡單細(xì)胞懸液分別加入5 μmol/L Rhod-2 AM 和5 μmol/L Fluo-4 AM Ca2+探針工作液，按2∶3 體積在37℃黑暗中孵育30 min；1 mL 腺泡單細(xì)胞懸液和DHE 熒光探針按1 000∶1體積混勻，37℃避光孵育20 min。用D-PBS洗2、3 次后重懸，吸取500～800 μL 至35 mm×10 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，倒置熒光顯微鏡下觀察線粒體內(nèi)Ca2+、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、ROS 濃度，曝光時(shí)間分別為32 ms、195 ms、32 ms。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.7胰腺組織GSH、MDA 含量的測(cè)定托盤天平稱取適量胰腺組織，胰腺組織與冰生理鹽水按重量（g）與體積（mL）1∶9 混合，冰浴后充分研磨，超聲裂解5 s，制成組織勻漿，4 000 r/min離心5 min，取上清液，按GSH、MDA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.4.8Western blotting 檢測(cè)胰腺組織MCU、MnSOD、SIRT3 蛋白表達(dá)將蛋白樣品與5×上樣緩沖液（4∶1）混勻，煮沸5～10 min 備用。一抗稀釋濃度為1∶1 000，熒光二抗稀釋濃度為1∶10 000。轉(zhuǎn)膜條件：150 mA，1 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰腺組織病理評(píng)分和血清Amy、Lipase、IL-6水平比較

各組大鼠胰腺HE 評(píng)分和血清Amy、Lipase、IL-6 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AP 組較對(duì)照組高（P＜0.05），對(duì)照組與RR 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），AP+RR干預(yù)組與AP 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。血清Amy、Lipase、IL-6 水平和組織學(xué)變化表明AP 模型復(fù)制成功。見(jiàn)圖1 和表2。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色情況 （×200）

表2 各組大鼠胰腺組織病理評(píng)分和血清Amy、Lipase、IL-6比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠胰腺組織病理評(píng)分和血清Amy、Lipase、IL-6比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與AP組比較，P ＞0.05；③與對(duì)照組比較，P ＞0.05。

組別對(duì)照組AP組AP+RR干預(yù)組RR組F 值P 值血清IL-6/（pg/mL）8.653±0.478 10.326±1.238①9.724±0.341②8.668±0.328③11.909 0.000胰腺組織病理學(xué)評(píng)分0.200±0.283 4.150±0.463①3.750±0.499②0.325±0.545③173.932 0.000血清Amy/（u/L）862.000±223.671 1 442.444±206.201①1 405.556±235.323②1 058.000±86.226③15.571 0.000血清Lipase/（u/L）15.371±1.613 18.700±2.246①18.180±2.459②16.171±1.341③4.752 0.010

2.2 各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

對(duì)照組、RR 組腺泡細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)尚可。AP 組腺泡細(xì)胞中度水腫，胞內(nèi)局部電子密度減低，部分細(xì)胞器空泡變。細(xì)胞核呈不規(guī)則形，局部凹陷嚴(yán)重，異染色質(zhì)邊集，提示細(xì)胞凋亡，核仁較大；線粒體中度腫脹、基質(zhì)變淡、嵴斷裂、減少，少量嚴(yán)重者膜破損、基質(zhì)外溢。AP+RR 組上述變化較AP 組減輕，腺泡細(xì)胞輕微水腫，細(xì)胞核偶見(jiàn)異染色質(zhì)邊集，核膜完整；線粒體輕微腫脹，形狀、大小尚可，外膜模糊，嵴存在；余細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚可。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 （×8000）

2.3 各組大鼠MCU相對(duì)表達(dá)量，線粒體內(nèi)Ca2+、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度比較

各組大鼠MCU 相對(duì)表達(dá)量，線粒體內(nèi)Ca2+、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AP 組高于對(duì)照組、RR 組（P＜0.05），AP+RR 干預(yù)組低于AP 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3～5 和表3。

圖3 各組大鼠胰腺組織MCU蛋白的表達(dá)

圖4 各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞線粒體內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度變化 （×200）

圖5 各組大鼠腺泡細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度變化 （×200）

表3 各組大鼠MCU相對(duì)表達(dá)量，線粒體內(nèi)Ca2+、胞內(nèi)游離Ca2+濃度比較 （n=8，±s）

表3 各組大鼠MCU相對(duì)表達(dá)量，線粒體內(nèi)Ca2+、胞內(nèi)游離Ca2+濃度比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與AP 組比較，P ＜0.05；③與對(duì)照組比較，P ＞0.05。

胞內(nèi)游離Ca2+1.719±0.011 1.864±0.131①1.700±0.052②1.724±0.008③3.419 0.043組別對(duì)照組AP組AP+RR干預(yù)組RR組F 值P 值MCU 0.373±0.108 0.990±0.113①0.354±0.100②0.356±0.0879③28.251 0.000線粒體內(nèi)Ca2+1.657±0.010 1.951±0.019①1.669±0.018②1.659±0.003③331.314 0.000

2.4 各組大鼠胰腺組織MnSOD、SIRT3 表達(dá)量，GSH、MDA含量和ROS熒光強(qiáng)度比較

各組大鼠胰腺組織MnSOD、SIRT3 表達(dá)量，GSH、MDA 含量和ROS 熒光強(qiáng)度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AP 組MnSOD、SIRT3、GSH 低于對(duì)照組（P＜0.05），ROS、MDA 高于對(duì)照組（P＜0.05），AP+RR 干預(yù)組ROS、MDA 低于AP 組（P＜0.05），MnSOD、SIRT3、GSH 高于AP 組（P＜0.05）。見(jiàn)表4 和圖6～7。

