李勝男， 程 賢， 畢良武*， 曾維星， 陳玉湘， 趙振東

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)是樟科樟屬樹種，主要分布在我國的廣東、廣西等省區(qū)[1]。肉桂的化學(xué)成分包括多糖類化合物、倍半萜、二萜及糖苷類化合物、黃酮類化合物等，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、加強(qiáng)消化功能以及鎮(zhèn)痛等作用[2-4]。相關(guān)研究表明肉桂精油具有很好的抗氧化活性，肉桂水提液中的非揮發(fā)性成分也具有抗氧化活性[5-6]。郭占京等[7]研究肉桂水提液對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦、心、肝、腎組織中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的影響，結(jié)果表明：肉桂水提液可以保護(hù)腦缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。黃宏妙等[8]研究肉桂水提液對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明：肉桂水提液能降低大鼠腦組織中的MDA，增加SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)的活性。肉桂水提物的主要化學(xué)成分有多糖和多酚，多糖作為保健食物，具有抗缺氧、增強(qiáng)體質(zhì)、延緩衰老、抗疲勞等功能。植物多糖的種類不同，生理活性也不同，如降血脂、降血糖、降血清過氧化脂質(zhì)、抗血凝等[9]。目前關(guān)于肉桂多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有充分的實驗數(shù)據(jù)，并且缺乏肉桂多糖抗氧化方面的相關(guān)報道。本實驗主要就肉桂多糖的分級分離、結(jié)構(gòu)分析和抗氧化活性展開研究，以期為開發(fā)相關(guān)保健藥品或食品提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

肉桂水提物(CE)、二乙氨乙基(DEAE)纖維素DE-52離子交換樹脂、丙烯葡聚糖凝膠S-300、 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖，均為標(biāo)準(zhǔn)品；鹽酸、吡啶、乙酸酐、乙酸銨、硼氫化鈉、甲醇、冰乙酸、二甲基亞砜、重水(D2O)、氯仿、氫氧化鈉，均為市售分析純。DPPH自由基(DPPH·)清除能力試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、植物可溶性糖檢測試劑盒、蛋白定量測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。

Agilent PL-GPC50/Agilent 1260高效液相色譜(HPLC)儀；迷你離心機(jī)；XH-C渦旋混合器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；賽默飛世爾 THERMO(帶孵育器)Multiskan FC 全自動酶標(biāo)儀，北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限責(zé)任公司；冷凍干燥機(jī)；Bruker DRX400M 型核磁共振(NMR)儀，德國Bruker公司。

1.2 肉桂水提物的純化

1.2.1肉桂水提物(CE)除蛋白 參照文獻(xiàn)[10]并進(jìn)行稍微改進(jìn)，用蒸餾水將CE溶解，加入Sevage試劑(氯仿/正丁醇，體積比5 ∶1)，CE與Sevage試劑按體積比4 ∶1混合，振蕩20 min，然后離心，轉(zhuǎn)速為9 000 r/min，時間為10 min，吸取上層溶液，重復(fù)4次，冷凍干燥后，可得肉桂粗多糖。

1.2.2離子交換柱層析 參照文獻(xiàn)[11]，取肉桂粗多糖108 mg，充分溶解于1.5 mL蒸餾水中，上樣于DEAE纖維素DE-52離子交換樹脂層析柱中，柱體積為30 mL(φ1.2×30 cm)，依次用蒸餾水、 0.2、 0.4、 0.8、 1.2和2.0 mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，9 mL/管收集。

1.2.3葡聚糖凝膠柱層析 參照文獻(xiàn)[12]并進(jìn)行改進(jìn)，取1.2.2節(jié)分離得到的肉桂多糖組分，通過丙烯葡聚糖凝膠S-300層析柱，用蒸餾水洗脫，柱體積為150 mL(φ1.8×70 cm)，流速為0.4 mL/min，4.5 mL/管收集，濃縮，冷凍干燥，得到純化的肉桂多糖組分。

1.3 肉桂中性多糖的含量測定和結(jié)構(gòu)表征

1.3.1多糖和蛋白質(zhì)含量測定 對1.2.2節(jié)和1.2.3節(jié)收集到的樣品分別采用苯酚硫酸法檢測多糖含量并繪制層析曲線；采用植物可溶性糖檢測試劑盒和蛋白定量測試盒對1.2.3節(jié)中得到的純化肉桂多糖進(jìn)行總糖含量以及蛋白質(zhì)含量的測定。

