代廣春，李滎娟，劉俊延，芮云峰

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 創(chuàng)傷中心，江蘇 南京 210009； 4.東南大學(xué) 骨科研究所，江蘇 南京 210009； 5.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 老年科，江蘇 南京 210009)

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 大鼠TDSCs的分離和培養(yǎng)

1.3 干細(xì)胞標(biāo)志物檢測

1.4 成骨分化能力檢測

1.5 成脂分化能力檢測

1.6 成軟骨分化能力檢測

1.7 肌腱標(biāo)志物檢測

將不同組TDSCs以5×103cm-2的密度接種，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞mRNA，qRT- PCR檢測肌腱標(biāo)志物Col1、SCX和TNMD，同時(shí)用細(xì)胞免疫熒光檢測Col1和TNMD蛋白表達(dá)變化。

1.8 qR PCR

表1 目的基因引物序列、產(chǎn)物長度和退火溫度Tab 1 Primer sequences, product size and annealing temperature of target genes

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

P0代時(shí)，兩組均可見大的多邊形和星形細(xì)胞形態(tài)。P3代時(shí)，兩組均可見均一的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。見圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×40)Fig 1 Cell morphology observation(×40)

2.2 干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)

兩組TDSCs均有干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白，包括Nanog、Oct4和Sox2的表達(dá)，主要位于胞核中。同時(shí)，這些標(biāo)志物表達(dá)強(qiáng)度的半定量分析表明，兩組TDSCs的蛋白表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平Fig 2 Expression levels of stemnes related markers

2.3 成骨分化能力

茜素紅染色顯示普通培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSCs的細(xì)胞外基質(zhì)中均未見礦化物質(zhì)(圖3A、B)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSC的細(xì)胞外基質(zhì)中均可見大量礦化物質(zhì)出現(xiàn)(圖3C、D)。與普通培養(yǎng)基相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下TDSCs的細(xì)胞外基質(zhì)的礦化物質(zhì)明顯更多。半定量結(jié)果顯示4組吸光度值(OD)之間存在明顯差異(F=83.926,P<0.001)；兩兩比較顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSCs的OD均高于普通組(P<0.05)，但是兩組TDSCs的OD在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基之間均無差異(P>0.05)(圖3E)。

A～D.茜素紅染色結(jié)果；E.半定量檢測OD；F.成骨分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)值圖3 成骨分化能力比較(×40)Fig 3 Comparison of osteogenic differentiation ability(×40)

4組TDSC中Runx2(F=8.978,P=0.006)、OPN(F=183.387,P<0.001)和OCN(F=55.855,P<0.001)的mRNA表達(dá)值之間均存在明顯差異；兩兩比較顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSC中Runx2、OPN和OCN的mRNA表達(dá)顯著高于普通培養(yǎng)基(P<0.05)，但是兩組TDSCs中Runx2、OPN和OCN的mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基之間均無差異(P>0.05)(圖3F)。

2.4 成脂分化能力

油紅O染色顯示普通培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSCs的細(xì)胞外基質(zhì)中均未見油紅O陽性脂滴(圖4A、B)，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSCs的細(xì)胞外基質(zhì)中均可見大量油紅O陽性脂滴(圖4C- F)。與普通培養(yǎng)基相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下TDSCs的細(xì)胞外基質(zhì)的油紅O陽性脂滴明顯更多。半定量結(jié)果4組OD之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.199,P<0.001)；兩兩比較顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSCs的OD值均高于普通組(P<0.05)，但是兩組TDSCs的OD值在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基之間均無差異(P>0.05)(圖4G)。

A～F.油紅O染色結(jié)果；G.半定量檢測OD；H.成脂分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)值圖4 成脂分化能力比較(×40)Fig 4 Comparison of adipogenic differentiation ability(×40)

4組TDSC中C/EBPα(F=31.106,P<0.001)和PPARγ2(F=61.929,P<0.001)的mRNA表達(dá)值之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSC中C/EBPα和PPARγ2的mRNA表達(dá)顯著高于普通培養(yǎng)基(P<0.05),但是兩組TDSCs中C/EBPα和PPARγ2的mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基之間均無差異(P>0.05)(圖4H)。

