張岐 安斌芳 王立霞 鄭雨桐 王佳 郭曉晴

摘 要：利用山梨酸鉀與雙氧水-硫酸溶液反應(yīng)后形成丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸生成紅色化合物三甲川（3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮）的原理，以顯色的深淺與山梨酸鉀的含量在一定范圍內(nèi)成正比為基礎(chǔ)，嘗試開發(fā)乳酸菌制品山梨酸鉀快速檢測(cè)試劑盒。初步確定的試盒為塑料卡，試紙為硝酸纖維素膜;該試紙對(duì)標(biāo)準(zhǔn)山梨酸鉀水溶液的檢出限為1.0 g/L，對(duì)乳酸菌中山梨酸鉀的低檢出限也為1.0 g/L。該試劑盒具有體積小、便于攜帶、檢測(cè)方便和成本低廉等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞：山梨酸鉀;試劑盒;乳酸菌;快速檢測(cè)

Development of Test Paper Box for Rapid Detection of Potassium Sorbate

ZHANG Qi， AN Binfang， WANG Lixia*， ZHENG Yutong， WANG Jia， GUO Xiaoqing

（College of Medical Technology， Beihua University， Jilin 132013， China）

Abstract： The test based on the sorbic acid potassium react to the hydrogen peroxide oxidation， and form malondialdehyde， after that the malondialdehyde would combinate with glucosinolates barbituric acid （associates） and produce trimethine （3，5，5-trimethyloxazole trimethine （3，5，5-trimethyloxazole-2，4-dione） ，which is red compounds. Acording to the depth of the color? is proportional to the content of potassium sorbate within a certain range. The paper box for rapid detection of potassium sorbate of lactic acid? bacteria was developed. The preliminarily determined test box is plastic card and the test paper is nitrocellulose film. The detection limit of the paper for standard potassium sorbate aqueous solution is 1.0 g/L， and the detection limit of standard potassium sorbate solution in lactic acid bacteria is 1.0 g/L. The test paper box has the characteristics of small size， easy to carry， convenient detection and low cost， which has a wide range of application value and market development prospects.

Keywords： potassium sorbate; test kit; lactic acid bacteria; rapid detection

山梨酸鉀，又名2，4-己二烯酸鉀，是山梨酸的鉀鹽，分子式為C6H7O2K，白色至淺黃色鱗片狀結(jié)晶、晶體顆粒或晶體粉末，無(wú)臭或微有臭味，長(zhǎng)期暴露在空氣中易吸潮、被氧化分解而變色，易溶于水，溶于丙二醇和乙醇[1-2]。其常被用作防腐劑，通過(guò)與微生物酶系統(tǒng)的巰基結(jié)合從而破壞許多酶系統(tǒng)，毒性遠(yuǎn)低于其他防腐劑。山梨酸鉀含量一旦超標(biāo)且長(zhǎng)期被人們食用，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生傷害，在一定程度上抑制骨骼生長(zhǎng)，以及損傷肝和腎[3]。因此，在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等方面，山梨酸鉀含量的檢測(cè)具有極其重要的意義[4]。本文研制了乳酸菌中山梨酸鉀的檢測(cè)試劑盒，并研究了其制作工藝、最低檢測(cè)限、保存條件及時(shí)間等，該試劑盒具有快速檢測(cè)、反應(yīng)靈敏、攜帶方便及成本低廉等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀、2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric Acid，TBA）、氫氧化鈉（粒狀）、鹽酸、硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純;30%雙氧水;普通慢速定性濾紙、乙酸纖維素膜（Q/HSG 1-93）、硝酸纖維素膜（Startorius CN140）;PVC膠板（DB-8）、聚酯纖維素膜（MA0800）、玻璃纖維素膜（GL-b 01）、吸水墊（GRADE 270）、塑料卡（A-8）和銜接膠帶：市售?！皶骋嫘恰比樗峋L(fēng)味飲料：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-50X65-B-Ⅱ）;電子天平（沈陽(yáng)龍騰有限公司）;往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）;3個(gè)250 mL燒杯;一個(gè)50 mL容量瓶;一個(gè)100 mL容量瓶;膠頭滴管;玻璃棒;250 mL量筒;50 mL容量瓶;多個(gè)試管;3個(gè)空平板（15 cm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

利用山梨酸鉀與雙氧水-硫酸溶液氧化后形成丙二醛，然后丙二醛與硫代巴比妥酸（TBA）生成紅色化合物三川甲，通過(guò)顯色的深淺與山梨酸鉀的含量在一定范圍內(nèi)成正比為理論基礎(chǔ)，化學(xué)反應(yīng)式如下：

C6H7KO2+H2O2+H2SO4→C3H4O2+H2O+K2SO4

C3H4O2+TBA→三甲川（紅色化合物）

1.3.2 山梨酸鉀溶液的配制

稱取干燥的山梨酸鉀粉末0.250 g，加入蒸餾水50 mL，用50 mL容量瓶定容，配制出5.0 g/L的山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液。然后將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成6個(gè)等級(jí)的濃度梯度，配制成山梨酸鉀應(yīng)用液，濃度分別為5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L的山梨酸鉀水溶液。

1.3.3 乳酸菌中山梨酸鉀濃度梯度的配制

稱取干燥的山梨酸鉀粉末0.125 g、0.250 g、0.375 g、0.500 g和0.625 g分別加入6個(gè)5 mL乳酸菌飲料中，制備濃度分別為6.0 g/L、5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L和1.0 g/L的溶液。