1.3.2相對分子質(zhì)量(Mr)測定 采用凝膠滲透色譜(GPC)法，對純化肉桂多糖的重均相對分子質(zhì)量(Mw)進(jìn)行測定。色譜條件：流動相為NaNO3溶液，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量50 μL，運(yùn)行時間30 min，示差折光檢測器，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的保留時間和Mr各取自然對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算CNP的Mw。

1.3.3多糖的結(jié)構(gòu)表征 取CNP 4 mg置于10 mL的離心管中，加入1 mL鹽酸溶液(6 mol/L)，在70 ℃水浴中加熱30 min，冷卻，滴加氫氧化鈉溶液(200 g/L)至中性，加水至刻度(4 mL)的位置，混勻，過濾取濾液。參照文獻(xiàn)[13]，取甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖用蒸餾水配置成1 g/L的樣品，并取各單糖樣品、單糖混合物及濾液400 μL，加0.5 mol/L PMP甲醇溶液450 μL，0.3 mol/L氫氧化鈉450 μL，混合均勻，70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L鹽酸450 μL，混合均勻，加0.1 mol/L醋酸銨溶液稀釋至2 mL，加1 mL氯仿，充分振蕩，靜置分層，除去下層氯仿，用氯仿同法處理3次，用10 000 r/min的離心，取上清液，進(jìn)行高效液相色譜檢測。色譜柱條件為：柱溫箱為35 ℃，流速為1 mL/min，紫外檢測波長為245 nm，進(jìn)樣量為5 μL，流動相A為0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，B為色譜純乙腈，洗脫條件為0 min→10 min→50 min→60 min→70 min，流動相乙腈為15%→20%→25%→20%→15%。

參照文獻(xiàn)[14]，取5 mg肉桂中性多糖溶于1.5 mL DMSO中，超聲波處理30 min，待樣品溶解后，加入60 mg研磨成粉末的氫氧化鈉，超聲波處理30 min，之后向樣品中加入450 μL的碘甲烷，超聲波處理30 min，再加入450 μL碘甲烷[15-16]，超聲波處理30 min，加水5 mL終止甲基化，然后用等體積的氯仿萃取1次，之后用等量的水洗滌5次，最后用氮氣吹干留下的氯仿溶劑，吹干之后向其中加入1 mL的甲醇，繼續(xù)氮吹，重復(fù)3次，即可完成甲基化。向得到的甲基化產(chǎn)物中加入1.25 mL 6 mol/L鹽酸溶液，在70 ℃下水解30 min，冷卻、旋干，旋干溫度為45 ℃，然后再加入1 mL甲醇旋干。向得到的水解產(chǎn)物中加入2 mL新配置的25 g/L的硼氫化鈉室溫反應(yīng)2 h，期間數(shù)次振蕩，滴加乙酸中和，pH試紙檢驗，加入0.1 mL甲醇旋干。向獲得的還原產(chǎn)物中加入12 mL新配置的吡啶/乙酸酐(體積比1 ∶1)，100 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，旋干，然后加入甲醇4 mL(每次2 mL，重復(fù)2次)，旋干，最后加入2 mL二氯甲烷取出液體，離心，取上清液進(jìn)行GC-MS分析。

取50 mg肉桂中性多糖樣品放在核磁管中，以D2O為溶劑，振蕩后溶解完全，采用Bruker 400M核磁共振波譜儀進(jìn)行13C NMR和1H NMR分析。

1.4 肉桂中性多糖體外抗氧化活性

1.4.1清除DPPH·的能力 采用DPPH·清除能力試劑盒進(jìn)行肉桂中性多糖抗氧化能力的測定，此法根據(jù)DPPH·有單電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收，醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，呈現(xiàn)的顏色越淺，即吸光度越低，肉桂多糖清除自由基的能力越強(qiáng)。向0.4 mL不同質(zhì)量濃度(0.016、 0.030、 0.060、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000和2.000 g/L)的樣品溶液中分別加入0.6 mL DPPH·工作液，將混合物搖勻，室溫放置30 min，整個實驗過程均在避光處進(jìn)行，在517 nm處使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度的測定。實驗以維生素C(Vc)作為陽性對照，以蒸餾水作為空白對照，測定值為每份樣品3次平行試驗后的平均值，計算 DPPH·清除率(ηDPPH·)。

