金艷梅，劉彩霞，秦珍珍，文云紅，李青

先天性心臟?。ㄏ刃牟。┦翘簳r(shí)期心臟及大血管發(fā)育異常所導(dǎo)致的心血管畸形，是最常見的人類出生缺陷和兒童非感染性疾病。臨床研究報(bào)道先心病的發(fā)生率為1%，而遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)心臟畸形的發(fā)生率為3%～5%，是造成新生兒及嬰幼兒死亡的主要原因[1-3]。輕微的先心病部分可以自愈，但復(fù)雜、重癥先心病經(jīng)常需要在出生后1 年內(nèi)甚至幾個(gè)月、幾天內(nèi)盡早干預(yù)，否則可能導(dǎo)致各種并發(fā)癥，包括腦發(fā)育遲緩、肺動(dòng)脈高壓、心律失常、慢性心力衰竭和心原性猝死等[4-6]。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，先心病的診斷、治療均取得了巨大進(jìn)步，但病因尚不明確，一些復(fù)雜先心病通常需要多次手術(shù)甚至心臟移植，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7-10]。因此，發(fā)現(xiàn)人類先心病可能的易感基因或致病基因，并從分子水平與細(xì)胞水平深入研究揭示先心病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)下一代的優(yōu)生優(yōu)育有著重要意義。

TBX20作為T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員之一，表達(dá)于心肌發(fā)育所需的多種細(xì)胞系，包括咽部?jī)?nèi)胚層、心臟祖細(xì)胞、心內(nèi)膜和心肌細(xì)胞，在心血管發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過(guò)DNA 測(cè)序擬在先心病患兒中尋找、發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，并通過(guò)同源建模、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)，對(duì)新發(fā)現(xiàn)的可能存在致病性的突變進(jìn)行功能分析，探究中國(guó)兒童先心病可能的分子發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集203 例在山西省兒童醫(yī)院心胸外科接受手術(shù)治療的漢族先心病患兒作為病例組，男性126 例，女性77 例，年齡0～12 歲。全部患兒均通過(guò)體格檢查、超聲心動(dòng)圖和心臟直視或介入手術(shù)確診為先心病，并排除心臟血管之外的其他畸形和遺傳代謝性疾病，如馬凡綜合征、手-心綜合征、Noonan 綜合征和DiGeorge 綜合征等。研究對(duì)象的疾病種類見表1。同時(shí)收集300 例經(jīng)超聲心動(dòng)圖確認(rèn)無(wú)先心病的健康兒童作為對(duì)照組，符合與患兒無(wú)血緣關(guān)系、性別匹配、無(wú)明顯遺傳和出生缺陷疾病等條件。該研究經(jīng)山西省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)IRBKY-2019-001）。

表1 病例組203 例先天性心臟病患兒的疾病種類分布

1.2 研究方法

1.2.1DNA 序列分析

兩組患兒均采集外周靜脈血，采用磁珠法提取白細(xì)胞中的基因組DNA，設(shè)計(jì)合成引物，采用PTC-200 型自動(dòng)擴(kuò)增儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）對(duì)病例組與對(duì)照組TBX20基因（GenBank 序列號(hào)NM_001077653）的外顯子及交界區(qū)內(nèi)含子序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后經(jīng)3700 DNA 測(cè)序儀（ABI 公司，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序分析，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）BLAST 程序?qū)y(cè)序結(jié)果對(duì)比分析，檢測(cè)TBX20基因突變。對(duì)檢測(cè)到突變患兒的家庭成員也進(jìn)行DNA 序列分析。

1.1.2同源建模

同源建模，又稱比較建模，是從已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)作為模板預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的方法。本研究從UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)查詢TBX20的氨基酸序列，選取人類TBX3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（PDB 數(shù)據(jù)庫(kù) ID：1H6F）為模板，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模服務(wù)器I-TASSER 建立TBX20同源模型，對(duì)TBX20野生型及突變后的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析比較。

1.1.3雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TBX20基因突變對(duì)下游靶基因心鈉素（ANF）啟動(dòng)子活性的影響

