成 江， 謝普軍， 黃立新*， 張彩虹， 劉璐婕

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

近年來，三唑環(huán)被發(fā)現(xiàn)是藥物中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基團(tuán)[1]，廣泛存在于各種藥物、天然產(chǎn)物和生物活性化合物中。其中，含脂肪鏈的三唑衍生物也被發(fā)現(xiàn)具有良好的生物活性[2-3]。Ahmad等[4]合成了長鏈取代的1,2,4-三唑-3-硫酮衍生物，抗癌活性結(jié)果表明：所有測試的化合物對肝癌細(xì)胞的抑制活性顯著，其對Hep3 B細(xì)胞的最強(qiáng)半數(shù)抑制濃度(IC50)為7.4 μmol/L，可以在不損害正常細(xì)胞的情況下對癌癥進(jìn)行治療。Sharma等[5]合成了一系列具有脂肪鏈的新型三唑，并在體外評價其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑制活性，結(jié)果表明：部分化合物對所測試的細(xì)菌菌株的生長表現(xiàn)出顯著的抑制活性，且所有化合物對白色念珠菌也表現(xiàn)出較好的抑制作用(抑制圈直徑范圍為17.2～19.03 mm)。隨著新藥開發(fā)需求的不斷提高，以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)來設(shè)計新型的生物活性制劑成為研究的熱點。α-桐酸是具有3個不飽和共軛結(jié)構(gòu)的十八碳烯酸，是一種大量存在于種子油中的天然產(chǎn)物。在從10種苦瓜種子中提取的油中，α-桐酸占其總脂肪酸的30%～60%[6]。而在桐油中，α-桐酸占其總脂肪酸的77%～82%[7-8]。α-桐酸已被證明具有多種生物活性，如抗炎和調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝[9-10]，還可以通過促進(jìn)膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來選擇性地抑制腫瘤[11]。為了尋求具有潛在生物活性的脂肪鏈三唑類化合物，本研究以α-桐酸為原料合成一系列N-(α-桐酸?；?三唑類化合物，并對其抗菌和抗腫瘤活性進(jìn)行評價，以期為α-桐酸的高值化利用提供參考。

1 實 驗

1.1 材料、試劑和儀器

α-桐酸(純度98%)，自制[12]。草酰氯、三乙胺、二氯甲烷、 3,5-二溴-1,2,4-三氮唑、 1,2,4-三氮唑、 3-巰基-1,2,4-三氮唑、 3-硝基-1,2,4-三氮唑、苯駢三氮唑、 3-氨基-1,2,4-三氮唑、 4-氨基-1,2,4-三氮唑，均為市售分析純。金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans), 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所；人肝癌細(xì)胞(Hep G2)、人直腸癌細(xì)胞(DLD-1)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，由江蘇凱基生物技術(shù)有限公司提供。Nicolet iS10 型紅外光譜(FT-IR)儀，美國 Thermo公司；Avance III型核磁共振(NMR)儀，瑞士Bruker公司；Q Exactive型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)儀，美國Thermo公司。

1.2 α-桐酸酰胺類化合物的合成

1.2.1合成路線 N-(α-桐酸?；?三唑類化合物的合成路線如圖 1 所示。

圖1 N-(α-桐酸?；?三唑類化合物的合成路線Fig.1 The synthetic route of N-(α-eleostearic acyl) triazole derivatives

1.2.2α-桐酸酰氯(2)的制備 稱取56 g自制的α-桐酸(1)溶于50 mL二氯甲烷中，加入到150 mL燒瓶中并充入氮氣保護(hù)；在冰浴條件下，取30 mL質(zhì)量濃度為1 g/mL的草酰氯的二氯甲烷溶液緩慢滴加到燒瓶中。室溫反應(yīng)3 h后，減壓蒸除溶劑和多余的草酰氯，得到黃色液體即為α-桐酸酰氯(2)，置于冰箱中備用。

1.2.3化合物3a～3g的制備 參考文獻(xiàn)[3]方法，稱取一定量的三乙胺和三唑置于50 mL的燒瓶中，加入二氯甲烷攪拌混合均勻。在冰浴條件下，往燒瓶中緩慢滴加α-桐酸酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌，薄層色譜(TLC)跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后用飽和碳酸氫鈉溶液和蒸餾水洗滌至中性，收集有機(jī)相。減壓蒸餾后得到的粗產(chǎn)品通過硅膠柱層析，分離得到N-(α-桐酸酰基)三唑類化合物3a～3g。