式中：A測定—樣品液與DPPH溶液混合后的吸光度；A對照—樣品液與蒸餾水混合后的吸光度；A空白—蒸餾水與DPPH溶液混合后的吸光度。

1.4.2清除ABTS自由基的能力 采用總抗氧化(T-AOC)測試盒進(jìn)行肉桂中性多糖總抗氧化能力的測定。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS自由基(ABTS+·)，在抗氧化物質(zhì)的存在下，ABTS+·的產(chǎn)生會被抑制，在405 nm測定ABTS+·的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。以Vc作為陽性對照，蒸餾水作為空白對照，測試樣品與對照樣品的質(zhì)量濃度分別為0.016、 0.030、 0.060、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000和2.000 g/L，按照測試盒實驗步驟要求進(jìn)行實驗，在405 nm處使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度的測定。測定值為每份樣品3次平行試驗后的平均值，計算ABTS+·清除率(ηABTS+·)。

式中：A′測定—樣品液與ABTS+·工作液混合后的吸光度；A′空白—蒸餾水與ABTS+·工作液混合后的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂水提物純化結(jié)果分析

對除蛋白后的CE進(jìn)行兩步分離純化，DEAE纖維素DE-52離子交換柱層析曲線見圖1(a)。其中，0～9管為蒸餾水洗脫，10～18管為0.2 mol/L NaCl溶液洗脫，19～27管為0.4 mol/L NaCl溶液洗脫，28～36管為0.8 mol/L NaCl溶液洗脫，合并收集第6～8管得到CP-1，收集第13管得到CP-2，其余峰由于紫外吸收較低，故忽略不計。CP-1由蒸餾水洗脫獲得，不帶電荷，所以初步判定CP-1為中性多糖，CP-2由0.2 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，帶有少量負(fù)電荷，初步判定為酸性多糖。由于CP-1含量較高，故以CP-1為研究對象。CP-1經(jīng)丙烯葡聚糖凝膠柱S-300進(jìn)一步分離，洗脫結(jié)果如圖1(b)所示。圖中存在一個洗脫峰，并且峰型對稱良好，將其冷凍干燥，得到純化的肉桂中性多糖(CNP)，試劑盒檢測結(jié)果表明：CNP的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.38%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.30%。

圖1 肉桂多糖的離子交換柱層析(a)和肉桂中性多糖的凝膠柱層析(b)曲線Fig.1 Ion exchange chromatography curve of cinnamon polysaccharide(a) and GPC curve of CNP(b)

2.2 多糖的相對分子質(zhì)量及單糖組成分析

2.2.1相對分子質(zhì)量(Mr)測定 影響天然多糖活性的重要特征數(shù)據(jù)是Mr，在GPC法測定多糖Mr的結(jié)果中，CNP的聚合物分散指數(shù)(PDI)為1.585，故Mr分布較均勻，重均相對分子質(zhì)量(Mw)為3 630，可以歸屬為小分子多糖。

2.2.2多糖的結(jié)構(gòu)表征 選取單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和CNP進(jìn)行PMP衍生化，HPLC分析單糖組分。如圖2所示，衍生試劑PMP最先出峰，對其他單糖檢測結(jié)果無明顯干擾，5種單糖的衍生物在60 min內(nèi)實現(xiàn)良好的分離。對比CNP樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液色譜峰的保留時間，結(jié)果顯示D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和D-巖藻糖的出峰時間分別為16.341、 28.749、 30.156、 32.608和36.251 min，而CNP只有一個單峰，出峰時間為29.413 min，因此可以推斷肉桂多糖的單糖組成為葡萄糖，屬于均一性多糖。

1.甘露糖mannose; 2.葡萄糖glucose; 3.半乳糖galactose; 4.木糖xylose; 5.巖藻糖fucose

甲基化反應(yīng)后，CNP經(jīng)過水解、還原、乙?；玫讲糠旨谆奶谴家阴ｕパ苌?PMAA)，然后進(jìn)行GC/MS分析，通過對GC峰的質(zhì)譜進(jìn)行解析，即可知道糖苷鍵的連接方式。以→4)Glu(1→的連接方式為例，解釋并說明PMAA的電離規(guī)律和圖譜解析(圖3)。

圖3 →4)Glu(1→的PMAA的電離情況(a)及質(zhì)譜圖(b)Fig.3 Ionization(a) and mass spectrum(b) of PMAA of →4)Glu(1→

