萬彬彬，楊惠琴，胡剛明，鄒榮

（1.武漢市第一醫(yī)院 風濕免疫科，湖北 武漢 430022；2.漢川市人民醫(yī)院 腎內科，湖北 漢川 431600；3.武漢市第一醫(yī)院 腎病科，湖北 武漢 430022）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種復雜、慢性、進行性的自身免疫性疾病，影響全世界約1%人口[1]。如果未得到有效治療，40%～70%患者最終會發(fā)展為殘疾。目前尚無治療RA 的特效藥物，分析RA 的病因至關重要[2]。類風濕性關節(jié)炎滑膜成纖維細胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）促進RA 的發(fā)生、發(fā)展，其大量增殖并侵襲進入滑膜和骨組織，分泌炎癥細胞因子，發(fā)揮促炎癥作用[3]。Dickkopf-1（DKK1）蛋白是一種配體蛋白，參與細胞的增殖、分化、凋亡及炎癥反應。有研究發(fā)現(xiàn)，DKK1 升高與RA 患者早期炎癥反應有關[4]。MicroRNA（miRNA）是一種長度約為22 個核苷酸且高度保守的單鏈RNA，轉錄后可調控基因表達[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-126 在RA 患者中下調，并且能抑制RA 小鼠模型中RASFs 介導的炎癥因子分泌[6]。但是miR-126 對RASFs 生物學行為的影響和作用機制仍不清楚。本研究主要分析miR-126 通過靶向DKK1 參與RASFs 增殖、侵襲、凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選取2018 年6 月—2019 年9 月在武漢市第一醫(yī)院就診的25 例RA 患者的滑膜組織（RA 組），同時收集在本院同期接受膝關節(jié)十字韌帶斷裂重建手術的21 例非類風濕關節(jié)炎患者的滑膜組織作為健康組（均無急性或慢性關節(jié)異常的病史）。RA 患者男性14 例，女性11 例；年齡39～65 歲，平均（51.25±3.08）歲。正?；そM織者年齡35～65 歲，平均（50.94±3.18）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（No：20190618），患者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.2 排除標準①組織收集前3 個月內接受過RA 相關治療；②合并惡性腫瘤、血液學疾病、感染或其他炎癥；③合并其他骨關節(jié)疾病。

1.3 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基血清和抗體（美國Invitrogen公司），胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶（美國Sigma-Aldrich 公司），miR-126 mimic、DDK1 過表達質粒及陰性對照（negative control，NC）（蘇州吉瑪基因股份有限公司），miRNeasy Mini 試劑盒（美國GE 公司），TaqMan miRNA 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司），快速定點誘變試劑盒和Renilla 螢光素酶質粒（上海碧云天生物技術有限公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），基質膠和Transwell裝置（美國Corning公司），凋亡試劑盒（Annexin V-FITC 和PI）（北京百普賽斯生物科技股份有限公司），兔單克隆抗體和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000 稀釋，#ab6721）（美國Abcam 公司），PVDF 膜（美國Bio-Rad公司），ECL 顯色試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）。螢光素酶報告基因檢測試劑盒和檢測儀1000 System（美國Promega公司），流式細胞儀（美國Becton公司）。

1.4 RASFs培養(yǎng)和轉染

將RA 患者滑膜組織用2.5 g/L 胰蛋白酶在37℃條件下消化2 h，離心獲得RASFs[7]。RASFs 在37℃、5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)。當細胞生長至接近匯合狀態(tài)時，即可進行細胞傳代，將第3～8 代細胞用于后續(xù)實驗。

RASFs 分為4 組：對照組、miR-126 組、DKK1組、miR-126+DKK1 組。miR-126 組和DKK1 組分別轉染miR-126 mimic、DKK1 過表達質粒，對照組轉染等量NC 質粒，miR-126+DKK1 組轉染miR-126 mimic 和DKK1。將細胞在6 孔板中培養(yǎng)，當細胞融合至60%時，添加Opti 100 μL和LipofectamineTM2000 5 μL 并孵育5 min 作為試劑A。加入Opti 100 μL mimic 或者DKK1 質粒20 ng/μL 并孵育5 min 作為試劑B。將A 和B 混合在一起孵育20 min。16 h 后更換培養(yǎng)基并收獲細胞。

1.5 方法

1.5.1實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitativerealtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測miR-126的表達 使用miRNeasy Mini 試劑盒提取滑膜組織或RASFs 中總RNA，并用TaqMan miRNA 試劑盒逆轉錄為cDNA。反應條件：37℃、15 min，98℃、5 min。以cDNA 為模板行qRT-PCR，反應條件：95℃預變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸4 min。以U6為內參，通過比較循環(huán)閾值計算miR-126 相對表達量。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5.2Western blotting檢測DKK1蛋白的表達健康組滑膜組織、RA組RASFs裂解后，4℃、12 000 r/min離心5 min 收集總蛋白。通過8% SDS-PAGE 分離每個樣本中等量（50 μg）的蛋白質，并將其轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。將膜與兔單克隆抗體在4℃條件下孵育過夜，然后將膜與相應的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 顯色試劑盒顯影，使用Quantum One 軟件分析灰度，計算DKK1 蛋白相對表達量。