1.3 生物活性實驗

1.3.1抗腫瘤活性 用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定N-(α-桐酸酰基)三唑類化合物對于癌細(xì)胞的抑制能力[13]。首先，使用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化收集對數(shù)生長期的人腫瘤細(xì)胞。用緩沖鹽水洗滌后，與10%胎牛血清(FBS)、緩沖溶液混合，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、 5%CO2飽和濕度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后，將細(xì)胞計數(shù)后，接種到96孔板中，每孔約3×104個細(xì)胞。藥品濃度的選擇參照文獻(xiàn)中的方法[4,14]，配制濃度為20和200 μmol/L的α-桐酸酰胺衍生物的二甲亞砜(DMSO)溶液。之后，把配制好的溶液分別加入到接種好細(xì)胞的96孔板中，處理72 h。按照同樣的濃度處理5-氟尿嘧啶(5-Fu)作陽性對照，僅加入相同體積的培養(yǎng)基作陰性對照，每個化合物和對照組均設(shè)置5個復(fù)孔。處理后，將MTT(0.5 g/L)加入培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞在37 ℃下、 5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h，棄去上清液，按150 μL/孔加入DMSO，輕微振搖若干分鐘，使結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm處測量溶液的光密度(OD)值，化合物對癌細(xì)胞的抑制率按式(1)計算：

(1)

式中：η—抑制率，%；NOD—陰性對照組OD值；EOD—實驗組OD值。

1.3.2抑菌活性 參考Maneedaeng等[15]的方法進(jìn)行抑菌實驗。配制Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水(PDB)培養(yǎng)基各500 mL，高壓滅菌。在裝有100 mL肉湯的錐形瓶中，分別接種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，在裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種白色念珠菌，在37 ℃下孵育24 h。孵育后，將培養(yǎng)液的懸浮液用無菌水調(diào)節(jié)至菌液濃度為108CFU/mL。在96孔板的第一個孔中加入溶于DMSO的N-(α-桐酸?；?三唑類化合物，質(zhì)量濃度為500 mg/L。之后的各孔均稀釋為前一孔濃度的一半，各孔的質(zhì)量濃度范圍為0.977～500 mg/L。同時，設(shè)置陰性對照組和陽性對照組，陽性對照組中加入等量的氨芐青霉素鈉和5-氟胞嘧啶，陰性對照組中加入等量的對應(yīng)溶劑。然后，在每個孔中加入75 μL先前制備的細(xì)菌懸液，并將板在37 ℃下孵育24 h。用酶標(biāo)儀在600 nm處測量各孔的OD值，實驗中每組設(shè)置5個平行，化合物對菌的抑制率按式(1)計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-桐酸酰胺類化合物合成與結(jié)構(gòu)鑒定

2.2 化合物3a～3g的生物活性

2.2.1抗腫瘤活性 將所有合成的化合物3a～3g對照人肝癌細(xì)胞(Hep G2)、人直腸癌細(xì)胞(DLD-1)和人乳腺癌(MCF-7)進(jìn)行篩選，并將5-氟尿嘧啶(5-Fu)用作標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。所有合成化合物在濃度為200和20 μmol/L時抑制癌細(xì)胞的結(jié)果如表1所示。

表1 不同濃度的化合物3a～3g對人體癌細(xì)胞的抑制率Table 1 Inhibition rates of different concentrations of compounds 3a-3g on human cancer cells

由表1可知，當(dāng)化合物濃度為20 μmol/L時，大多數(shù)測試的化合物顯示出對癌細(xì)胞的低細(xì)胞毒性作用，抗腫瘤效果不明顯。僅有3d在20 μmol/L濃度下顯示出對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7較高的抑制作用。當(dāng)濃度為200 μmol/L時，化合物3a、3d和3e對癌細(xì)胞均有一定的抑制效果，其中，化合物3a和3e對3種癌細(xì)胞均有顯著的抑制作用，抑制率均超過80%。化合物3d對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有很強(qiáng)的抑制活性，抑制率達(dá)到了92.83%，與陽性對照5-Fu的抑制效果相當(dāng)。從化合物3a～3g對不同癌細(xì)胞的抑制效果可以看出，不同結(jié)構(gòu)的取代基對化合物的抗腫瘤活性也有影響，在三唑環(huán)上引入鹵素和苯環(huán)使得化合物3a和3e對所有3種癌細(xì)胞的抑制活性增加。隨著化合物中三唑環(huán)上取代基種類的不同，化合物對于人乳腺癌MCF-7的抑制作用也有所差異。其中，三唑環(huán)上硝基取代的化合物3d對于乳腺癌MCF-7 的抑制作用最顯著。而對于人直腸癌DLD-1和肝癌Hep G2，最理想的是含有苯環(huán)的三唑(3e)。