ANF對(duì)房室的形成具有特異性，是心臟發(fā)育的重要標(biāo)志物之一。在心臟發(fā)育過(guò)程中，T-box 轉(zhuǎn)錄因子TBX20需要與同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5、鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4協(xié)同激活下游包括ANF在內(nèi)的多個(gè)目標(biāo)基因[11-13]。分別檢測(cè)突變型與野生型TBX20協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2.5對(duì)調(diào)控ANF啟動(dòng)子活性的影響，以研究基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變后對(duì)功能的影響。具體方法如下：（1）將人類野生型TBX20、GATA4、NKX2.5基因全長(zhǎng)cDNA 序列分別插入到pcDNA3.1 載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1-TBX20、pcDNA3.1-GATA4、pcDNA3.1-NKX2.5。然后通過(guò)帶有突變位點(diǎn)序列的引物擴(kuò)增出在本病例組中篩查檢測(cè)到的突變位點(diǎn)c.187G＞A（A63T）的突變型TBX20基因片段，重組到pcDNA3.1 載體上，獲得突變型表達(dá)載體pcDNA3.1-TBX20（A63T），對(duì)突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、鑒定、測(cè)序，排除任何其他不必要的序列變異，確保為所需的突變序列。調(diào)取ANF基因啟動(dòng)子區(qū)域2600 bp 序列構(gòu)建至熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic 上獲得ANF-luc 報(bào)告載體。（2）將野生型pcDNA3.1-TBX20、突變型pcDNA3.1-TBX20（A63T）及陰性對(duì)照pcDNA3.1 分別轉(zhuǎn)染到3 組COS7 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供）中。同時(shí)每組細(xì)胞中均轉(zhuǎn)入ANF-luc 報(bào)告質(zhì)粒、表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)控報(bào)告質(zhì)粒TK-Rluc 及協(xié)同TBX20激活A(yù)NF的NKX2.5表達(dá)質(zhì)粒、GATA4表達(dá)質(zhì)粒。48 h 后收集細(xì)胞，使用Promega 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，E1910 試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因，海腎熒光素酶作為內(nèi)參基因減少內(nèi)在變化因素（如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等）對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，最后結(jié)果以兩者的熒光強(qiáng)度比值相對(duì)熒光值表示，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。相對(duì)熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0 軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)1 個(gè)新的TBX20 基因錯(cuò)義突變

病例組與對(duì)照組在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病例組先心病患兒的臨床特征見表1。通過(guò)對(duì)203 例無(wú)親緣關(guān)系的先心病患兒進(jìn)行TBX20基因序列分析，在1 例房間隔缺損（ASD）患兒中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的錯(cuò)義突變c.187G＞A（A63T），位于TBX20基因第2個(gè)外顯子，DNA 序列中第187 位鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?，?dǎo)致氨基酸序列中第63 位丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，而在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)該變異（圖1A）。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行查找發(fā)現(xiàn)TBX20的第63 位氨基酸（丙氨酸）在不同物種中高度保守（圖1B）。我們對(duì)檢測(cè)到錯(cuò)義突變患兒的父母、同胞妹妹的血樣也予以收集并提取DNA 進(jìn)行了突變檢測(cè)。其母親和同胞妹妹也攜帶同樣的突變。她們主訴沒有明確的先心病病史，但未曾做過(guò)超聲心動(dòng)圖檢查。當(dāng)追蹤超聲心動(dòng)圖檢查之后發(fā)現(xiàn)，患兒母親有一直徑7.0 mm 的ASD，其同胞妹妹有直徑4.5 mm 的卵圓孔未閉和1.9 mm 的動(dòng)脈導(dǎo)管未閉。該家庭中檢測(cè)到突變A63T 的3 人均患有ASD 或者卵圓孔未閉，提示該新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變A63T 很可能與先心病相關(guān)。新發(fā)現(xiàn)的TBX20基因突變位點(diǎn)A63T 已提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）并獲得序列號(hào)：EU636777。

圖1 TBX20 基因測(cè)序結(jié)果及氨基酸序列比對(duì)分析

2.2 同源建模顯示TBX20-A63T 導(dǎo)致TBX20 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變