1.5.3雙螢光素酶報告檢測miR-126 和DKK1 的靶向關系通過Starbase 得到miR-126 與DKK1 的堿基結合位點。將野生型（Wt）的DKK1 序列擴增到pGL4 螢光素酶載體的下游位點，使用快速定點誘變試劑盒生成突變型（Mut）DKK1。將RASFs 細胞按3×104/孔的密度接種在24 孔板中，24 h 后使用LipofectamineTM2000 將1 μg Wt/Mut-DKK1 螢光素酶質粒轉染細胞，然后分別轉染50 nmol/L miR-126 mimic（miR-126 mimic 組）或者miR-126 NC 質粒（miR-126 NC 組）。細胞在37℃下孵育36 h，使用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。所有數(shù)據(jù)以Renilla 螢光素酶活性進行標準化。

1.5.4CCK-8法檢測細胞活力將100 μL 細胞懸浮液添加到96 孔板中孵育48 h，將10 μL CCK-8 溶液添加到每個孔中并孵育2 h。用酶標儀在450 nm波長處檢測每個孔的光密度（optical density, OD）值，間接反映細胞活力。

脂類是生物的能量儲存庫，是構成生物膜的重要物質，對機體具有重要的生物學作用和生理學調控功能[12,13]。蟹類的體脂含量受溫度和氣候的影響較大[14]。不同規(guī)格的中華絨螯蟹在囤養(yǎng)期間受時間階段的影響波動較大，可能是由于囤養(yǎng)階段溫度太低，不同規(guī)格的蟹應對環(huán)境的耐力不同，導致囤養(yǎng)階段脂含量的不同。

1.5.5Transwell 實驗檢測細胞侵襲力將基質膠（1∶8 稀釋）加入上室，并在37℃條件下孵育30 min。將600 μL 完全培養(yǎng)基填充到24 孔板Transwell 下室，37℃條件下，將各組細胞置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 進行饑餓處理。消化后向Transwell 上室中加入100 μL 細胞溶液（5×105個細胞/mL），24 h 后洗去未侵入的細胞。滲入下室的細胞用95%乙醇固定，0.1%結晶紫室溫染色20 min，最后在400 倍視野中隨機選取5 個視野計數(shù)細胞。

1.5.6流式細胞術檢測凋亡將細胞用PBS 洗滌并懸浮在100 μL 結合緩沖液中。分別加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，并在室溫下黑暗中孵育10～15 min。最后將400 μL 結合緩沖液添加到樣品中，并在1 h 內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗；兩組比較用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 健康組與RA 組滑膜組織miR-126 和DKK1蛋白相對表達量比較

健康組和RA組滑膜組織miR-126相對表達量分別為（0.32±0.03）和（1.01±0.02），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.855，P=0.000），RA組低于健康組。健康組和RA 組滑膜組織中DKK1 蛋白相對表達量分別為（0.46±0.03）和（1.03±0.12），t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=27.921，P=0.000），RA組高于健康組。見圖1。

圖1 健康組和RA組滑膜組織中DKK1蛋白的表達

2.2 miR-126與DKK1的靶向關系

miR-126 與DKK1 的靶向結合位點見圖2。miR-126 NC 組、miR-126 mimic 組與DKK1 Wt 共轉染后的相對螢光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-126 mimic 組低于miR-126 NC 組，證明miR-126 與DKK1 靶向結合。miR-126 NC 組、miR-126 mimic 組與DKK1 Mut 共轉染后的相對螢光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 miR-126與DKK1 mRNA 3＇端的非翻譯區(qū)域結合位點

表2 不同轉染方式的細胞相對螢光素酶活性比較 （±s）

表2 不同轉染方式的細胞相對螢光素酶活性比較 （±s）

組別miR-126 NC組miR-126 mimic組t 值P 值DKK1 Wt 1.03±0.11 0.52±0.03 27.013 0.008 DKK1 Mut 1.09±0.02 1.01±0.07 1.236 0.935

2.3 各組RASFs中miR-126和DKK1蛋白相對表達量比較

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 中miR-126 相對表達量分別為（1.02±0.02）、（5.09±0.18）、（0.81±0.03）和（3.82±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=34.528，P=0.000），miR-126 組高于對照組（P＜0.05），提示轉染成功。

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 中DKK1 蛋白相對表達量分別為（1.02±0.07）、（0.39±0.05）、（3.82±0.06）和（0.91±0.05），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=31.016，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：DKK1 組高于對照組（P＜0.05）；miR-126 組低于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組RASFs中DKK1蛋白的表達

2.4 miR-126和DKK1對RASFs增殖的影響

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 的OD 值分別為（0.72±0.06）、（0.59±0.05）、（0.91±0.09）和（0.70±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=22.361，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：miR-126 組低于對照組（P＜0.05）；DKK1 組高于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。

