杜惠君，高 晨，左振宇，李凌凌，楊忠華

(武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢，430081)

β-羥基酯類手性醇廣泛應用于醫(yī)藥合成和精細化學品領域[1]，是他汀類藥物、碳青霉烯類抗生素、L-肉毒堿等的關(guān)鍵手性砌塊[2-3]，可通過化學合成、外消旋體拆分和生物催化等方法制備[4]，其中，全細胞生物催化不對稱合成法因具有高度對映選擇性、無胞內(nèi)酶的分離提純步驟且不需額外添加輔因子等優(yōu)點而成為制備手性β-羥基酯的理想方法[5]。

目前，用于全細胞生物催化法不對稱合成β-羥基酯的催化劑主要為微生物細胞[6]，如Ma等[7]利用酵母細胞催化以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為模型底物的β-酮酯，不對稱合成β-羥基酯的對映體過量值為92%。然而，利用野生型微生物細胞作為催化劑時缺乏足夠的[H] 作為推動力[8]，進而影響手性醇的合成效率。針對該問題，研究者通常將大腸桿菌(E.coli)作為表達宿主菌，利用代謝調(diào)控法構(gòu)建羰基還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生酶偶聯(lián)體系，解決胞內(nèi)輔酶NADPH的供給問題[9]，從而改善微生物細胞的催化效率。據(jù)文獻[10]報道，利用磷酸戊糖途徑代謝強化NADPH再生能力可以提高β-羥基酯的合成效率，但該途徑中存在CO2合成，致使碳源損失嚴重。而糖酵解(EMP)途徑產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少，理論上消耗1分子葡萄糖可產(chǎn)生2 分子的輔酶NADPH，故EMP可作為輔酶NADPH再生的主要途徑[11]。大腸桿菌細胞中調(diào)控EMP再生NAD(P)H的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)偏好輔酶為NAD+，不能再生NADPH，如果引入外源NADP+依賴性GAPDH(NADP+-GAPDH)取代NAD+依賴性GAPDH則可直接利用EMP途徑再生NADPH[12]。另外，胞內(nèi)NADP+含量不高也是造成胞內(nèi)NADPH供給不足的原因，已有研究表明，NAD激酶是目前生物體內(nèi)唯一能將NAD+磷酸化合成NADP+的酶，因此引入NAD激酶也可進一步促進NADPH的內(nèi)源性合成[13]。本課題組[14]曾通過調(diào)控外源NADP+-GAPDH和過表達NAD激酶，大大提高了大腸桿菌胞內(nèi)NADPH的內(nèi)源性合成，(S)-苯乙醇的產(chǎn)率高達99.2%，對映體過量值(e.e.)超過99%，但該催化體系具有α-芳香酮類底物專一性，不適用于β-羥基酯的生產(chǎn)。而蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)中的羰基還原酶對β-酮酯有較強的催化還原活性，且對輔酶NADPH親和力較高，在中性環(huán)境下結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定[15]，基于此，本研究通過調(diào)控EMP途徑中NADP+-GAPDH和過表達NAD激酶來強化NADPH的內(nèi)源性合成，為β-酮酯的不對稱還原過程提供足夠的推動力，進而為手性β-羥基酯的高效合成提供可行性方案。

1 材料和方法

1.1 試劑、菌株和質(zhì)粒

基因操作所用工具酶購自廣州美基生物科技有限公司；底物COBE購自上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯、苯甲醛、葡萄糖、Na2HPO4、NaH2PO4等均為分析純，購自于國藥集團化學試劑有限公司。本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1，其中Ampr為氨芐青霉素，終濃度為100 μg/mL；Kanr為卡那霉素，終濃度為50 μg/mL。所有細胞均用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，LB液體培養(yǎng)基由10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉及1000 mL去離子水配制而成，此基礎上另加入15 g瓊脂粉配制LB固體培養(yǎng)基。