根據(jù)表1中不同濃度的化合物3a～3g對人體癌細(xì)胞的抑制效果，選取抗腫瘤活性較好的化合物3a、3d和3e采用1.3.1節(jié)方法，測定其半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，對人體腫瘤細(xì)胞Hep G2、DLD-1和MCF-7而言，化合物3a較3e的抗腫瘤活性更好，其IC50分別為112.76、 101.22和97.99 μmol/L?；衔?d對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的IC50為25.12 μmol/L，抑制效果強(qiáng)于陽性對照物5-Fu，具有作為藥物開發(fā)的潛力。

表2 化合物3a、 3d和3e對人癌細(xì)胞的IC50Table 2 IC50 of compounds 3a, 3d and 3e on human cancer cells

2.2.2抑菌活性 將所有合成的化合物3a～3g對2種細(xì)菌菌株(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)和1種真菌菌株(白色念球菌)進(jìn)行了抗菌活性檢測，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，化合物3a～3g對白色念珠菌均有抑制作用，但大多數(shù)化合物無法抑制2種細(xì)菌的生長。化合物3e顯示出較好的抗細(xì)菌活性，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的IC50分別為148.2和457.83 mg/L，而其他化合物對這2種細(xì)菌的IC50均大于500 mg/L。此外，化合物3e顯示出優(yōu)異的抗白色念珠菌活性，其對白色念珠菌的IC50為22.69 mg/L，與陽性對照5-氟胞嘧啶的抗菌效果相近。從構(gòu)效關(guān)系的角度來看，3e和其他化合物之間的主要結(jié)構(gòu)差異是含有苯環(huán)。有研究指出[16]，化合物含有的供電子或吸電子基團(tuán)能夠影響微生物生物膜的形成，從而提高化合物的抗微生物活性?；衔?e中三唑環(huán)受到苯環(huán)的影響，整體的電子云密度發(fā)生了變化，可能對目標(biāo)化合物抗菌作用起到了積極作用。

表3 化合物3a～3g對微生物的抑制效果(24 h)Table 3 The inhibitory effect of compound 3a-3g on microorganism(24 h)

3 結(jié) 論

3.1以α-桐酸為原料，制備得到7個新型的N-(α-桐酸?；?三唑類化合物：N-(α-桐酸?；?-3,5-二溴-1,2,4-三唑(3a)、N-(α-桐酸?；?-1,2,4-三唑(3b)、N-(α-桐酸?；?-3-巰基-1,2,4-三唑(3c)、N-(α-桐酸?；?-5-硝基-1,2,4-三唑(3d)、N-(α-桐酸?；?-1,2,3苯駢三唑(3e)、 3-α-桐酸酰基-1,2,4-三唑(3f)、 4-α-桐酸酰基-1,2,4-三唑(3g)。采用FT-IR、1H NMR、13C NMR和MS等方法對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。

3.2探討了7種N-(α-桐酸?；?三唑類化合物的抑菌及抗腫瘤活性，結(jié)果表明：化合物3a和3e對人肝癌細(xì)胞(Hep G2)、人直腸癌細(xì)胞(DLD-1)和人乳腺癌(MCF-7)均有較好的抑制效果。其中，化合物3d對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有很強(qiáng)的抑制活性，抑制率達(dá)到了92.83%，半數(shù)抑制濃度(IC50)為25.12 μmol/L，抑制效果強(qiáng)于陽性對照物5-氟尿嘧啶(5-Fu)，具有作為藥物開發(fā)的潛力。所有化合物對白色念珠菌的抑制效果良好，化合物3e顯示出優(yōu)異的抗白色念珠菌活性，其IC50達(dá)到22.69 mg/L，與陽性對照的抗菌效果相近。這些結(jié)果對后續(xù)α-桐酸衍生物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與改造研究具有指導(dǎo)意義。