圖6 各組大鼠腺泡細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度變化 （×200）

表4 各組大鼠胰腺組織MnSOD、SIRT3表達(dá)量，GSH、MDA含量和ROS熒光強(qiáng)度比較 （n=8，±s）

表4 各組大鼠胰腺組織MnSOD、SIRT3表達(dá)量，GSH、MDA含量和ROS熒光強(qiáng)度比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與AP組比較，P ＜0.05；③與對(duì)照組比較，P ＞0.05。

組別對(duì)照組AP組AP+RR干預(yù)組RR組F 值P 值MDA/（nmoL/mg）2.162±0.608 4.023±0.651①2.548±0.453②2.181±0.464③30.035 0.000 MnSOD 2.031±0.453 0.912±0.123①1.844±0.383②1.946±0.462③5.582 0.023 SIRT3 0.565±0.170 0.272±0.078①0.475±0.117②0.562±0.176③2.856 0.015 ROS 1.709±0.013 1.810±0.001①1.704±0.011②1.719±0.009③82.071 0.000 GSH/（μmoL/g）133.409±24.631 79.768±17.762①114.165±22.680②132.007±45.283③4.862 0.009

圖7 各組大鼠胰腺組織MnSOD、SIRT3蛋白的表達(dá)

3 討論

MCU 參與了多項(xiàng)生物學(xué)作用，其中在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和腫瘤性疾病研究較多[12-15]。MCU通過(guò)Calpain/OPA-1 等通路，影響線粒體通透性轉(zhuǎn)換及穩(wěn)態(tài)和線粒體分裂/融合的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與小鼠模型心肌缺血再灌注損傷和創(chuàng)傷性腦損傷[16-18]；MCU 上調(diào)線粒體Ca2+攝取，通過(guò)抑制NAD+/SIRT3/SOD2 通路和ROS 激活的c-jun 氨基末端激酶途徑，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-2 的活性[19]。激活ROS/NF-κB 信號(hào)，抑制轉(zhuǎn)錄因子A-線粒體磷酸化促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生[20]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和體內(nèi)外生長(zhǎng)。線粒體是經(jīng)MCU 運(yùn)輸?shù)拟}離子的接收器，線粒體鈣離子信號(hào)異常會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)完整性發(fā)生變化。AP 起病過(guò)程中，腺泡細(xì)胞鈣離子內(nèi)流和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，線粒體形態(tài)以及結(jié)構(gòu)的異常。而應(yīng)用MCU 的抑制劑RR 后，可觀察到腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損害減輕，鈣內(nèi)流減弱，抗氧化效應(yīng)增強(qiáng)。這為AP 鈣超載、線粒體損傷、氧化應(yīng)激提供了生化指標(biāo)和形態(tài)學(xué)證據(jù)。

Western blotting 和熒光探針結(jié)果表明，在雨蛙肽誘導(dǎo)的AP 大鼠中，MCU 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致氧化指標(biāo)ROS 和MDA 水平上升，氧化保護(hù)因子MnSOD、GSH 水平下降。有趣的是，SIRT3 在MCU 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中也呈低表達(dá)，而當(dāng)MCU 的作用被RR 抑制后，氧化應(yīng)激水平下降，SIRT3 的蛋白表達(dá)水平上升，這提示SIRT3 可能是AP 氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)因素，MCU 的激活可能抑制了SIRT3 介導(dǎo)的相關(guān)通路，誘發(fā)氧化應(yīng)激。MCU 的活化可以抑制肝癌細(xì)胞中的NAD+/SIRT3/SOD2 通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力[17]，表明SIRT3 的活化可能抑制MCU 介導(dǎo)的ROS 水平，從而抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展，與本研究結(jié)果相符。SIRT3 可能是治療AP 氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

不幸的是，抑制MCU 無(wú)法改善AP 的病理嚴(yán)重程度。這一結(jié)果與CHVANOV 等[21]結(jié)果是一致的。研究表明，線粒體鈣超載并不是AP 誘導(dǎo)劑引起的唯一損傷效應(yīng)，其可能僅參與腺泡細(xì)胞損傷和AP 啟動(dòng)的部分過(guò)程。即使是在MCU/CYD-D雙基因敲除小鼠中，MCU基因完全缺失，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦線粒體仍能攝取Ca2+[17]。DIA 等[22]發(fā)現(xiàn)，16 周的高脂肪高蔗糖（high-fat high-sucrose diet, HFHSD）喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗、糖尿病心肌病，在HFHSD 心肌細(xì)胞中觀察到IP3R/Grp75/VDAC 鈣通道復(fù)合體減少，IP3 刺激鈣向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)減少，但是MCU 及其調(diào)節(jié)亞基MICU1 并未參與到線粒體鈣離子紊亂這一過(guò)程中，HFHSD 心肌細(xì)胞線粒體鈣攝取減少主要是由于網(wǎng)狀-線粒體功能性鈣耦聯(lián)減少所致。本研究發(fā)現(xiàn)抑制MCU 可能通過(guò)SIRT3/MnSOD 通路來(lái)抑制早期胰腺炎的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但同樣也顯示了RR 并不能顯著改善胰腺炎的病理嚴(yán)重程度。MCU 在AP 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用可能屬于“微效”蛋白。然而在臨床中，即使是輕癥胰腺炎患者的恢復(fù)時(shí)間也需要1 周以上，AP 的臨床治療過(guò)程則更加漫長(zhǎng)。有研究指出，在內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中，高糖誘導(dǎo)的MCU相關(guān)的鈣超載、凋亡和ROS 損傷的表現(xiàn)呈劑量和時(shí)間依賴性[23]，RR 在AP 的治療后期仍有巨大的潛在價(jià)值。