表1 菌株和質(zhì)粒

1.2 重組質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR的構(gòu)建

本研究利用雙基因串聯(lián)載體旨在構(gòu)建羰基還原酶BcCR和NADP+-GAPDH再生NADPH偶聯(lián)體系，其中BcCR為本課題組利用基因挖掘法獲得的還原β-酮酯不對稱合成β-羥基酯的高活性羰基還原酶，該酶的UniProt編號為Q819V6，GenBank核苷酸序列編號為AAP10771.1[15]。首先利用Primer Premier 5.0軟件對照目的片段bcCR和載體質(zhì)粒pETDueT-1的酶切位點信息設計引物，正向引物bcCR-F為GGGAATTCC↓ATATGATGTTAAAAGGGAAGGTAGCATT，其中C↓ATATG為Nde I的酶切位點，反向引物bcCR-R為CCC↓TCGAGCATTACCATACCGCCATCAAC，其中C↓TCGAG為Xho I的酶切位點。然后，以Bacilluscereus基因組DNA為模板，通過PCR擴增目的片段、雙酶切、連接實驗將bcCR導入質(zhì)粒載體pETDueT-1和pETDueT-1-gapB中，并利用菌液PCR和雙酶切鑒定目的基因的轉(zhuǎn)化情況。圖2所示為重組質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR構(gòu)建原理。

圖1 重組質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR的構(gòu)建

1.3 羰基還原酶偶聯(lián)輔酶再生共表達體系的構(gòu)建與表達

在代謝調(diào)控EMP途徑中，源于Bacillussubtilis(strain 168)、編碼基因為gapB的NADP+-GAPDH催化甘油醛-3-磷酸的不可逆氧化過程是大腸桿菌胞內(nèi)NADPH再生的關(guān)鍵步驟，但其胞內(nèi)氧化型輔酶NADP+供給不足，限制了NADPH再生。利用源于Escherichiacoli(strain K12 MG1655)、編碼基因為yfjB的NAD激酶(NADK)可以使胞內(nèi)NAD+磷酸化形成NADP+，從而為NADPH的再生提供足夠的氧化型底物。故本研究將所構(gòu)建的質(zhì)粒pETDueT-1-bcCR和pETDueT-1-gapB-bcCR通過雙質(zhì)粒共表達技術(shù)電轉(zhuǎn)至E.coliBL21(DE3)和E.coliBL21(DE3)/pET-28a-yfjB進行表達，獲得重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-bcCR、E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-gapB-bcCR、E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-bcCR&pET-28a-yfjB、E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-gapB -bcCR&pET-28a-yfjB,以E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1&pET-28a為對照組。

利用0.4 mmol/L的IPTG對所構(gòu)建的工程菌進行低溫誘導表達后離心收集菌體，經(jīng)濃度為0.05 mol/L、pH 為7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，以0.1 g/mL的菌體濃度重懸細胞。采用超聲破胞法提取粗酶液，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定蛋白表達情況，同時，因BcCR、NADP+-GAPDH、NADK在催化過程中伴隨NADPH的消耗或合成，且NADPH在340 nm處存在吸光值，故參考Qin等[15]所述方法測定BcCR的酶活，按Luo等[16]所述方法測定NADP+-GAPDH、NADK的酶活，并利用紫外可見分光光度法檢測重組菌在24 h內(nèi)的生長狀況。

1.4 全細胞催化不對稱還原COBE反應

全細胞催化不對稱還原COBE的反應過程參照文獻[16]。首先，使用pH為7.0、濃度為0.05 mol/L的PBS緩沖液以0.1 g/mL的菌濃度重懸大腸桿菌細胞。然后，取5 mL重懸液置于50 mL錐形瓶中，加入葡萄糖(1.5 g/L)和底物COBE(40 mmol/L)，在37 ℃、180 r/min的條件下反應20 h。最后，利用乙酸乙酯對產(chǎn)物(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)和底物COBE進行萃取，以苯甲醛為內(nèi)標物。

1.5 分析方法

1.5.1 重組蛋白酶的酶活檢測方法

利用紫外/可見分光光度法[14-15]測定三種重組蛋白BcCR、NADP+-GAPDH、NADK的酶活力。在最適反應條件下，每分鐘消耗或生成1 μmol NADPH所需要的酶量為一個酶活單位(U)，即1 U=1 μmol/min。根據(jù)NADPH的標準吸光度曲線計算待測樣品中NADPH的濃度CNADPH，計算公式為：

CNADPH=(A-0.016 55)/6.510 91

(1)

式中，A為吸光值。同時，以濃度為100 μg/mL的牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白，利用考馬斯亮藍G-250染液法測定粗酶液中各蛋白的蛋白含量[15]，進而分析3種重組酶的比活。蛋白含量Cprotein計算公式為：