2.5 miR-126和DKK1對RASFs侵襲的影響

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs的侵襲細胞數(shù)分別為（65.38±3.62）個、（31.76±2.54）個、（119.04±4.27）個和（62.58±3.77）個，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=38.214，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：miR-126 組低于對照組（P＜0.05）；DKK1 組高于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組RASFs侵襲細胞數(shù) （×400）

2.6 miR-126和DKK1對RASFs凋亡的影響

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 的凋亡率分別為（5.59±0.53）%、（18.74±1.06）%、（3.61±0.34）%和（10.62±0.99）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=35.014，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：miR-126 組高于對照組（P＜0.05）；DKK1 組低于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組RASFs流式細胞術圖

3 討論

RA 表現(xiàn)為滑膜增生、炎癥和骨質破壞。除關節(jié)受累外，病程較長的RA 患者還可能有各種關節(jié)外表現(xiàn)，如間質性肺疾病、心血管疾病等，極大地增加了患者和社會的負擔[8]。現(xiàn)階段，RA 的主要治療方法是對癥治療，以及抗炎、免疫抑制、中藥治療[9]，尚無特效根治藥物。因此分析其發(fā)病機制對于探究新的RA 治療藥物和方法具有重要意義。

RASFs 是維持關節(jié)正常結構和功能的重要細胞，也是RA 的主要靶細胞，抑制其病變是緩解RA的重要方法[10]。RA 中RASFs 會過度增殖，一方面，大量的RASFs 會促進炎癥細胞因子分泌，促進RA發(fā)展；另一方面，RASFs 也會侵襲進入軟骨甚至骨組織，導致關節(jié)膨大、活動性降低[11-12]。miRNA 可在轉錄后調控細胞中蛋白表達水平，進而調節(jié)細胞功能和生物學行為[13]。近年來，目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在RA 的發(fā)生、進展中發(fā)揮關鍵作用，如miR-20a 調節(jié)RA 中RASFs 增殖和凋亡，促進RA 病情進展[14]。miR-126 是一種新發(fā)現(xiàn)的RA 相關miRNA。有研究顯示，RA 患者miR-126 顯著降低，并且miR-126 降低與疾病嚴重程度有關[15]。然而，也有研究顯示RA 患者miR-126 升高，目前miR-126在RA 中的意義仍不清楚[16]。本研究結果表明，RA患者滑膜組織miR-126 相對表達量降低。為分析miR-126 對RASFs 生物學行為的影響，利用RA 患者滑膜組織構建了原代RASFs，并通過轉染提高細胞中miR-126 表達，結果顯示miR-126 會顯著抑制RASFs 的增殖和侵襲，并誘導其凋亡。WANG 等[17]的研究顯示，miR-126 通過VEGF-Notch 信號通路，促進青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-126 通過下調抗凋亡蛋白MCL，誘導骨髓瘤細胞系Karpas707 凋亡，抑制增殖[18]。結合文獻報道和本研究結果，提示miR-126 缺失可能會減少RASFs凋亡并促進RASFs 過度增殖和侵襲，從而導致關節(jié)異常。

DKK1 蛋白通過抑制LRP5/6 與Wnt 的相互作用，以及與促進LRP5/6 內化來拮抗經(jīng)典的Wnt 通路的信號傳導[19]。DKKs 在脊椎動物發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其可局部抑制Wnt 調節(jié)過程，調控肢體發(fā)育、體節(jié)發(fā)生和眼睛形成。最新臨床研究顯示，治療后RA 患者血清DKK1 水平降低，并且滑膜組織病變得到緩解[20]；并且DKK1 靶向型siRNA 削弱了RA 中RASFs 活性[21]。此外，DKK1 受到miRNA 的靶向調節(jié)，miR-BART10-3p 可通過靶向抑制DKK1 水平，抑制細胞增殖和侵襲[22]。本研究結果顯示，RA 患者滑膜組織中DKK1 水平顯著高于健康者，其變化趨勢與miR-126 相反。通過預測和驗證，本研究證實miR126 能夠與DKK 靶向結合，并抑制DKK1 蛋白的表達。細胞實驗結果顯示，過表達DKK1 顯著促進RASFs 的增殖和侵襲，并抑制凋亡。此外，過表達DKK1 顯著緩解miR-126 對RASFs 增殖和侵襲的抑制作用，并緩解miR-126 對RASFs 凋亡的促進作用。本研究結果提示，RASFs 中miR-126 降低可能會引起DKK1 蛋白過表達，而過表達則可通過靶向抑制DKK1 蛋白，緩解RA 患者RASFs 病變。

然而，本研究也存在不足之處，其中miR-126 在RA 滑膜中的表達特點仍需要擴大樣本進行分析，關于miR-126 通過靶向DKK1 對RASFs 增殖、分化和氧化應激的影響仍需要體內實驗來證實。綜上所述，miR-126 在RA 滑膜組織中低表達，miR-126 可通過靶向DKK1，抑制RASFs 增殖、侵襲及凋亡。