2.5 軟骨分化潛力

兩組TDSCs的阿利新藍(lán)染色顯示，均可觀察到軟骨樣細(xì)胞的存在和酸性黏多糖(藍(lán)色)的形成(圖5A、B)。

A、B.阿利新藍(lán)染色結(jié)果；C.成軟骨分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)值圖5 成軟骨分化能力比較Fig 5 Comparison of chondrogenic differentiation ability

4組TDSCs中Col2α1(F=36.318,P<0.001)、Aggrecan(F=67.608,P<0.001)和Sox9(F=74.030,P<0.001)的mRNA表達(dá)值之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下兩組TDSC中Col2α1、Aggrecan和Sox9的mRNA表達(dá)顯著高于普通培養(yǎng)基(P<0.05)，但是兩組TDSCs中Col2α1、Aggrecan和Sox9的mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基之間均無差異(P>0.05)(圖5C)。

2.6 肌腱相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)

A.qR PCR檢測肌腱相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)；B～E.細(xì)胞免疫熒光檢測標(biāo)志物蛋白表達(dá)圖6 肌腱相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平Fig 6 Expression levels of tendo related markers

3 討 論

近年來，TDSCs已先后在小鼠、人[11]、大鼠[12]和兔子[15]等肌腱組織中被分離和鑒定出，這些干細(xì)胞被證實(shí)對(duì)肌腱損傷的修復(fù)、愈合和再生具有非常重要的作用。本研究探討深低溫冷凍處理對(duì)TDSCs的干性和多向分化能力的影響，結(jié)果顯示深低溫冷凍處理的肌腱組織中可成功分離出有活性的TDSCs，且TDSCs的干性和多向分化能力在冷凍前后未受影響。

成年哺乳動(dòng)物干細(xì)胞以沉默狀態(tài)和活躍狀態(tài)存在于組織中，并在維持組織代謝平衡和參與組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用[16]。肌腱損傷后，肌腱愈合過程中通常會(huì)發(fā)生TDSCs被激活從而分化為肌腱細(xì)胞來促進(jìn)組織修復(fù)[15]。TDSCs的增殖、克隆形成和多向分化能力對(duì)于損傷的修復(fù)至關(guān)重要[17]。增殖和克隆形成能力常與修復(fù)的速率息息相關(guān)[18]。我們前期的研究[14]表明,TDSCs的增殖和克隆形成能力在冷凍前后沒有明顯改變。在人的冷凍脂肪組織同樣發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)間質(zhì)血管細(xì)胞的增殖能力仍良好保持著[19]。Nanog、Oct4和Sox2常與干細(xì)胞的多能性和自我更新有關(guān)，是未分化狀態(tài)和未分化細(xì)胞的重要指標(biāo)[18,20]。因此，本研究選擇這3個(gè)指標(biāo)為TDSCs的干性指標(biāo)。在人的冷凍睪丸組織可觀察到有活性的精原干細(xì)胞，且細(xì)胞干性標(biāo)志物能正常表達(dá)[21]。在人的冷凍牙濾泡組織可分離出牙髓干細(xì)胞，且與未處理組細(xì)胞保持相似的多向分化能力[22]。本研究結(jié)果顯示TDSCs保留了干性和多向分化能力，說明在利用同種異體移植肌腱修復(fù)肌腱缺損時(shí)，存活的TDSCs可以作為細(xì)胞池進(jìn)而為肌腱細(xì)胞提供源源不斷的來源，很好地促進(jìn)組織的修復(fù)。

對(duì)肌腱組織損傷后愈合機(jī)制的進(jìn)一步了解將有助于在治療過程中制定更有效的策略。同樣，該概念還可以應(yīng)用于其他肌腱和韌帶模型中，包括前交叉韌帶、跟腱和“肩袖”肌腱等，此類組織經(jīng)深低溫冷凍處理后是否存在有活性的干細(xì)胞值得進(jìn)一步探究。同時(shí)，這樣的技術(shù)還可以應(yīng)用到包括關(guān)節(jié)軟骨和半月板等其他組織模型中，后續(xù)值得探究。

本研究也存在局限性，例如沒有體內(nèi)試驗(yàn)、參與研究的樣本量有限、冷凍時(shí)間較短等因素。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可擴(kuò)大樣本量、延長冷凍時(shí)間和進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；同時(shí)，還可研究深低溫冷凍保存同種異體組織的免疫原性、組織學(xué)和生物力學(xué)變化以及臨床應(yīng)用效果。