Cprotein=(A+0.001 62)/0.008 97

(2)

蛋白酶比活的定義為：25 ℃下，單位質(zhì)量的重組蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。

1.5.2 COBE還原產(chǎn)物的定性和定量分析

借助Agilent 1100 HPLC型液相色譜儀，利用高效液相色譜法[17]確定目標產(chǎn)物的e.e.值，流動相為正己烷/異丙醇(體積比為85/15)，流速為0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為220 nm。e.e.值計算公式為：

(3)

式中，CR和CS分別是反應結(jié)束時產(chǎn)物(R)-CHBE和(S)-CHBE的濃度。

利用島津GC-2010型氣相色譜儀對COBE還原產(chǎn)物進行定量分析[15]。檢測時以N2為載氣，色譜柱為Rtx-Wax毛細管手性柱，流速為1.5 mL/min，分流比為30∶1。利用內(nèi)標法計算目標手性醇產(chǎn)率Yield，計算公式為：

(4)

式中，Csub是反應初始時的底物濃度；CP是反應結(jié)束時的產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR的構(gòu)建

利用雙基因串聯(lián)載體將外源性NADPH合成酶NADP+-GAPDH和羰基還原酶偶聯(lián)表達，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR，重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果如圖2(a)所示，其中泳道M為Marker DL2000，泳道1為重組質(zhì)粒pETDueT-1-bcCR的PCR鑒定結(jié)果，泳道2為重組質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR的PCR鑒定結(jié)果。由圖2(a)可見，菌液PCR產(chǎn)物在750 bp處均存在單一目的條帶，初步判斷目的基因已成功導入。為了排除“假陽性”轉(zhuǎn)化子的可能性，確定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，對重組質(zhì)粒進行Nde I、Xho I雙酶切，結(jié)果如圖2(b)所示，其中泳道M為Marker DL5000，泳道1為pETDueT-1，泳道2為pETDueT-1-bcCR，泳道3為pETDueT-1-gapB-bcCR。從圖2(b)中可以看出，對比泳道1中的空載質(zhì)粒pETDueT-1，泳道3處獲得了大小為6000 bp和750 bp左右的2個目的片段，分別與質(zhì)粒pETDuet-1-gapB和目的基因bcCR的特征[11-12]相符，證實本研究已成功構(gòu)建了質(zhì)粒pETDueT-1-gapB-bcCR。

(a) PCR鑒定 (b)雙酶切鑒定

2.2 羰基還原酶偶聯(lián)輔酶再生體系的構(gòu)建與表達

將所構(gòu)建的工程菌進行誘導表達，利用超聲破胞法提取目的蛋白，并通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，其中泳道M為標準蛋白Marker，泳道1為源于E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1&pET-28a粗酶液，泳道2為源于E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-bcCR粗酶液，泳道3為源于E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-bcCR粗酶液，泳道4為源于E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-bcCR&pET-28a-yfjB粗酶液；泳道5為E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-bcCR&pET-28a-yfjB中的蛋白粗酶液。由圖3可見，蛋白酶BcCR、NADP+-GAPDH和NADK的分子量分別為27、41、35 kDa，與文獻[14-15]報道一致，與對照菌相比，上述3種蛋白酶均相應地成功表達出單一特異性條帶，且表達效果良好，表明3者在重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-bcCR&pET28a-yfjB中被高水平成功表達。

圖3 SDS-PAGE檢測結(jié)果

為了進一步探討NADP+-GAPDH、NADK、BcCR共表達對大腸桿菌生長狀況的影響，利用紫外/可見分光光度法測定了5種工程菌的生長情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，與對照菌E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1&pET-28a相比，經(jīng)IPTG誘導表達的其它4種工程菌生長速度遠超過前者，表明利用雙基因串聯(lián)表達載體與雙質(zhì)粒共表達技術(shù)表達外源基因bcCR、gapB和yfjB可以大大改善宿主菌E.coliBL21(DE3)的生長狀況，延緩重組菌進入生長穩(wěn)定期的速度，且重組基因的表達對工程菌的影響無明顯差異，這有助重組大腸桿菌用于全細胞催化不對稱合成手性醇。