→4)Glu(1→的PMAA為1，4，5-Ac3-2，3，6-Me3-Glu，Mr為350。根據(jù)文獻(xiàn)[13]所述，兩個甲基化的碳原子之間最易斷裂，如C2和C3或C4和C5之間易發(fā)生斷裂，所以m/z117、m/z233的豐度較高(圖3(a))，之后初級離子片段繼續(xù)電離；如初級離子m/z233、m/z117脫落CHOH(m/z30)產(chǎn)生m/z203、m/z87的次級離子，次級離子(m/z203)繼續(xù)電離除去CH2CO(m/z42)，得到m/z161。綜上所述，1，4-

Ac2-2，3，6-Me3-Glu在質(zhì)譜m/z203、 87、 161均有的離子豐度。圖3(b)質(zhì)譜圖中m/z87、 117、 161.1、 183、 233.1的分度較高，并且均為1，4-Ac2-2，3，6-Me3-Glu的特征峰，因此推斷CNP的甲基化產(chǎn)物包含1，4，5-Ac3-2，3，6-Me3-Glu，進(jìn)一步推斷CNP的碳鏈結(jié)構(gòu)中含有→4)Glu(1→。同理可推測單糖的其他連接方式，如表1所示。

表1 CNP的甲基化分析結(jié)果Table 1 Methylation result of CNP

如圖4(a)所示，在CNP的1H NMR譜中，δH5.333是葡萄糖的端基氫信號，可進(jìn)一步歸屬于Glu(1→的氫信號，與甲基化分析結(jié)果一致，同時表明肉桂多糖中末端鏈接的葡萄糖以α構(gòu)型為主。δH3.857～3.904，J=18.8，可以歸屬于→4)Glu(1→和→6)Glu(1→的氫信號，與甲基化分析結(jié)果相吻合，同時表明肉桂多糖中主鏈連接的葡萄糖以β構(gòu)型為主。在CNP的13C NMR譜中，δC99.42可歸屬于Glu(1→的碳信號，δC71.00～73.13可歸屬于→6)Glu(1→的碳信號，與甲基化的分析結(jié)果一致。

圖4 CNP的1H NMR(a)和13C NMR(b)譜Fig.4 1H NMR(a) and 13C NMR(b) spectra of CNP

2.3 肉桂多糖體外抗氧化活性分析

2.3.1對DPPH·的清除效果 由圖5(a)可知，0.016～2 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Vc、CNP和CE均是隨著質(zhì)量濃度的增加，抗氧化活性逐漸增加。

由于Vc抗氧化活性很強(qiáng)，故很快達(dá)到抗氧化活性最高值，CNP雖然在低濃度下，抗氧化活性不及Vc，但當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 g/L時對DPPH·的消除率與Vc相當(dāng)，約為84%，而CE的抗氧化活性明顯低于CNP。

2.3.2對ABTS+·的清除效果 由圖 5(b)可知，在0.016～2 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Vc、CNP和CE均是隨著質(zhì)量濃度的增加，抗氧化活性逐漸增加。由于Vc的抗氧化活性較強(qiáng)，故在0.25 g/L時達(dá)到最高值91.5%，而CNP在同濃度下對ABTS+·清除率僅為6.4%，但是隨著濃度的升高，CNP的抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 g/L時，CNP對ABTS+·清除率可達(dá)到60%，明顯高于同濃度的CE。

a.DPPH·; b.ABTS+·圖5 肉桂中性多糖體外抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of cinnamon neutral polysaccharides in vitro

3 結(jié) 論

3.1肉桂水提物(CE)經(jīng)DEAE纖維素DE-52離子交換柱層析分離，可得到兩種多糖CP-1和CP-2，利用葡聚糖凝膠S-300對CP-1進(jìn)行分級分離得到純化的肉桂中性多糖(CNP)，CNP的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.38%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.03%。

3.2CNP的重均相對分子質(zhì)量為3 630，并且PDI值較小(1.585)，說明肉桂中性多糖的純度較高。通過PMP衍生法衍生得到的單糖主要為葡萄糖，通過甲基化法測得，單糖之間的連接方式主要為→4)Glu(1→、Glu(1→以及→6)Glu(1→。

3.3CNP具有較好的抗氧化活性，在低濃度時，CNP的抗氧化能力不如Vc。但當(dāng)質(zhì)量濃度為2 g/L時， CNP清除DPPH·的能力與Vc相近，可達(dá)到84%，對ABTS+·的清除率達(dá)到60%，略弱于Vc。