1.3.4 顯色劑濃度的確定

稱取干燥的硫代巴比妥酸粉末4.00 g，用250 mL容量瓶定容，配制出16.0 g/L的硫代巴比妥酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后用標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成4.0 g/L、8.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液。不同濃度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸鉀溶液氧化之后分別加入4.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，確定顯色反應(yīng)的最佳顯色劑濃度。

1.3.5 試紙條的制備及紙型篩選

選擇普通慢速定性濾紙、乙酸纖維素膜、硝酸纖維素膜，將其裁剪成邊長(zhǎng)為8 cm正方形，用16.0 g/L硫代巴比妥酸中浸泡5～10 min，立即用鑷子取出置于恒溫箱（37 ℃）中干燥30 min，干燥結(jié)束后，觀察經(jīng)過(guò)硫代巴比妥酸浸泡的試紙條是否有變形和變色現(xiàn)象。若試紙條無(wú)變形和變色現(xiàn)象，將試紙的四邊統(tǒng)一裁剪成3 cm×0.5 cm規(guī)格的長(zhǎng)條，儲(chǔ)存于避光、干燥、密閉處，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將試紙條整齊地放置于平板上。然后滴加經(jīng)1% H2O2氧化后的不同濃度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸鉀溶液。觀察試紙的顯色情況，從顯色速度、顯色效果判斷顯色是否穩(wěn)定。

1.3.6 靈敏度檢測(cè)

用16 g/L的硫代巴比妥酸浸泡試紙條，然后分別與氧化之后的不同濃度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸鉀溶液進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)，得出最低的顯色濃度。

1.3.7 試紙條的保質(zhì)期

將部分試紙條裝入用黑色塑料袋密封的試管中，用橡膠塞塞緊放入冰箱（4 ℃），即模擬低溫、避光、隔氧的保存環(huán)境。部分不進(jìn)行任何處理，放置于抽屜中，即室溫、普通避光、干燥環(huán)境。每隔2 d取出幾片進(jìn)行檢測(cè)限和中等山梨酸鉀濃度的顯色實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在上午或下午固定時(shí)間進(jìn)行，盡量在相同光照強(qiáng)度下記錄和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色劑濃度的確定

隨著山梨酸鉀和TBA溶液濃度的增加，顯色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的試紙顯色效果最好，具體見圖1和表1。

在不同濃度TBA溶液試紙的顯色結(jié)果

2.2 試紙條的制備及篩選

試紙條是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素，其選擇需要滿足易吸附試劑且吸附量較大、干燥時(shí)間短、顯色速度快和顏色變化明顯等要求。本實(shí)驗(yàn)分別選用3種常見類型的試紙條，觀察顯色效果，確定最佳試紙條。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種試紙條，普通定性濾紙吸藥量少，顯色效果差;乙酸纖維素膜雖吸藥量較多，但顯色結(jié)果一般。只有硝酸纖維素膜的吸藥量大，吸藥均勻，浸藥干燥后形狀沒(méi)有變化，手感也無(wú)明顯的改變，可確定為最佳紙型。顯色結(jié)果表明，該類型試紙條顯色均勻，顯色速度快且顏色持續(xù)時(shí)間久，顯色后紙的變形程度小，適合做成產(chǎn)品（表2）。因此，選擇硝酸纖維素膜在乳酸菌中進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)。

2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

隨著山梨酸鉀濃度的增加，顯色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的試紙顯色效果最好，本試紙條的檢測(cè)范圍大于1.0 g/L，最低檢出限是1.0 g/L（圖1）。

用試紙法分別檢測(cè)乳酸菌中不同濃度梯度的山梨酸鉀溶液，結(jié)果表明，當(dāng)山梨酸鉀溶液的濃度低于1.0 g/L時(shí)，肉眼無(wú)法辨別試紙的顏色變化。隨著山梨酸鉀濃度增加，試紙顯色加深，當(dāng)山梨酸鉀溶液濃度達(dá)到3.0 g/L時(shí)，試紙顯色為深棕色。因此，試紙的最低限度1.0 g/L（圖2），此濃度等于乳酸菌中出現(xiàn)的山梨酸鉀濃度（1.0 g/L）[5]。

2.4 試紙條的保質(zhì)期

由表3可知，4 ℃避光保存條件下，40 d后部分試紙條開始發(fā)生顏色變化。室溫避光條件下（18～27 ℃，抽屜中），30 d后試紙條變紅。試紙條在低溫和室溫保存效果有明顯差別，低溫保存時(shí)間較長(zhǎng)，效果較好，保存過(guò)程中注意避光。

以硝酸纖維素膜（NC膜）為顯色區(qū)，玻璃纖維素膜為樣品墊（滴加檢測(cè)物：山梨酸鉀），聚酯纖維素膜為顯色劑墊（浸泡干燥后的TBA試紙），PVC膠板為底座，吸水墊為吸水濾紙加速樣品的流動(dòng)，見圖3和圖4。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速檢測(cè)山梨酸鉀濃度的試紙條法，對(duì)其制備工藝條件及配方進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用硝酸纖維素膜、質(zhì)量濃度為16.0 g/L的TBA溶液、浸泡時(shí)間5～10 min、干燥溫度37 ℃，制備的試紙具有良好的性能。試紙法檢測(cè)山梨酸鉀僅需5～10 min，檢測(cè)靈敏度為1 g/L，具有樣品量小、反應(yīng)靈敏、成本低廉、使用方便和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的山梨酸鉀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法相比，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，其檢測(cè)范圍較大，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，是一種快速半定量檢測(cè)方法，在食品、發(fā)酵、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等產(chǎn)業(yè)中有良好的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)

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