蔣春櫻，石靜，仲海艷

（常州市第四人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 常州 213000）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是消化科常見危重癥，主要表現(xiàn)為胰腺壞死出血，易出現(xiàn)胰腺膿腫、假性囊腫等并發(fā)癥，伴有臟器功能障礙及代謝功能紊亂等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，給患者生命健康帶來嚴(yán)重威脅[1]。目前臨床尚無有效的特異性方法，因此探尋SAP 治療方法仍是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。SAP 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究表明SAP 是一種炎癥反應(yīng)性疾病，其炎癥反應(yīng)機(jī)制仍未完全闡明[2]。

姜黃素是從中藥姜黃中提取出的一種多酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抑癌作用[3]。既往研究顯示，姜黃素可減輕胰腺炎大鼠胰腺組織損傷，但作用機(jī)制尚未完全統(tǒng)一[4-5]。既往研究顯示，抑制JAK2/STAT3 通路活化可減輕胰腺炎大鼠腸道功能損傷及炎癥反應(yīng)[6]。石青青等[7]研究顯示，姜黃素可通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。目前姜黃素對胰腺炎胰腺組織損傷的保護(hù)作用是否與調(diào)控JAK2/STAT3 通路有關(guān)，少見報(bào)道。故本研究基于JAK2/STAT3 通路探究姜黃素對SAP 大鼠胰腺炎癥的影響，以期為治療SAP 提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

50 只SPF 及SD 大鼠，10 周齡，體重190～220 g，平均（205±15）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0264。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑姜黃素，規(guī)格25 g，純度＞95%（上海廣銳生物科技有限公司），?；悄懰徕c，規(guī)格20 mg（滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司），醋酸地塞米松溶液，規(guī)格25 mg（深圳振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司），白細(xì)胞介素6（interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色試劑盒（上海吉至生化科技有限公司），兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體及山羊抗兔HRP 二抗（上海依赫生物科技有限公司）。

1.2.2主要儀器Optima?XPN 超速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司），BSA2202S-CW型電子分析天平（北京科邦興業(yè)科技有限公司），BD-SW50 光學(xué)顯微鏡（深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司），Selectra E 型全自動生化分析儀及其配套試劑（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1SAP 模型的復(fù)制及分組將50 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、SAP 模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組、陽性對照組，每組10 只。其中SAP 模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組、陽性對照組大鼠自由飲水、禁食12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于手術(shù)臺。常規(guī)消毒、鋪巾后，于腹部正中切開，暴露十二指腸，識別胰膽管匯入十二指腸系膜乳頭開口處，在其下緣腸壁無血管區(qū)用注射器針頭穿刺，置入5 cm 硬膜外導(dǎo)管并朝向開口方向緩慢推進(jìn)5 cm，結(jié)扎胰膽管下段及硬膜外導(dǎo)管，于導(dǎo)管末端連接輸液轉(zhuǎn)換器，泵入5%牛磺膽酸鈉溶液（1 mL/kg），流速為0.2 mL/min，2 min后胰腺組織出現(xiàn)水腫、出血等，去除結(jié)扎絲線及動脈夾，復(fù)位十二指腸并逐層縫合腹壁[8]；假手術(shù)組大鼠僅翻動十二指腸、胰腺，不穿刺注藥，其余操作同SAP 模型組。

1.3.2藥物處理模型復(fù)制過程中SAP 模型組、姜黃素低劑量組大鼠各死亡1 只，均剩9 只。SAP模型復(fù)制完成后，姜黃素低、高劑量組大鼠即刻腹腔注射姜黃素50 mg/kg、200 mg/kg[9]，陽性對照組腹腔注射2 mg/kg 地塞米松[10]，假手術(shù)組、SAP 模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。以上藥物均連續(xù)使用3 d。

1.3.3標(biāo)本采集各組大鼠藥物干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行消毒麻醉，打開腹腔后用干棉球吸取腹水。取腹主動脈血，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取血清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｌ幩来笫?，取胰腺組織并分為兩部分，一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，用于病理染色；一部分保存于液氮中，用于蛋白檢測。

1.3.4腹水量測定用電子分析天平記錄干棉球重量（干重）、吸取腹水后重量（濕重），計(jì)算腹水量（mg）=棉球濕重（mg）-棉球干重（mg）[11]。

1.3.5各組大鼠血清淀粉酶（Amylase,Amy）、炎癥因子IL-6、TNF-α水平測定 從-80℃冰箱中取出凍存血清樣本后解凍，采用全自動生化分析儀測定大鼠血清Amy 水平；ELISA 測定血清IL-6、TNF-α 水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行[12]。

1.3.6HE 染色取各組大鼠胰腺組織，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片厚約6 μm，進(jìn)行HE 染色[13]。中性樹膠封片，采用雙盲法，由2 位病理科醫(yī)師用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化后進(jìn)行病理學(xué)評分。病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)參照改良的Schmidt 法[14]，依據(jù)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、腺泡壞死嚴(yán)重程度及范圍進(jìn)行病理學(xué)評分。

1.3.7Western blotting 檢測各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3 通路蛋白的表達(dá)取各組大鼠胰腺組織，制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3，內(nèi)參β-actin（均按1∶1 000 稀釋），次日加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋），室溫孵育2 h，顯色、顯影、定影，根據(jù)各蛋白條帶灰度值計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量[15]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腹水量、血清Amy水平比較

5 組大鼠腹水量、血清Amy 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組腹水量和血清Amy 水平升高（P＜0.05）；姜黃素低、高劑量組及陽性對照組腹水量、血清Amy 水平低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組腹水量、血清Amy 水平低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腹水量、血清AMY水平比較 （±s）