圖4 重組大腸桿菌的生長

2.3 通過NADP+-GAPDH和NADK代謝調(diào)控胞內(nèi)NADPH的合成

利用雙基因串聯(lián)載體將Bacillussubtilis(strain 168)中的NADP+-GAPDH在大腸桿菌中進行表達，引入糖酵解“旁路”以提高NADPH的內(nèi)源性供給，相應檢測結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，相比E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-bcCR，在表達gapB基因的工程菌中，NADP+-GAPDH的比活提高了1.63倍，這與利用谷氨酸棒桿菌中的NADP+-GAPDH來強化NADPH合成能力的效果[18]相近，優(yōu)于利用葡萄糖脫氫酶合成NADPH[19]，這證實了調(diào)控EMP途徑較PPP途徑更有利于NADPH的內(nèi)源性再生，而經(jīng)共表達gapB和yfjB基因的工程菌E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-gapB-bcCR&pET-28a-yfjB胞內(nèi)的NADP+-GAPDH比活提高了2.19倍，其NADPH再生能力分別是Martínez等[12]和Bommareddy等[20]所報道的僅利用NADP+-GAPDH強化NADPH供應時相應值的1.69和1.67倍，這表明NADK的過表達可以有效提高NADP+-GAPDH的轉(zhuǎn)化效率，調(diào)控胞內(nèi)NAD+代謝過程促進了NADP+的合成，為NADP+-GAPDH催化再生輔酶NADPH提供了足夠的氧化型底物。

圖5 BcCR、NADP+-GAPDH、NADK的比活測定

2.4 共表達體系在全細胞催化不對稱還原COBE中的應用

選用COBE作為β-酮酯類化合物的模型底物，以(R)-CHBE和e.e.為評價指標測定共表達體系的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-gapB-bcCR合成目標手性醇的產(chǎn)率是對照菌E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-bcCR相應值的1.38倍，其催化能力明顯強于Ma等[7]所報道的野生型酵母細胞，是Ye等[19]所報道的不對稱還原COBE轉(zhuǎn)化效率的1.33倍。通過調(diào)控EMP強化NADPH內(nèi)源性供給后，β-羥基酯的合成效率是利用葡萄糖脫氫酶(GDH)再生體系時相應值[21]的2.13倍，這進一步表明，與調(diào)控PPP途徑中的GDH相比，調(diào)控EMP中的NADP+- GAPDH再生輔酶NADPH更能有效改善微生物細胞的催化效率。經(jīng)NADP+- GAPDH和NADK共表達的工程菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-bcCR&pET28a-yfjB的催化效率相比對照菌相應值提高了1.69倍，(R)-CHBE產(chǎn)率高達98.18%，e.e.值超過99%，是朱清禾等[17]所獲手性醇產(chǎn)率的3.27倍，而Zhang等[22]利用全細胞催化不對稱合成(R)-CHBE的產(chǎn)率僅為89%，Houng等[23]全細胞催化雙相體系還原COBE所獲手性醇產(chǎn)率僅為74.5%，這表明在大腸桿菌中調(diào)控EMP和引入NAD激酶，可有效強化輔酶NADPH的內(nèi)源性合成，提高β-酮酯類化合物的轉(zhuǎn)化效率，有助于β-羥基酯類手性醇的高效合成。

圖6 產(chǎn)率與對映體過量值

3 結(jié)語

本研究通過雙基因串聯(lián)表達載體和雙質(zhì)粒共表達體系構(gòu)建羰基還原酶和輔酶NADPH再生偶聯(lián)系統(tǒng)，定向改造大腸桿菌細胞內(nèi)的EMP途徑調(diào)控輔酶NADPH的內(nèi)源性合成，構(gòu)建了高效合成β-羥基酯類手性醇的工程菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-bcCR&pET28a-yfjB。該重組菌在不額外添加昂貴輔酶NADPH的前提下實現(xiàn)了β-羥基酯的高產(chǎn)、高立體選擇性合成。以4-氯乙酰乙酸乙酯為模型底物，改造后的工程菌不對稱合成(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的產(chǎn)率高達98.18%，對映體過量值超過99%，且其胞內(nèi)輔酶NADPH合成能力相比E.coliBL21(DE3)/pETDueT-1-bcCR提高了2.19倍，這為β-羥基酯類手性醇合成提供了建設性和可行性方案。