針對(duì)上述家系中發(fā)現(xiàn)的TBX20錯(cuò)義突變A63T，運(yùn)用I-TASSER 同源建模服務(wù)器，以TBX3為模板對(duì)野生型及突變型TBX20建模，對(duì)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析顯示TBX20-A63T 導(dǎo)致TBX20蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。如圖2 所示，野生型TBX20第63位的丙氨酸Ala63 與第65 位的甘氨酸Gly65、第68位的甘氨酸Gly68 相鄰并形成氫鍵，丙氨酸突變成蘇氨酸之后，蘇氨酸Thr63 與周圍殘基之間的關(guān)系發(fā)生改變，第63 位的蘇氨酸Thr63 與第65 位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 間的氫鍵斷裂，與第62 位的天冬氨酸Asp62、第64 位的組氨酸His64形成了新的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。

圖2 同源建模顯示的TBX20 蛋白質(zhì)構(gòu)象

2.3 TBX20-A63T 對(duì)下游靶基因ANF 的激活作用增強(qiáng)

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)結(jié)果見表2，陰性對(duì)照、野生型、突變型中相對(duì)熒光值分別2.00±0.07、5.22±0.35 和6.37±0.50，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=121.40，P＜0.0001）。野生型、突變型的相對(duì)熒光值均高于陰性對(duì)照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.0001）。突變型的相對(duì)熒光值高于野生型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)A63T 對(duì)ANF 活性的影響

3 討論

先心病是最常見的人類出生缺陷和兒童非感染性疾病，是導(dǎo)致1 歲以下嬰兒死亡的主要原因之一[2-3]。先心病的發(fā)生與環(huán)境、遺傳等多因素相關(guān)，越來(lái)越多的研究認(rèn)為遺傳因素在先心病的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，但具體機(jī)制尚不明確[14-16]。

T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族成員在胚胎發(fā)育過(guò)程中各自發(fā)揮不同的作用，TBX20是T-box 基因家族的重要成員之一，屬于TBX1亞家族，對(duì)心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成和成熟心功能的維持具有重要作用[17]。TBX20位于第7 號(hào)染色體（7p14.2），有8 個(gè)外顯子，其289～888 核苷酸及相應(yīng)氨基酸編碼T-box DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過(guò)此功能結(jié)構(gòu)域與特異DNA 序列結(jié)合，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[17-18]。TBX20作為家族重要成員表達(dá)于心肌發(fā)育所需的多種細(xì)胞系[8]。斑馬魚TBX20基因突變可引起心臟祖細(xì)胞數(shù)量大大減少，形成一個(gè)小的、狹長(zhǎng)的無(wú)功能心臟。而TBX20過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心臟增大，心肌細(xì)胞明顯增多[3]。

此前有研究發(fā)現(xiàn)人類TBX20基因突變與多種先心病的發(fā)生相關(guān)，包括ASD、右心室雙出口、法洛四聯(lián)癥和室間隔缺損等[19-23]。Huang 等[24]在一個(gè)有先心病家族史患者的TBX20基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變K274X，它在編碼T-box DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)外顯子中引入了一個(gè)終止密碼子，這將產(chǎn)生一種新蛋白，該蛋白在T-box DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中被截?cái)?，缺乏C 端存在的轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制域。在COS7 細(xì)胞中的功能分析研究證明，該突變型TBX20蛋白與野生型蛋白相比對(duì)ANF的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著下降，甚至無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性。Posch 等[19]研究了170 例互不相關(guān)的ASD 患者TBX20的全部編碼序列，在1 例有家族史的患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的I121M 突變，在COS7細(xì)胞中進(jìn)行研究顯示，在鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4和同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5共存的情況下，該I121M 突變導(dǎo)致TBX20對(duì)ANF的轉(zhuǎn)錄激活作用顯著提高。這些發(fā)現(xiàn)提示TBX20基因突變可能是先心病的發(fā)病原因。