表1 各組大鼠腹水量、血清AMY水平比較 （±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與SAP 模型組比較，P ＜0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P ＜0.05。

Amy/（u/L）1 381.22±207.19 5 638.78±845.82①4 312.78±647.92①②2 010.12±302.50①②③2 006.12±300.92①②③120.073 0.000組別假手術(shù)組SAP模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F 值P 值n 10 991 0 10腹水量/mg 0.68±0.11 6.75±1.02①3.98±0.60①②1.51±0.23①②③1.47±0.23①②③203.527 0.000

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

5 組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組血清IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；姜黃素低、高劑量組及陽性對照組血清IL-6、TNF-α 水平低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組IL-6、TNF-α 水平低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與SAP 模型組比較，P ＜0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P ＜0.05。

TNF-α/（ng/L）163.01±25.45 468.79±70.32①277.66±41.65①②223.05±3.45①②③226.12±33.93①②③78.874 0.000組別假手術(shù)組SAP模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F 值P 值n 10 991 0 10 IL-6/（pg/mL）15.33±2.29 48.96±7.35①37.13±5.57①②28.62±4.30①②③27.97±4.21①②③59.637 0.000

2.3 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化及病理學(xué)評分比較

假手術(shù)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)正常，未見水腫、出血及炎癥細(xì)胞浸潤；SAP 模型組大鼠胰腺組織充血水腫、空泡化樣變，可見炎癥細(xì)胞浸潤及腺泡細(xì)胞壞死；與SAP 模型組比較，姜黃素低、高劑量組及陽性對照組大鼠上述病理學(xué)變化有所改善，且高劑量組及陽性對照組大鼠上述病理學(xué)變化更加明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化 （HE染色×200）

假手術(shù)組、SAP 模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組、陽性對照組大鼠病理學(xué)評分分別為（1.33±0.20）分、（11.77±0.26）分、（8.69±1.31）分、（5.12±0.77）分、（5.06±0.76）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=254.950，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組組織病理學(xué)評分升高（P＜0.05）；但姜黃素低、高劑量組及陽性對照組組織病理學(xué)評分低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組組織病理學(xué)評分低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3 通路蛋白相對表達(dá)量比較

5 組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2 和p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；姜黃素低、高劑量組及陽性對照組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表3 和圖2。

圖2 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3通路蛋白的表達(dá)

表3 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3通路蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3通路蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與SAP 模型組比較，P ＜0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P ＜0.05。

p-STAT3/STAT3 0.23±0.03 0.87±0.13①0.60±0.09①②0.25±0.04①②③0.24±0.05①②③137.095 0.000組別假手術(shù)組SAP模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F 值P 值n 10 991 0 10 p-JAK2/JAK2 0.16±0.03 0.99±0.15①0.76±0.11①②0.38±0.06①②③0.35±0.07①②③127.474 0.000

3 討論

SAP 是多因素誘發(fā)、多個(gè)臟器受累的炎癥反應(yīng)性危重急腹癥，病情兇險(xiǎn)，發(fā)展迅速，部分患者可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多種器官衰竭，目前臨床仍缺乏有效的特異性治療方法。姜黃素是我國傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，且毒性低，副作用較少，對胰腺炎的防治發(fā)揮積極作用[16-17]，但治療機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明，炎癥反應(yīng)在SAP 導(dǎo)致的多臟器功能損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

胰腺炎早期特征是胰腺腺泡細(xì)胞局部壞死，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α 等的產(chǎn)生，并促使這些炎癥因子募集到炎癥發(fā)生部位，從而加劇胰腺損傷及病情進(jìn)展[18]。由于腹腔內(nèi)和腹膜后的炎癥刺激造成胰腺損傷，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)液體分布改變并在腹腔內(nèi)大量滲出，形成腹水[19]。血清Amy 是一種用于分解淀粉和高分子多糖的酶類物質(zhì)，正常人體血清Amy 維持在一定水平，其異常升高常用于診斷胰腺炎[20]。本研究結(jié)果顯示，SAP 模型組大鼠胰腺組織充血水腫，可見炎癥細(xì)胞浸潤及腺泡細(xì)胞壞死，且大鼠腹水量，血清Amy、IL-6、TNF-α 水平及組織病理學(xué)評分升高，當(dāng)姜黃素藥物干預(yù)后，大鼠胰腺組織上述病理學(xué)變化有所改善，且大鼠腹水量，血清Amy、IL-6、TNF-α 水平及組織病理學(xué)評分均一定程度降低，說明姜黃素可能通過抑制SAP 大鼠胰腺炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對胰腺組織發(fā)揮保護(hù)作用。JAK/STAT通路是多種炎癥細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路之一，可介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)信號，其中JAK2/STAT3 是JAK/STAT 通路中一條重要的炎癥信號通路，當(dāng)JAK2 磷酸化反應(yīng)被激活后，促使下游STAT3基因發(fā)生磷酸化反應(yīng)生成p-STAT3，最終介導(dǎo)機(jī)體分泌IL-6、TNF-α 等促炎因子，導(dǎo)致炎癥加重[21]。既往研究結(jié)果顯示，抑制JAK2/STAT3 通路活化能夠抑制SAP 大鼠炎癥因子分泌，改善大鼠肺功能損傷[22]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAP 模型組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量升高，當(dāng)姜黃素藥物干預(yù)后，大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量一定程度降低，說明姜黃素可能通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，姜黃素對SAP 大鼠胰腺損傷發(fā)揮保護(hù)作用，可能是通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，抑制炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，可為臨床有效治療SAP 提供一定參考。然而本研究并未能明確姜黃素對JAK2/STAT3 通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進(jìn)行深入研究。