本研究通過(guò)對(duì)203 例先心病患兒進(jìn)行TBX20基因序列研究，在1 例ASD 患兒中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的錯(cuò)義突變c.187G＞A（A63T），該突變導(dǎo)致TBX20上第63 位的非極性、疏水性丙氨酸變?yōu)闃O性、親水性的蘇氨酸。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行查找顯示TBX20的第63 位氨基酸（丙氨酸）在不同物種中高度保守。保守性是指某一序列在進(jìn)化演變過(guò)程中在不同的物種中一直保留，這種序列一般都發(fā)揮著很重要的功能，往往有其不可代替性。我們對(duì)該患兒的父母、同胞妹妹進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其母親和同胞妹妹也攜帶同樣的突變，而且其母親患有ASD，其同胞妹妹患有卵圓孔未閉和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉。這一家系中3 位成員攜帶同樣突變A63T 又同時(shí)有ASD 或卵圓孔未閉的臨床表型特征，提示該錯(cuò)義突變A63T很可能與ASD 的發(fā)生相關(guān)。

基因錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致氨基酸和蛋白質(zhì)發(fā)生變化，我們進(jìn)而通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模對(duì)突變A63T進(jìn)一步行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析研究。以TBX3為模板對(duì)TBX20野生型及TBX20-A63T突變體進(jìn)行建模，發(fā)現(xiàn)野生型TBX20第63 位的丙氨酸Ala63 與第65位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 相鄰并形成氫鍵，丙氨酸突變成蘇氨酸之后，導(dǎo)致蘇氨酸與周圍殘基之間的關(guān)系發(fā)生變化，第63 位蘇氨酸Thr63 與第65 位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 間的氫鍵斷裂，與第62 位的天冬氨酸Asp62、第64 位的組氨酸His64 形成了新的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象與特定的生物學(xué)功能相對(duì)應(yīng)，結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。該突變影響了TBX20蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，很可能會(huì)影響其生物學(xué)功能，導(dǎo)致先心病的發(fā)生。

在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)突變A63T 進(jìn)行功能研究。在心臟發(fā)育過(guò)程中，TBX20與NKX2.5、GATA4等轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同激活下游的多個(gè)目標(biāo)基因，包括CX40、CX45、ANF[11-13]。ANF是心臟發(fā)育過(guò)程中一種極其敏感的重要標(biāo)志物，對(duì)房室的形成具有特異性[13]。TBX20識(shí)別并結(jié)合ANF啟動(dòng)子中的T-half 位點(diǎn)（與5-AGGTGTGA-3一致的DNA 序列），TBX20基因突變可能通過(guò)改變下游靶基因ANF啟動(dòng)子活性參與先心病的發(fā)病機(jī)制[13，25-27]。我們?cè)贑OS7 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染等量的突變型TBX20-A63T 表達(dá)質(zhì)粒、野生型TBX20表達(dá)質(zhì)粒以及協(xié)同作用基因GATA4、NKX2.5，然后用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)ANF啟動(dòng)子的活性。通過(guò)檢測(cè)TBX20、GATA4、NKX2.5協(xié)同調(diào)控過(guò)程中TBX20野生型與突變型對(duì)ANF啟動(dòng)子活性的影響來(lái)研究TBX20-A63T 的功能。研究發(fā)現(xiàn)突變型對(duì)ANF啟動(dòng)子的激活作用較野生型更強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此認(rèn)為突變A63T 有可能通過(guò)上調(diào)ANF的活性而參與先心病的發(fā)生。

綜上所述，本研究在1 例漢族先心病患兒中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的TBX20基因錯(cuò)義突變A63T，并在兩位同樣患有先心病的家庭成員中得到驗(yàn)證，進(jìn)而對(duì)該突變進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)同源建模分析及體外細(xì)胞功能研究。研究結(jié)果表明該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生改變，可能通過(guò)上調(diào)下游靶基因ANF啟動(dòng)子的活性而參與先心病的發(fā)病機(jī)制，拓寬了ASD 的基因突變譜，為先心病的發(fā)生機(jī)制提供了一點(diǎn)新思路，本課題組也將會(huì)在下一步的動(dòng)物模型中對(duì)其功能進(jìn)一步深入驗(yàn)證和探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突